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真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定


广西农业科学 2010, (7 : 41 ) 675-678 Guangxi Agricultural Sciences

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真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物 病原真菌的拮抗活性测定

( 广西大学农学院, 南宁 1

茜1,2,胡春锦2,3,黄思良4 *,柯仿钢1,黎起秦1

/>530007; 3 广西作物遗传改良生物技术重点开 473061 ) 530007; 4 南阳师范学院生命科学与技术学院, 河南南阳

530005;2 广西农业科学院微生物研究所, 南宁

放实验室, 南宁

摘要: 针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害, 对柑橘、 香蕉、 甘蔗、 辣椒、 药用植物等作物根际土壤进行拮 抗菌筛选试验。结果从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株, 其中有拮抗作用的34株, 平皿拮抗效果较好的16 株; 再经复筛, 得到一株对柑橘炭疽菌有较好抑制效果的拮抗菌Bs55; 对峙培养试验表明, Bs55菌株对12种常见病原 真菌具有较强的抗菌活性, 抑菌率最高达87.7%。拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、 能大量繁殖、 抑菌谱广等特点, 是具有 较好利用前景的生物防治材料。 关键词: Bs55菌株;枯草芽孢杆菌;病原真菌;拮抗活性 中图分类号: +.1 S476 文献标识码: A 文章编号: 1002-8161 (2010 07-0675-04 )

Screening of antagonistic bacteria against fungal diseases and determination of their antagonistic activity to various plant pathogenic fungi
WANG Qian1,2,HU Chun-jin2,3,HUANG Si-liang4 *,KE Fang-gang1,LI Qi-qin1
(1 Agricultural College, Guangxi University, Nanning 530005, China; 2 Microbiology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China; 3 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab, Nanning 530007, China; 4 College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang, Henan 473061, China ) Abstract: In order to find out the antagonistic bacterial agents against 12 kinds of crop fungal diseases occurring commonly in Guangxi, screening experiments were carried out using bacteria from rhizospheric soil of citrus, banana, sugarcane, pepper and some medicinal plants. The studies resulted in isolation of 386 strains from rhizospheric soil of different crops. Among these, 34 strains showed antagonistic activity and 16 strains showed good antagonistic effects on plate. After secondary screening, antagonistic bacterial Bs55 was screened out with strong inhibitory effect on citrus anthracnose. Confront culture tests showed that Bs55 strain had strong antifungal activity to 12 kinds of common pathogenic fungis, the highest inhibiting rate reached 87.7%. It has the characteristics of strong antagonism and large scale propagation, and was approved to be a promising biocontrol agent with a broad-spectrum biocontrol potential. Keywords: Bs55 strain; Bacillus subtilis; pathogenic fungi; antifungal activity

真菌病害是阻碍植物生长、影响作物产量的主 要病害 ,给农业生产带来了严重危害 。 土壤是各
[1]

本研究针对广西境内 常见 多 发 的 12 种 植 物 真 菌病 害,从不同作物根际土壤中筛选拮 抗 菌 ,为 开发 广 西微生物资源,筛选与环境相容性好的微生物农药 奠定基础。

种微生物良好的栖息场所,生存着许多具有相互拮 抗作用的微生物。 在生防菌株的筛选上,考虑到植 物与微生物之间的相互作用关系,人们把重点放在 从植物根表面或根际土壤中筛选,这样筛选出的微 生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力 [2]。

1
1. 1

材料与方法
供试病原菌和培养基

收稿日期: 2010-04-19 基金项目: 广西农业科学院科技发展基金重点项目 [2007007 ) (Z ] 作者简介: (1984- , 湖北武汉人, 汪茜 ) 女, 硕士研究生, 研究方向为真菌学及植物真菌性病害防治。*为通信作者, E-mail: silianghuang@ 126.com。

