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胶体金快速免疫诊断技术


免疫层析快速诊断技术

层析法技术优势:简单\现场\ 层析法技术优势:简单\现场\快速
1.打开包装取出试纸条 2.直接插入待测样品中 3. 目测读出结果(3-10分钟内)

与常规诊断方法相比
优点 快速:全部检测过程仅需 3-10分钟。 简便:不需其它任何仪器设备,操作也极其简单,无需专 业人员,携带方便,可随时

随地进行。 廉价:单个测试条成本极低 可单份检测:对标本既能成批检测,又可单份检测,可立 刻拿到结果,不必等待。 稳定性好:金标试剂稳定,可长期保存。 检测标本种类多:既可用于查血,又可用于检尿或唾液, 因而适合各种检查 缺点 定量问题 灵敏度问题

技术应用
类别 人类医学 应用领域 各级医院 ,血站 ,CDC, 防疫 站,诊断中心;家庭自检; 商检系统;边检口岸;公 安系统. 检测的物质 传染病(乙肝五项,HIV, SARS等) 标志物(AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等) 女性妊娠(hCG(早孕),LH,FSH) 毒品(吗啡,K粉,摇头丸,冰毒) 农牧业 畜牧兽医站, 商检系统,边 检口岸,农牧类院系和研究 所 环保监测部门,研究机构 食品安全检测中心,各监管 部门 传染病(禽流感,兽瘟疫等)

环境 食品安全

有害物质超标 农兽药残留(磺胺类、瘦肉精等),大肠杆菌,黄曲霉素

试纸条组成结构
控制线( 线 控制线(C线) 胶体金垫 样品垫 吸水滤纸

NC膜(硝酸纤维素膜) 膜 硝酸纤维素膜) PVC底板 底板 层析方向 测试线 (T线) 线

有4个组分:⑴、吸水纸(样品垫)。⑵、玻璃纤维膜(胶体金垫)。膜上吸附 个组分: 吸水纸(样品垫)。⑵ 玻璃纤维膜(胶体金垫)。膜上吸附 )。 )。 着干燥的金标抗体(流动带)。 )。⑶ 硝酸纤维素膜, 着干燥的金标抗体(流动带)。⑶、硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条 带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带)。 )。⑷ 吸水纸。 带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带)。⑷、吸水纸。以上各组 份首尾互相衔接。 份首尾互相衔接。

基本原理是将已知的特异性抗原或抗体固定于硝酸纤维素 膜上某一区带作为检测带,在样品区滴加样品后,借助毛 细作用,样品泳动至玻璃纤维膜,金标复合物溶解,并与 样品进行抗原抗体反应,形成复合物,继续泳动至硝酸纤 维素膜的检测区,带有金标记的复合物被检测区抗原或抗 体捕获,呈现红色条带。如样品中没有待测抗原或抗体, 则不发生结合,即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一 般再固定上针对金标结合物相应的抗原或抗体作为质控带, 无论样品中有无待测物,质控线都应显示,如无,则检测 失败。整个过程一般在15分钟内完成,操作简单、快速, 且不需任何仪器。

免疫层析法检测原理分类介绍
胶体金免疫层析法检测流脑抗体(间接法) 胶体金免疫层析法检测流脑抗体(间接法) 胶体金标记的兔抗人IgG, 胶体金标记的兔抗人IgG,样品中的流脑抗体与胶体金标记的抗人 IgG IgG结合 沿硝酸纤维素膜移动,在包被有流脑抗原结合, 结合, IgG结合,沿硝酸纤维素膜移动,在包被有流脑抗原结合,出现红 色反应线。 色反应线。

免疫层析法检测原理分类介绍 (双抗体夹心)
(以HCG检测为例)

HCG- 亚基抗体Y2,羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上,金标HCGHCG-β亚基抗体Y2,羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上,金标HCG-α亚 Y2 HCG 基单抗Y1固定于玻璃纤维素膜上。 Y1固定于玻璃纤维素膜上 基单抗Y1固定于玻璃纤维素膜上。

