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复合诱变选育γ-癸内酯生产菌株


※生物工程

食品科学

2007, Vol. 28, No. 06

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复合诱变选育γ- 癸内酯生产菌株
王 聪,宋焕禄 * ,吕跃钢
(北京工商大学化学与环境工程学院, 北京 摘 100037)

要:以紫外诱变和化学诱变相结合的复合诱变方法, -癸

内酯产生菌株 Yarrowia lipolytica 酵母进行诱变。 对γ

经过一次紫外诱变后,γ- 癸内酯产量为过去的 2.5 倍,但多次诱变后其产量并没有进一步提高,且稳定性不好。 其后采用硫酸二乙酯进行化学诱变稳定其产量。最终γ- 癸内酯产量为出发菌株的 2.3 倍。 关键词:Yarrowia lipolytica 酵母;紫外诱变;化学诱变;复合诱变;γ- 癸内酯

Breeding of Strain for Producing γ -Decanolactone by Composite Mutation Method
. . WANG Cong,SONG Huan-lu*,LU Yue-gang (School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing

100037, China)

Abstract: strain for producing γ A -decanolactone was obtained by composite mutation (ultraviolet mutation and chemical mutation). After the first ultraviolet mutation, the yield of γ -decanolactone was as 2.5 times as the original strain. But the yield wasnotstabilityanddidn'thavefurtherincreaseaftermoremutations.Atlastdiethylsulfatestabilizedtheyield,anditwasincreased by 2.3 times. ; ; ; ; -decanolactone Key words Yarrowia lipolytica ultraviolet mutation chemical mutation composite mutation γ : 中图分类号 TS201.3 : 文献标识码 A : 文章编号 1002-6630(2007)06-0237-04 :

γ- 癸内酯是含有五元内酯环的十碳化合物,分子 结构式如图 1 ,是生产的最多的内酯之一,它具有浓郁 的桃香和椰子香,存在于多种水果及乳制品中,是国际 公认安全的食品添加剂和药品添加剂。因其具有诱人香 味和低香气阈值(以水为溶剂,其阈值为 0.088 × 10 - 6)[1] 的特征,在香料工业得到了广泛的应用 。通过生物技术
[2]

到大规模工业化生产中等诸多优点。那么如何提高微生 物产γ- 癸内酯的能力就备受关注。本实验以 Yarrowia

lipolytica 酵母作为出发菌株,利用紫外线进行诱变,筛
选出γ- 癸内酯产量高的菌株,为高产菌株的培养基配 方、发酵培养条件的进一步优化提供实验基础。

获得的γ- 癸内酯被称为天然γ- 癸内酯。一些学者[3-6]在 研究多种微生物的羟基酸代谢产物时就发现,某些微生 物具有产生γ- 癸内酯的能力。在众多的可以生产γ- 癸 内酯的菌株中, Yarrowia lipolytica 酵母生产γ- 癸内酯 的能力是较强的。该菌株可以利用富含油脂和蛋白的基 质(例如奶酪和香肠),积累一定的γ- 癸内酯[7-12]。苏畅
[13]

O γ -decalactone 图1 Fig.1 γ- 癸内酯分子结构式

O

Molecular structure of γ-decalactone

等就对 S p o r i d i o b o l u s r u i n e n i i A S 2 . 1 5 7 7 ,

1 1.1 1.1.1

材料与方法 材料与仪器 菌种

Sporidiobolus salomonicolor AS2.1482、AS2.1550、 AS2.1574、AS2.1603,Yarrowia lipolytica AS2.1405、
AS2.1552 七个菌株的产γ- 癸内酯的能力进行了研究,最 终发现Yarrowia lipolytica AS2.1405对γ -癸内酯的生产 能力最强,产率约为 1 % 。近年来随着消费者对往食品 中添加化学合成品越来越抵制,使得天然食品添加剂越 来越受到大家的青睐。而微生物法产γ- 癸内酯与其他 生物制备香料的方法相比,具有代谢能力强、培养基 来源丰富、成本低以及一旦优化好培养条件就可以投入