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广西农业科学

供 试 病 原 菌 有 柑 橘 炭 疽 病 菌 [Colletotrichum

的平板为对照,待对照长满皿时测量柑橘炭疽病菌 的菌落生长直径,每处理重复 3次。 按下式计算菌落 生长抑制率: 菌落生长抑制率 = ( 对照菌落净生长距离 - 处理
菌落 净生 长 距 离 )/ 对 照 菌 落 净 生 长 距 离 ×

gloeosporioides (Penz.) Sacc.]、水 稻 纹 枯 病 菌 (Rhizoctonia solani Kühn)、 玉 米 大 斑 病 菌 [Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard & Suggs ]、 玉 米 小 斑 病 菌 [ Cochliobolus heterostrophus ( Dreschl. ) Dreschl. ]、 茉莉白绢病菌(Sclerotium rolfsii Sacc. )、辣椒炭疽病 菌 [Colletotrichum gloeosporioides (Penz. ) Sacc. ]、香 蕉炭疽病菌[Colletotrichum musae (Berk. & Curt) Arx]、 冬 瓜 疫 霉 (Phytophthora drechsleri Tucker )、 龙 眼 链 格 孢 黑 斑 病 菌 [Alternaria alternata (Fr. ) Keissler ]、 香蕉大灰斑病菌[Curvularia lunata (Wakker ) Boedijin]、 香 蕉 叶 缘 枯 斑 病 菌 (Alternaria musae Bour. et Bat)、 杨 桃 炭 疽 病 菌 [Colletotrichum gloeosporioides (Penz. ) Sacc. ]等 12 种,均由广西农业科学院微生物 研究所保存、提供。 菌株在 PDA 培养基上 28℃ 活化
培养后供试。 拮抗菌分离培养基采用 NA 培养基 [3](牛肉浸膏

100% 1. 3. 3
拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定 采用 平 板 对 峙 法 , 将 菌 株 Bs55 在 PDA 培 养 基 平 板 上 划 线 ,距 划 线 处 4 cm 接 种 病 原 菌 菌 饼 ( 直 径 5 mm ),

28℃ 培 养 ,以仅 接 种 病 原菌 的 平 板为 对 照 ,待 对 照
长满皿后测量病原菌的生长直径,计算抑制率。 每 处理重复 3次。

2 结果与分析
2. 1 拮抗菌的分离筛选
从 不 同 作 物 根 际 土 壤 中 共 分 离 得 到 386 株 菌 株,其中有拮抗作用的 34 株,平皿 拮 抗 效 果较 好 的 16 株;再经过复筛,得到一株拮抗 活 性 最 强的 细 菌 Bs55。 Bs55 分离 自 广 西 药用 植 物 园 鸡 血 藤 根 际 土 壤,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 以柑 橘 炭 疽病 菌 为 单 一靶 标 菌 与所 有 分 离 菌 株进行对峙培养,结果显示,不同 类群 的 微 生 物出 现拮抗菌株的频率各有不同,其中 25 株放线菌中有 4 株对柑橘炭疽病菌具拮抗作用, 拮抗菌株检出率 为 16.0 % (表 1); 不同类别作物根际分离物中拮抗 菌的检出率也不同,其中甘蔗根际拮抗菌株的检出 率最高,为 12.5% ,其次为柑橘 9.7% ,玉米根际 的 拮 抗菌检出率最低,为 3.1% (表2)。
表 1 不同类群微生物中拮抗菌株的检出率 Table 1 Detection rate of antagonistic strains in different groups of microorganism
微生物类群 Microbe group 细菌 Bacteria 放线菌 Actinomycete 真菌 Fungi 测试菌株数 拮抗菌株数 比率( % ) Number of test Number of Percentage strains antagonistic strains 356 25 5 30 4 0 8.4 16.0 0

