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地衣芽孢杆菌营养要求的研究


第 17 卷 第 4 期 2000 年 11 月

河 北 省 科 学 院 学 报 Jour nal of the Hebei Academy o f Sciences

V ol. 17 No. 4 N ov. 2000

文章编号: 1001 9383( 2000) 04 0224 04

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地衣芽孢杆菌营养要求的研究
胡尚勤, 刘天贵
( 重庆师范学院生物系, 重庆 400047)

摘要

本文 报道了地 衣芽孢杆菌 的营养要 求, 结 果表明, 以葡萄糖 为碳源, 多种氨基 酸为氮源,
7

地衣芽孢杆菌的最佳 C/ N 为 4~ 4. 5!1。满足该菌对维生素 H 和必须氨基酸的需要以及主要 无机 盐的需要时, 其菌数最高为( 3. 55~ 6. 7) ? 10 / ml, 可使菌数是对照的 2. 1~ 3. 5 倍。 关键词 地衣芽孢杆菌, 营养要求 Q935 文献标识码 A 中图分类号

The study of the nutrition Requirement of Bacillus lichenif ormis
HU Shang qin, L IU T ian gui
( D ep t of Biology , Chong qi ng Teachers College , Chongqi ng 400047 Chi na)

Abstract

Nut rition requirement of Bacill us li chenif orm is is report ed. T he result s demonstrate

that opt imum C/ N is 4~ 4. 5!1, w hen glucose is used as carbon source and am ino acids are used as nitrogen source. If the need of the bact eria, in both variet y and quant it y, f or vit amins H and neces sary amino acids is met, the number of the bact eria can be increased t o 3. 55~ 6. 7 ? 107 / ml and is 2. 1~ 3. 5 t imes as many as that of the cont rast . Key words Bacil lus li chenif orm is, Nut rition requirement 地衣芽孢杆菌是我国 20 世纪 90 年代从正常待产妇阴道拭子分离来出一株用于生产# 整 肠生?微生态制剂的无毒菌株。据国内外资料检索, 尚无该菌营养要求的研究, 目前对该菌的 一些初步研究仅限于临床应用%1& 。本研究旨在对该菌的最佳 C/ N、 矿质元素以及生长因子的 种类和数量需要进行系统的基础研究。以弄清该菌的最佳营养要求, 为厂家对该菌的应用生 产提供了可靠的科学依据。

1
1. 1

材料和方法
菌种和培养基 地衣芽孢杆菌( Baci ll us li chenif orm is) 由重庆师范学院应用微生物研究室提供。
%2&

1. 1. 1 菌种

1. 1. 2 培养基和药品 ? 牛肉膏, 蛋白胨培养基 ; ( 合成培养基组成: 分别以 2. 12g 葡萄 糖, 乳糖 1. 06g, 蔗糖 1. 06g 为碳源, 氨基酸为氮源( L 脯氨酸 0. 099mg , L 谷氨酸 0. 1mg, DL 天冬酰胺 0. 107mg , 赖氨酸 0. 107mg, 精氨酸、 丝氨酸、 苯丙氨酸、 组氨酸、 蛋氨酸各 0. 1m g, 亮 氨酸 0. 091mg , 天门冬氨酸 0. 104mg, 苏氨酸 0. 099mg 等各种氨基酸) 并加入维生素 B 1 , B 2 , B 3 , B5 , B 6 , B11 和矿物质 M n2+ , Mg 2+ , Cu2+ , Na1+ , K 1+ , Ca2+ , 各 0. 2mg, 水 100ml。 1. 2
u

方法

收稿日期: 2000 07 14

第4期

胡尚勤等: 地衣芽孢杆菌营养要求的研究

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1. 2. 1 菌量测定

在每批组培养过程中和培养结束时, 定时取样用 10 倍稀释法稀释后, 准确

取样培养, 菌落形成后, 用光电自动菌落计数器法计数活菌数%3& 。 1. 2. 2 代谢产物的测定 由于乳酸和丁二醇是该菌的主要代谢产物, 所以根据产物与菌量的 关系亦可判断 C/ N 是否适合。因此, 用对羟基联苯 721 分光光度计法测定产物乳酸( L a) 量%4& 。