免疫层析法检测原理分类介绍 (竞争反应) (以吗啡检测为例)

吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。 吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿 液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体,最小检出量300ng/ml 300ng/ml。 液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体,最小检出量300ng/ml。 结果判定: 结果判定: 阳性( ):吗啡300ng/ml以上 质控区出现一条紫红色条带, 吗啡300ng/ml以上, 阳性(+):吗啡300ng/ml以上,质控区出现一条紫红色条带,测试区内不出现紫红色 条带。吗啡浓度高于300ng/ml 300ng/ml时 胶体金抗体与吗啡全部结合, 条带。吗啡浓度高于300ng/ml时,胶体金抗体与吗啡全部结合,从而不与吗啡偶联物结 合而不出现紫红色条带。阴性( ):吗啡在300ng/ml以下 出现两条紫红色条带, 吗啡在300ng/ml以下。 合而不出现紫红色条带。阴性(-):吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带,一 条在测试区内,另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml 300ng/ml时 条在测试区内,另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时,胶体金抗体不能与吗啡 全部结合。这样,胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合, 全部结合。这样,胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合,测试区 内会出现一条紫红色条带。无效:质控区未出现紫红色条带, 内会出现一条紫红色条带。无效:质控区未出现紫红色条带,表明不正确的操作过程或 试剂盒已变质损坏。 试剂盒已变质损坏。

抗原抗体生物原料
抗体 Antibody
来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐

抗原 Antigen
全病毒抗原 重组抗原

胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、 抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下,聚合成为特定大小 的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状 态,称为胶体金。根据胶体金的一些物理性状,如 高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结 合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应 用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

胶体金的制备
容器硅化处理:玻璃表面少量的污染会干扰胶体金 颗粒的生成,一切玻璃容器应绝对清洁,用前经过 酸洗、硅化。将玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷 的氯仿溶液中1分钟,室温干燥后蒸馏水冲洗,再 干燥备用 。

胶体金的制备
枸橼酸三钠还原法 15nm、18nm~30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备:取 15nm、18nm~30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备:取 0.01% 0.01%HAuCl4水溶液100ml,加热煮沸。根据需要迅速加入1 水溶液100ml,加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml,继续煮沸约 %枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml,继续煮沸约 5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、 5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、 18~20nm、41nm和50nm 18~20nm、41nm和 颜色与颗粒的关系.最佳标记颗粒大小40nm.

1%柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶胶颜色 吸收峰(nm) 径粒(nm) 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙 220 240 535 525 522 518 147 97.5 71.5 40 24.5 15

胶体金的鉴定
1. 肉眼观察:在日光下仔细观察胶体金颜色,可以大致估计 金颗粒大小。同时良好的胶体金应该是清澈透明的,若浑 浊或有漂浮物提示有较多的凝集颗粒。

2. 分光光度计扫描吸收峰时光波长来估计金颗粒的大小。

3. 电镜可见精确测定金颗粒的大小。

免疫胶体金的制备
胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢 胶体金 固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。 蛋白质的预处理: 蛋白质的预处理 1.蛋白质应先对低离子强度的水透析,去除盐类成份。盐类成份能影 响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,应避免磷酸根离子和 硼酸根离子的存在。 2.用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或略 偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于 蛋白质的等电点时,则会聚集而失去结合能力。

蛋白质最适用量测定: 蛋白质最适用量测定

将待标记的蛋白质(鼠抗人IgG)储存液作系列稀释后, 分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质 的对照管,5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置 2小时。

1
胶体金(ml) 胶体金 蛋白质(ug) 蛋白质 10%NaCl 1 0 0.1

2
1 10 0.1

3
1 15 0.1

4
1 20 0.1

5
1 25 0.1

6
1 30 0.1

7
1 35 0.1

? 结果判断: 对照管或加入蛋白量不足,胶体金出现由红变蓝的凝聚现
象;加入蛋白质量达到或超过稳定量,则胶体金保持红色不变

不稳定的金溶胶将发生聚沉,对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的 量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入 蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶 体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量, 在实际工作中,可适当增加10%,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表 面的吸附量最大。