10 g、蛋白胨 5 g、葡萄糖 20 g、琼脂 15 g、水 1000 mL, pH 7.0~7.2 ), 拮 抗 菌 筛 选 培 养 基 采 用 PDA 培 养 基 (马铃薯200 g、蔗糖 20 g、琼脂 15 g、水1000 mL)。 1. 2 拮抗菌的分离
从广西农业科学院、南宁市金陵镇、金光农场、 广西大学农场和广西药用植物园等地采集柑橘、香 蕉 、甘 蔗 、辣 椒 、药 用 植 物 等 不 同 种 类 作 物 根 际 土 壤,分别称取土壤 10 g,放入 90 mL 有玻璃珠的无菌 水三角瓶中,200 rpm摇匀 20 min ,制成土壤悬浮液, 梯度稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 用接种环从 10 -3、

10 -4 悬浮液中各沾取 1 环,分 别 在 平 板 上 划 线 [4],于 28℃ 下 倒 置 培 养 ,48 h 后 观 察 ,挑 取 不 同 形 态 单 菌
落,纯化后保存,待测。

1. 3 拮抗菌的筛选 1. 3. 1 初筛 以柑橘炭疽病菌为测试菌进行拮抗 菌初筛。将直径 5 mm的病菌原菌块置于 PDA 平板中 央,在其周围4 个等距离位置上分别点接 4 种不同的
细菌,每处理 3 次重复。 培养 3~5 d后,观察不同细菌 是否对致病菌生长有抑制作用及抑菌带的大小(取

3 次重复的平均值),并按抑菌圈半径的大小将拮抗 菌分为强、中、弱三类,抑菌圈半径 >10 mm 为强,5~ 10 mm为中,<5 mm为弱。 1. 3. 2 复 筛 将 有 抑 菌 作 用 的 菌 株 作 进 一 步 筛 选。 采用平板对峙法 [5],在培养皿中央接种培养 7 d 的 柑 橘 炭 疽 病 菌 菌 饼 ( 直 径 5 mm ), 离 该 菌 饼 约 3 cm 处,用接种环沾取培养 48 h 的 拮 抗 菌 ,在平 板 对 称两侧各划一条细线,28℃ 培养, 以只接种病原菌

表 2 不同类别作物根际拮抗菌株出现频率 Table 2 Occurrence frequency of antagonistic strains in crop rhizosphere of different crops
作物类别 Crop category 柑橘 Citrus 香蕉 Banana 甘蔗 Sugarcane 辣椒 pepper 玉米 Maize 药用植物 Medicinal plants 分离菌株数 拮抗菌株数 拮抗菌株出现率 ) (% Number of Number of Occurrence frequency isolated strain antagonistic strain of antagonistic strains 62 6 9.7 48 4 8.3 64 8 12.5 50 3 6.0 32 1 3.1 130 12 9.2

汪茜等:真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定

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2. 2

拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定 采用 平 板 对峙 法 检 测 Bs55 对 12 种 病 原 真 菌 的

抑制效果。 结果显示(表 3),Bs55菌株对供试的 12种 病原菌表现出较高的抑菌活性, 抑菌 率 在 59.9%~

87.7%之间, 表明生防菌 Bs55 对不同病原真菌的抑 菌力虽然存在明显差异,但有较广的抑菌谱。 Bs55 菌株对部分病原真菌的抑菌效果见图 1。

A

B

C
A: 柑橘炭疽病菌; 玉米小斑病菌; 玉米大斑病菌; 香蕉大灰斑病菌 B: C: D: A: C. Gloeosporioides; B: C. heterostrophus; C: E. turcicum; D: C. Lunata Fig.1 图 1 Bs55 菌株对部分病原真菌的抑制作用 Inhibitory effects of Bs55 strain against some pathogenic fungi

D

表 3 Bs55 菌株对 12 种植物病原真菌的抑菌率 Table 3 Inhibitory rates of the strain Bs55 against 12 kinds of plant pathogens
病原菌 Pathogen 柑橘炭疽病菌 C. gloeosporioides 水稻纹枯病菌 R. solani 玉米大斑病菌 E. turcicum 玉米小斑病菌 C. heterostrophus 辣椒炭疽病菌 C. gloeosporioides 茉莉白绢病菌 S. rolfsii 香蕉炭疽病菌 C. musae 杨桃炭疽病菌 C. gloeosporioides 香蕉大灰斑病菌 C. lunata 冬瓜疫霉 P. melonis 香蕉叶缘枯斑病菌 A. musae 龙眼链格孢黑斑病菌 A. alternate 抑菌率(%) 差异显著性 Significant difference Inhibitory rate 5% 1% 87.7 87.1 77.4 61.3 86.3 86.6 86.3 64.2 59.9 85.9 79.5 74.9 a a c f a a a e f a b d A A B E A A A D E A B C