2
2. 1

结果与讨论
地衣芽孢杆菌生长最适 C/ N 的研究

采用合成培养基( 配方 2) 先选出最适碳源葡萄糖后, 以葡萄糖为碳源进行试验。根据碳 源和氮源的比例要求, 精确计算和准确称量, 配成葡萄糖为碳源, 甘氨酸为氮源, 其 C/ N 为 2. 0~ 6. 5!1, C 的间隔为 0. 5, K + 、 2+ 、 g 2+ 、 2+ 、 1+ 、 2+ 、 1 、 2 、 3 、 5 、 6 、 Ca M Fe Na Mn VB VB VB VB VB VB 11 各 2mg / L。维生素和氨基酸分别用过滤除菌后加入用 121 ) 灭菌 30min 的无机盐溶液 中, 分别配成液体培养基。在各组液体培养基中每 100ml 中分别接种 3. 8 ? 107 个地衣芽孢杆 菌( 蛋白胨培养基上活化培养 18h) 。然后 36~ 37 ) 摇床培养 24h( 摇床转速为 120 转/ 分) , 根 据测定的菌数量找出最佳 C/ N。结果见表 1。
表1 C/ N 2. 0!1 2. 5!1 3. 0!1 3. 5!1 4. 0!1 活菌数 ( ? 10 个/ ml)
7

不同 C/ N 对地衣芽孢杆菌增殖的影响 La ( g/ ml) 1. 23 1. 25 3. 85 3. 79 1. 12 C/ N 4. 5!1 5. 0!1 5. 5!1 6. 0!1 6. 5!1 活菌数 ( ? 10 个/ ml)
7

La ( g / ml) 1. 15 1. 19 1. 31 1. 27 1. 29

2. 1 2. 5 3. 4 3. 4 6. 7

4. 8 3. 3 3. 2 3. 0 2. 9

注: 以生产上常用配方 C/ N 5!1 为对照。

从表 1 可见, 地衣芽孢杆菌以葡萄糖为碳源, 单一氨基酸为氮源时, 最适 C/ N 为 4!1, 此时, 菌数最高, 为 6. 7 ? 10 / ml, 是对照的 2. 1 倍。其次是 4. 5!1 为好, 菌数为 4. 8 ? 10 / ml, 是对照的 1. 5 倍。虽然 C/ N 在 4~ 5!1 均适合于该菌生长, 尤其是 5!1 时, 乳酸量也较高, 但# 整肠生?的生 产是以活菌数为质量指标。因此, 可以认为生产上采用 C/ N 应为 4~ 4. 5!1 为最佳。 2. 2 地衣芽孢杆菌对氨基酸营养要求的研究 用葡萄糖为碳源, 分别以不同氨基酸为氮源, 按上述选出的最佳 C/ N 为 4!1, 各种无机盐
7 7

和维生素各 2mg/ L , 同前法分别配制成液体培养基。同样各组每 100ml 培养基中接种 3. 8 ? 10 个地衣芽孢杆菌, 37 ) 摇床培养 24h, 同法测定其活菌数, 以弄清该菌对氨基酸的需要情 况。地衣芽孢杆菌在不同氨基酸培养基中生长结果见表 2。 从表 2 可以看出, 地衣芽孢杆菌生长对氨基酸的需要可有 3 种情况: 第一种情况是对生长 有利, 在这类氨基酸的培养基中菌数较高, 均在 3. 2 ? 10 个/ ml 以上。它们是不可取代氨基 酸, 如 D 苯丙氨酸、 天冬氨酸、 苏氨酸、 L L 亮氨酸、 组氨酸、 丝氨酸、 异亮氨酸、 胱氨酸、 L DL 异戊氨酸、 天冬酰胺、 赖氨酸等。第二种情况是不但有利于地衣芽孢杆菌生长, 而且有刺激生 长的作用, 因此, 它们既是不可取代氨基酸又可作为生长因子, 如赖氨酸, 天门冬酰胺。地衣芽 孢杆菌在这类氨基酸的培养基中菌数最多, 其菌数为 4. 01 ? 107 / m l 和 6. 2 ? 107 / ml。第三种 情况是对地衣芽孢杆菌生长无促进作用的氨基酸, 地衣芽孢杆菌在这类氨基酸的培养基中, 菌
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量增长很低, 均在 3. 0 ? 107 个/ m l 以下, 是可取代的氨基酸, 如脯氨酸, 谷氨酸, 酪氨酸、 色氨 酸等。因此, 在生产上为了提高含菌量, 应尽可能满足基质中有足够量不可取代氨基酸, 特别 是有刺激作用的氨基酸, 如赖氨酸和天冬酰胺。
表2
氨基酸 脯氨酸 谷氨酸 L 苯丙氨酸 D 苯丙氨酸 丙氨酸 活菌数 ( ? 107 / ml) 3. 04 2. 24 2. 40 3. 90 3. 25 氨基酸 酪氨酸 精氨酸 苏氨酸 色氨酸 L 胱氨酸