Yarrowia lipolytica酵母
管理中心。 1.1.2 试剂及标样 γ -癸内酯标样 均为分析纯。 1.1.3 仪器

中国普通微生物菌种保藏

Aldrich Chemical公司, 其余试剂

收稿日期 2007-04-30 : *通讯作者 作者简介:王聪( 1 9 8 2 - ) ,女,硕士研究生,研究方向为香味物质生物合成。

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超净工作台

食品科学

※生物工程

天津中环试验电炉有限公司 汽浴恒温 ; 北京仪诚科技公司 蒸汽灭菌锅 ; 山东 奥 国 日本

验将生长到对数生长期菌液 4ml (浓度约为 108 个 /ml),加 入到 16ml 磷酸缓冲溶液中,加入 0.2ml 硫酸二乙酯,振 荡处理 30、50、70min。最后加入 0.5ml 的 25% 硫代硫 酸钠中止反应。稀释到 1 0 - 4 、1 0 - 5 、1 0 - 6 三个稀释度, 每个稀释度平行涂布三个平板。2 8 ℃恒温培养箱中培养 7 2 h ,将培养好的平板取出进行菌落记数,计算致死率。 1.2.4 初筛与复筛

振荡器(SHZ-82)

新华医疗器械股份有限公司 显微镜(Olympus CX31) ; 林帕斯公司;生化培养箱 SJD-1 型台式紫外线杀菌灯;磁力加热搅拌器 78-2 华电器有限公司 himac CR 22G型高速冷冻离心机 ; HITACHI 公司;气相色谱仪 6890N 1.2 1.2.1 1.2.1.1 方法 培养基 斜面培养基

上海一恒科技有限公司;

美国安捷伦公司。

Yarrowia lipolytica酵母自身会分泌出脂肪酶和乙酰
C o A 氧化酶,其中脂肪酶分解其生长所必需的底物为其 生长提供养料,乙酰 C o A 氧化酶是该菌种产生γ- 癸内 酯的关键酶。作为产生 G D L 的筛选方法,本应该以乙 酰 C o A 氧化酶的活性为标准,但由于乙酰 C o A 氧化酶 的测定非常麻烦,所以在初筛时采用相对容易的脂肪酶 检测培养基进行筛选。将菌液直接涂布于 1.2.1.4 的脂肪 酶筛选培养基上,挑选透明圈大且菌斑直径大的菌落, 转接至斜面培养基。在复筛中采取单瓶发酵,最后测 定发酵液中γ- 癸内酯的含量,作为复筛标准。 1.2.5 γ- 癸内酯发酵产率的测定 取 10ml 发酵液,10000r/min 离心 10min,上清液移 至分液漏斗加入 1 0 m l 乙醚,振荡混匀,静置 2 0 m i n , 上相( 溶剂) 浓缩至 1 m l ,G C 测定其含量。 1.2.6 毛细管气相色谱条件 色谱柱:Agilent 19091J-413 HP-5;柱温采用程序升 温:初始温度 40℃,保持 1min,以 6℃/min 的速度升温 到 160℃,保持 2min,以 8℃/min 的速度升温到 230℃, 保持 20min;进样口温度 250℃;分流比 10:1;载气为 高纯氮气,流量 1.0ml/min; 检测器:FID 监测器。 2 2.1 结果与分析 紫外诱变结果及致死率 紫外诱变中,108 个 /ml 浓度的出发菌株的菌液经诱 变后,即使是在稀释倍数最高的平板上,菌落数还是 很多。1 0 4 个 / m l 浓度的出发菌株的菌液经诱变后,在 2min 时已达到了很高的致死率。所以选取 10 6 个 /ml 浓 度的出发菌株的一组采集数据。
表1 Table 1 酵母 Yarrowia lipolytica 紫外诱变后平板菌落数与致死率 Relationship between UV-treated yeast number and lethality 处理时间 (min) 0 1 2 3 4 5 6 平板 1 198 130 85 23 7 3 0 菌落数(稀释倍数10-3) 平板 2 203 142 82 19 15 0 0 平板 3 210 139 79 22 11 1 0 平均数 203 137 82 21 11 1 0 致死率 (%) 0 32.51 59.61 89.66 94.58 99.99 100