3

结论与讨论
微生物在自然界的分布非常广泛,地球上除了

火山区域外,无论是土壤、空气、水、枯枝烂叶、植物 病 株 、腐 烂 果 实 等 都 含 有 众 多 微 生 物 [7~9]。 Filonow 等 [10]不从苹果上分离拮抗菌,而以从其他生境如空 气、土壤、海水、叶片、大蒜等上分离 到 的 28 种酵 母 为材料,筛选到能有效防治苹果灰霉病的土生隐球 酵母(Cryptococcus humicola NRRL Y1266 )、花状线 黑粉菌(Filobasidium floriforme NRRL Y7454 )、红冬 孢 酵 母 (Rhodosporidium toruloides NRRL Y 1091 )、 掷 孢 酵 母 (Sporobolomyces roseus FS-43-238 ) 等 几 种酵母。 可见,拮抗菌的筛选不是教条的,只要有抑 菌效果且无害,都可以利用。 枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在 [11~13],对人 畜无毒无害,不污染环境,能产生多种抗菌素和酶, 具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力,克服了传统 化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点, 具有选择性强、安全、原料简单等优点 [14~18]。 美国迄 今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局 (EPA )商品化或有限商品化生产应用许可,它们分 别 是 GBO3 、MBI600 、QST713 和 解 淀 粉 枯 草 芽 孢 杆

注: 抑菌率为 3 次重复的平均值; 小写字母分别表示 1%和 5%水 大、 平上的差异显著性。 Note:Values of inhibitory rates are average;different capital and small alphabets in the same column represent significant difference at 0.01 and 0.05 level,respectively.

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广西农业科学

菌变种(B. subtilis var. amyloliquefaciens FZB24),其 中生物杀菌剂 QST713 为 AgraQuest 公司产品, 商品 名为 Serenade ,主要用于防治水果采收前后病害 [19]。 我 国林开春等
[20]

璐, 陈新云, 范源洪. 麻疯树根部内生真菌分离及鉴定 . 2009, (1 : 22 ) 95-98. [J] 西南农业学报, [9] 金义兰, 桑维钧, 张秀伟. 贵州高海拔地区土壤真菌种 类初步鉴定 . 贵州农业科学,2009, (5 : [J] 37 ) 88-90. [10] Filonow A B,Vishniac H S,Anderson J A,Janisiewicz W J. Biological control of Botrytis Ctnerea in apple by yeasts from various habitats and their putative mecha- nisms of antagonism . Biocontrol,1996, 212-220. [J] 7: [11] Obagwu J,Korsten L. Integrated control of citrus green and blue molds using Bacillus subtilis in combination [ . with sodium bicarbonate or hot water J] Postharvest Bi- ology and Technology,2003, 187-194. 28: [12] Douglas P,Collins and Barry J,Jacobsen. Optimizing a Bacillus subtilis isolate for biological control of sugar beet cercospora leaf spot J] Biological Control,2003, [ . 26 ) 153-161. (2 : [13] Chitarra G S,Breeuwer P,Nout M J R,Aelst A C, Rombouts F M,Abee T. An antifungal compound pro- duced by Bacillus subtilis YM 10-20 inhibits germina- tion of Penicillium roqueforti conidiospores J] Journal of [ . Applied Microbiology,2003, 159-166. 94: [14] 黄健, 曾顺德, 张迎君. 果蔬采后病害生物防治研究进 展 . 西南园艺,2005, (5 : [J] 33 ) 23-25. [15] 赵达, 傅俊范, 裘季燕, 刘伟成. 枯草芽孢杆菌在植病 生防中的作用机制与应用 . 辽宁农业科学, (1 : [J] 2007 ) 46-48. [16] 陈中义, 张杰, 黄日方. 植物病害生防芽孢杆菌抗菌机 33 ) 制与遗传改良研究 . 植物病理学报,2003, (2 : [J] 97-103. [17] 刘雪. 枯草芽孢杆菌代谢物质的研究进展及其在植病 2006 ) 179-184. 生防中的应用 . 中国生物防治, (22 : [J] [18] 王星云, 宋卡魏, 张荣意. 枯草芽孢杆菌菌剂的开发应 用 . 广西热带农业,2007 ) 32-35. [J] (2 : [19] Timothy C,Paulitz. Biological control in greenhouse sys- [ . 39: tems J] Annual Review of Phytopathology,2001, 103-133. [20] 林开春, 徐雪莲, 代鹏, 冯斌, 张用梅. 一种含有枯草芽 1853489 P] 2007-11-28. [ . 孢杆菌的防腐保鲜剂: 中国, [21] 杨佐忠, 叶建仁. 枯草芽孢杆菌 PRS5 菌剂控制水果贮 藏期病害的研究 [J] 南京林业大学学报 . (自然科学 版 ,2006, (1 : ) 30 ) 89-92.