不同氨基酸对地衣芽孢杆菌增殖的影响
活菌数 ( ? 107 / ml) 2. 80 3. 33 3. 90 2. 41 3. 01 5. 74 0. 91 氨基酸 天冬酰胺 甘氨酸 赖氨酸 天门冬氨酸 D L 异戊氨酸 活菌数 ( ? 107 / ml) 4. 01 3. 42 6. 20 3. 60 3. 30 氨基酸 组氨酸 丝氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 活菌数 ( ? 107 / ml) 3. 40 3. 95 3. 80 3. 20

将上述氨基酸全部等量混合 对照( 只有葡萄糖无机盐维生素不加氨基酸)

2. 3

地衣芽孢杆菌对维生素营养要求的研究 以葡萄糖为碳源, 氨基酸为氮源, C/ N 为 4!1, 加入不同种类和不同量的 VB1 、 2 、 3 、 VB VB

VB 4 、 5 、 6 、 11 、 ; Fe2+ 、 2+ 、 1+ 、 1+ 、 2+ 各 2mg/ L 。同前法配制成液体培养 VB VB VB VH Mg K Na Ca 基, 分别在每 100ml 培养基中接种 3. 8 ? 107 个地衣芽孢杆菌( 活化培养 18h) , 同法 37 ) 培养 24h, 用前法测定活菌数, 以确定其对维生素的需要情况。地衣芽孢杆菌在不同种类不同量维 生素培养基中生长, 结果见表 3。
表3 维生素 V B1 量 ( mg/ L) 1 2 3 4 5 V B5 1 2 3 4 5 VH 1 2 活菌数 ( ? 10 / ml)
7

地衣芽孢杆菌生长与维生素的关系 维生素 VB 2 量 ( mg / L ) 1 2 3 4 5 VB 6 1 2 3 4 5 3 4 活菌数 ( ? 10 / ml)
7

维生素 V B3

量 ( mg/ L ) 1 2 3 4 5

活菌数 ( ? 10 7/ ml) 2. 65 2. 90 3. 10 3. 45 2. 30 2. 10 3. 15 2. 55 1. 65 1. 40 9. 25

2. 20 3. 55 2. 21 2. 20 2. 20 2. 15 2. 65 2. 81 3. 10 2. 69 6. 10 6. 25

2. 25 2. 45 2. 40 2. 25 2. 25 2. 50 2. 57 2. 50 2. 31 2. 10 7. 62 8. 38 1. 01

VB11

1 2 3 4 5 5

对照( 只有碳源氮源无机盐不加维生素)

表 3 结果表明, 不同种 类不同量 维生素对 地衣芽孢 杆菌生长 有一定影 响。其中 VB 1 、 VB 11 、 5 在 2mg / L, VB 3 在 4mg/ L 时为宜, 这时菌数较高为 3. 01~ 3. 55 ? 10 / ml, 是对照的 VB 3~ 3. 5 倍。 2 、 6 次之, 以 2mg/ L 时为宜, 菌数较高, 为 2. 45~ 2. 57 ? 10 / ml, 是对照的 2 VB VB ~ 2. 5 倍。而 VH 对生长影响最明显, 比其余维生素都好, 菌数最高, 为 9. 25 ? 107 / ml, 是对照 的 9 倍, 菌苔很厚。而且随用量加大而菌数增加。
7 7