胶体金与蛋白质偶联后,加入稳定剂,以避免产生凝集。一般选用 PEG(分子量为20000)和牛血清白蛋白作稳定剂。加入的量:5% BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。

①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。 ②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2~3分钟。 ③加入5ml1%PEG20000溶液。 ④于10000~100000g离心30~60分钟小心吸去上清液(切忌倾倒)。 ⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2~0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中,离 心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以 A540nm=1.5左右为宜,防 腐置4℃保存。 ⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离 纯化,以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱 液pH为8.2。 以上操作中应注意,一切溶液中不应含杂质微粒,可用高速离心 或微孔滤膜预处理。

胶体金蛋白结合物的质量鉴定
平均直径的测量:用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂, 平均直径的测量 自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算 100个金颗粒的平均直径。 OD520nm值测定 值测定:用PBS液(含1%BSA)将胶体金蛋白试剂作1:20稀 值测定 释,OD520=0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2~0.4。 金标记蛋白的特异性与敏感性测定:采用微孔滤膜免疫金银染色法。 金标记蛋白的特异性与敏感性测定 将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤 膜),用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显 影来检测相应的抗原或抗体,对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴 定。

胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备
胶体金标记的鼠抗人IgG放入玻璃纤维素膜浸泡10分钟,取 出至37度烤箱中烤干,热合封口,置4摄氏度冰箱备用。(实 验阶段) 用喷点仪将胶体金标记的鼠抗人IgG喷在玻璃纤维素膜上,真 空干燥2 h 。 (生产阶段)

选择NC膜 选择 膜
NC膜的选择 爬速(???秒/4cm)对灵敏度的影响

通过同一T线喷点位置时, 金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜. 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短, 读数快, 那么灵敏度也就越低. 反之, 反应时间长, 读数慢, 也就灵敏度高。 同 时还有一个问题是, 反应时间越长, 发生非特异性结合的可能性就越 大, 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度.。所以这 里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡.

不同膜厂家的产品 (Whatman,Millipore,Sartorius) 大致为: 135s和180s

抗原、抗体包被固相 膜的制备 抗原、抗体包被固相NC膜的制备
包被流脑抗原浓度筛选(T线) 抗原用PBS 梯度稀释, 释 后用1?l移液器点在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 备用 。

包被抗鼠IgG浓度筛选(C线) 抗鼠IgG抗体用PBS 梯度 稀释, 释后用1?l移液器点在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 备用。

溶液喷点
(喷点演示:BIODOT XYZ系列喷点仪器)

C\T线溶液前处理: 1.过滤,0.22um孔径滤膜 2.离心1万转10分钟

C\T线喷点工艺与接触划点工艺比较 因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划 管会在其表面留下印痕.划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导 致假阳性。

干燥

干燥方法的比较
37度干燥4h:颗粒感较强,易中间白,周边深; 低温真空干燥3h:颜色均一,只是两端稍浅,有一定的柔性。

试纸条组装
在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板,在 PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜 上缘粘贴吸水滤纸,硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫,胶 体金垫下缘粘贴样品垫,完成后用裁切机将贴好的试纸板 切成4 mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中,完 成产品的组装。

切条\包装 切条 包装

切条
(演示:BIODOT CM4000切条机)

包装

质量控制
1.特异性 用30份阴性参考血清进行检测,结果不得出现 假阳性; 2.敏感性 用30份阳性(包括强阳性、中阳性、弱阳性) 参考血清进行检测,假阴性率不得超过3份,并用已知抗体 效价血清系列稀释测试其最小检出量。 3.精密度 观察批间、批内差异,CV(%)应不高于10%。 4.稳定性检测 37℃放置3天,鉴定指标应达到以上标准。

质量评价
灵 敏 度=A/A+C×100% 特 异 度=D/B+D×100% 假阳性率=B /B+D×100% 假阴性率=C /A+C×100% C /A+C 100% 试验 阳性 阴性 总数 真阳性 A C A+C 真阴性 B D B+D 合计 A+B C+D A+B+C+D


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