公布的含有枯草芽孢杆菌 CCTC

CM204085 的防腐保鲜剂(公开号:1853489 )在果实
采后防腐保鲜方面的应用效果较好。 杨佐忠等 [21]利 用枯草芽孢杆菌 PRS5 处 理 采后 的 苹 果和 脐 橙 ,也 达到了较好的防腐保鲜效果。 本研究从所采集土样中分离纯化出的 386 株菌 株中,通过多步筛选,得到对 12 种 病 原 真菌 抑 制 效 果最强的枯草芽孢杆菌Bs55作为目标拮抗菌。 Bs55 对12种病原真菌均表现出显著的抑制作用,抑菌率 均在 59.9% 以上,最高达 87.7%,具有广谱抑菌活性, 但对病原真菌的抑制力各有侧重。 目前有很多关于 利用生防细菌防治植物真菌病害的报道,但从整体 上看主要存在防治谱窄的问题 [2]。 另外,生防菌发 挥生防作用还涉及其在不同土壤环境中的定殖。 本 研究从广西红壤土类型、气候条 件、强 紫 外 线 条件 下筛选出的拮抗菌 Bs55 具有拮抗作用强、能大量繁 殖等特点,其菌株本身具有广谱生 防 潜 力 ,是 有 较 好利用前景的生物防治材料。 因此,生防菌 Bs55 具 有很好的工业开发前景和应用价值,有必要对其菌 株本身及其抑菌机理进行深入研究。
参考文献: [1] 易自力, 周朴华, 朱雅安. 植物抗真菌病害基因工程研 究进展 . 作物研究,2001 ) 81-84. [J] (3 : [2] 王亚丽. 广谱生防细菌的筛选及其抗菌物质的分离 [D] . 兰州: 兰州大学,2006: 13-21. [3] 方中达. 植病研究方法 [M] 北京:高等教育出版社, . 1998: 66-68. [4] 谭小艳, 黄思良, 任建国, 晏卫红, 岑贞陆. 柑橘溃疡病 内生拮抗细菌 Bc51 的研究 . 植物病理学报,2007, [J] 37 ) 9-17. (1 : [5] 谭小艳. 柑桔溃疡病拮抗细菌的研究 [D] 南宁: . 广西大 学,2005. [7] 付岗, 林善海, 黄思良, 周双全, 汪茜, 岑贞陆. 广西香蕉 主要叶斑病菌拮抗微生物的分离筛选 . 西南农业学 [J] 报,2007, (3 : 20 ) 421-424. [8] 袁理春, 赵琪, 张克华, 杨顺林, 瞿文林, 张明忠, 金杰, 何

(责任编辑

麻小燕 )


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