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胡尚勤等: 地衣芽孢杆菌营养要求的研究

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2. 4

地衣芽孢杆菌对矿质元素要求的研究 以葡萄糖为碳源, 氨基酸为氮源, C/ N= 4!1, 加入不同种类不同浓度的无机盐和上述各种
7

维生素各 2mg / L, 同前法配成液体培养基, 分别在各组培养基每 100m l 中接种 3. 8 ? 10 个地 衣芽孢杆菌( 活化培养 18h) , 37 ) 摇床培养 24h。用前法同样测定活菌数, 以了解该菌对矿质 元素的需要。地衣孢杆芽菌在不同种类不同量矿质元素培养基中的生长量, 结果见表 4。
表 4 不同矿质元素对地衣 芽孢杆菌生长的影响 矿物质 浓度 ( mg/ L) Fe 1 2 3 4 5 Ca 1 2 3 4 5 活菌数 ( ? 10 7/ ml) 1. 85 1. 40 0. 90 1. 55 1. 45 0. 80 1. 05 2. 50 0. 70 0. 65 K Mg 矿物质 浓度 ( mg / L ) 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 活菌数 ( ? 107 / ml) 1. 20 3. 30 1. 35 1. 25 1. 20 1. 70 3. 55 1. 56 1. 40 1. 35 0. 96
2+ 1+ 1+ 2+

矿物质

浓度 ( mg/ L )

活菌数 ( ? 10 7/ ml) 1. 25 2. 05 1. 55 1. 45 1. 40 1. 30 2. 15 1. 15 0. 95 0. 85

Mn

1 2 3 4 5

Na

1 2 3 4 5

对照( 只有碳源氮源维生素不加矿物质)
2+ 2+

表 4 表明, F e 在 1mg/ L, Mn , M g , K , Na 均在 2mg/ L 时, Ca 在 3mg/ L 时, 菌 数高于其余浓度时的菌数。菌数分别在 1. 85 ? 10 7 / ml, 1. 25 ? 107 / ml, 3. 3 ? 107 / m l, 3. 35 ? 107 / ml, 2. 15 ? 107 / ml, 2. 50 ? 107 / m l。分别是对照的 1. 92 倍, 1. 30 倍, 3. 43 倍, 3. 49 倍, 2. 24 倍, 2. 60 倍。矿质元素浓度过高过低都不利于该菌生长。所以, 生产上为了提高菌数产量, 必 须考虑各种矿质元素的最佳用量。

3

结论

( 1) 研究结果表明, 地衣芽孢杆菌在以葡萄糖为碳源, 赖氨酸、 天门冬酰胺等多种复合氨基 酸为氮源, 最佳 C/ N= 4~ 4. 5!1, 其菌数是对照的 2. 1 倍以上。 ( 2) 赖氨酸、 天门冬酰胺对地衣芽孢杆菌有特殊的刺激生长的作用, 可视为生长因子。而 苯丙氨酸、 天冬氨酸、 苏氨酸、 亮氨酸、 组氨酸、 丝氨酸、 异亮氨酸、 胱氨酸、 天门冬酰胺、 赖氨酸 对生长有明显的促进作用, 且是不可取代氨基酸。 ( 3) 生物素( VH ) 对地衣芽孢杆菌生长有最明显的促进作用, 其菌数最高, 可视为最佳生长 因子。 ( 4) 地衣芽孢杆菌对各种矿质元素的需要均在 2~ 4m g/ L 的浓度范围为合适。

参考文献:
%1&辜明铭, 等. 中国医疗卫生荟萃( 感染与微生物) %M &. 成都: 成都科技大学出版社. 1995. %2&范秀容. 微生物学实验%M&. 北京: 高等教育出版社. 1989. %3&M ichael J. Pelczar, Jr. Laborat ory exercisesin M icrobiology 1977, N ew Y ork, P237 %4&蔡定域. 酿酒工业分析手册%M&. 北京: 轻工业出版社, 1988.


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