葡萄糖 1%,蛋白胨 1%,酵母膏 0.5%,NaCl 0.5%, 琼脂 2%,用 6mol/L NaOH 调 pH7.0~7.2,121℃灭菌 2 5 m i n ,2 8 ℃恒温箱中培养 2 4 h 。 1.2.1.2 液体培养基 葡萄糖 1%,蛋白胨 1%,酵母膏 0.25%,NaCl 0.5%, MgSO 4 ·7H 2 O 0.3%,吐温 -80 0.4%,pH6.5。 1.2.1.3 发酵培养基 蓖麻油 6 % ,蛋白胨 0 . 5 % ,酵母膏 0 . 2 5 % ,N a C l 0.5%,吐温 -80 0.4%,MgSO 4 ·7H 2 O 0.3%,pH6.5。 1.2.1.4 脂肪酶筛选培养基 酵母膏 1 % ,三丁酸甘油酯 0 . 2 % ,葡萄糖 0 . 3 % , 琼脂 2%,用 6mol/L NaOH 调 pH7.1。 1.2.2 紫外诱变和致死率 紫外诱变采用以下路线:菌种活化→菌体种子培养 基→紫外线诱变→稀释→涂布平板→分离 将酵母菌种用斜面活化至对数期,用血球计数板计 数,移取适量菌液于装有无菌水和适量玻璃珠的三角瓶 中,振荡三角瓶以打散细胞,调整此菌悬液的细胞浓 度分别约为 1 0 4 、1 0 6 、1 0 8 个 / m l ,取 5 m l 以上各浓度 菌液加入到直径 9c m 的无菌平皿中,置距离 20 W 紫外灯 30cm 处进行照射,每隔 1min 取样,然后分别取 0.1ml 涂平板。对照组涂 1 0
-3

、1 0

-4

、1 0

-5

三个稀释度,诱

变组涂诱变原液和 1 0 - 1 、1 0 - 2 、1 0 - 3 四个稀释度,每 个稀释度涂三个平板。从紫外线照射以后的操作都在红 灯下进行。将涂匀的平板装在不透明的盒子里,置于 2 8 ℃恒温培养箱中培养 7 2 h ,将培养好的平板取出进行 菌落记数,计算致死率。 致死率(%)=100 -(处理后每 0.1ml 菌落数 / 对照每 0.1ml菌落数)×100 1.2.3 化学诱变 化学诱变采用以下路线:菌种活化→液体种子培养 基→化学诱变→稀释→涂布平板→分离 化学诱变采用硫酸二乙酯为诱变剂。硫酸二乙酯易 分解而引起环境 p H 改变,因此采用缓冲液配制。本实

※生物工程
表2 Table 2 处理时间 (min) 50 70 平板 1 229 229 平板 2 234 234

食品科学
酵母 Yarrowia lipolytica 化学诱变后平板菌落数与致死率

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Relationship between chemical-treated yeast number and lethality 菌液稀释到10-5时平板上菌落数

诱变前 平板 3 238 238 平均 233 233 平板 1 27 7 平板 2 33 3

诱变后 平板 3 34 9 平均 31 6

致死率(%) 86.7 97.4

由表 1 中的数据可看出,该酵母在 2 m i n 之内对 紫外线是比较敏感的,照射到 2 m i n 时致死率可达到 5 9 . 6 1 % ,此后随处理时间的延长,致死率逐渐上升。 处理到 5 mi n 时,致死率已经接近 10 0% 。故该菌株的紫 外线最长耐受时间为 5 m i n 。许多学者认为,当致死率 达到 7 0 % ~8 0 % 时,诱变效果最好,正突变率最高, 时间。 2.2 紫外诱变筛选结果 对 4 0 株诱变菌株进行筛选,数据如图 2 所示, 其中 0 号菌株为出发菌株,其发酵液中 G D L 的含量为 159.478μg/ml,共 40 株待筛选菌株,其中正突变菌株 有 2 3 株,占 5 7 . 5 % 。其中产量最高的一株菌为 7 号菌 株,产量为 397.848μg/ml,是出发菌株的 2.5 倍。
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

可见处理 50min 时的数据比较符合筛选的标准,进 行进一步初筛和复筛。 2.4 化学诱变筛选结果 对 2 0 株菌进行发酵所得的结果如图 3 所示。
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 菌种名称 图3 Fig.3 化学诱变菌株 GDL 产量图表 Yield of GDL by chemical-induced mutants

GDL 含量( μg/ml)

由图 3 可以看出,正突变菌株共有 1 1 株,占总菌 数的 55%。其中产量最高的菌株产 GDL 为 397.043μg/ml, 较紫外诱变没有什么增长,推测该菌株对于紫外和化学 诱变的敏感度较低,需尝试用其他诱变方法增加其产 量。将化学诱变得到的高产菌株命名为 Y - 1 - 3 。
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

2.5

稳定性实验 将 Y-1-3 传三代,分别进行发酵,GDL 含量分别为

菌种名称 图2 Fig.2 紫外诱变菌株 GDL 产量图表 Yield of GDL by induced UV-mutants

375.410、368.125 和 361.202μg/ml,产量有所下降,但 是基本可以保持在较稳定的水平。 3 结 论

将产量最高的 7 号菌株进一步紫外诱变,筛选出 GDL 产量最高的菌株,再进行紫外诱变,但是发现 G D L 产量 并没有得到进一步提高。其中第二轮和第三轮紫外诱变 的最高产量为 337.679μg/ml 和 400.158μg/ml,均保持在 3800μg/ml 左右的水平。推测其原因是紫外诱变虽然对 该菌株产生一定的作用,但是这种突变是很容易得到恢 复的,在进行下一轮诱变前的传代过程中,这种突变 即被修复。将最后一轮采用紫外诱变得到的高产菌株命 名为 Y - 1 。进而采用化学诱变的方法稳定 Y - 1 的产量。 2.3 化学诱变结果及致死率 化学诱变处理 30min 的菌液在稀释倍数最大的平板 上菌落数也很大,该组数据不进行处理。处理 50min 和 70min 的菌液致死率见表 2。

针对Yarrowia lipolytica酵母产γ -癸内酯含量不高 的特点,采用紫外诱变和化学诱变相结合的复合诱变方 法,对产生菌株进行诱变。经过一次紫外诱变后,γ癸内酯产量为过去的 2.5 倍,但多次诱变后其产量并没有 进一步提高,且稳定性不好。其后采用硫酸二乙酯进行 化学诱变稳定其产量,γ- 癸内酯含量分别为 375.410、 368.125 和 361.202μg/ml,产量有所下降,但是基本可 以保持在较稳定的水平,最终突变株γ- 癸内酯产量为 出发菌株的 2 . 3 倍。
参考文献:
[1] 孙宝国, 刘玉平. 内酯类香料[M]. 北京: 中国石化出版社, 2004: 346-

GDL 含量( μg/ml)

故本实验选取致死率为 89.66% 时的 3min 为最佳紫外诱变

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食品科学

※生物工程

酶法提取蛋壳膜中的角蛋白
杨德玉 1 ,李 珍 2 ,高 新 3 ,丁兆兰 4 ,刘 鹏 1 ,张小燕 3
(1.西北大学化学系, 陕西 西安 3.西北大学食品工程系, 陕西 西安 摘 710069 2.西安力邦制药有限公司, ; 陕西 西安 710069 4.西安新华科工贸学校, ; 陕西 西安 710075 ; 710077)

要:以鸡蛋蛋壳膜为原料,酶法提取蛋壳膜中角蛋白的研究,对酶的用量、提取时间、提取温度、提取

的最佳 pH 值、反应的固液比进行了探讨,在最佳工艺条件下:酶用量为蛋膜量的 3%(W/W),固液比 1:15,pH9~ 1 0 ,提取温度 5 5 ~6 5 ℃,提取时间 6 0 m i n ,角蛋白产率可达到 2 6 % 。 关键词:蛋壳膜;角蛋白;碱性蛋白酶

Enzyme Extraction of Keratin from Eggshell Membrane
YANG De-yu 1 ,LI Zhen 2,GAO Xin 3 ,DING Zhao-lan 4 ,LIU Peng 1 ,ZHANG Xiao-yan 3 (1.Department of Chemistry, Northwest Univesity, Xi'an 2.Libang Pharmaceutical Factory of Xi'an Co. Ltd., Xi'an 4.The Industry of Xinhua Technology Trade School in Xi'an, Xi'an 710069, China ; 710075, China ; 710069, China ; 710077, China)

3.Department of Food Science and Technology, Northwest Univesity, Xi'an

Abstract: this paper, the principle of experiment and operation method of extracting keratin from eggshell membrane with In alkaline protease was introduced. From the results, the optimum conditions were obtained, including the quantity of alkaline protease 2%(W/W), solid-liquid ratios 1:15, pH9~10, temperature 55~65 ℃, and reaction time 60 min etc. The keratin yield reaches 26%. Key words eggshell membrane keratin alkaline protease : ; ; 中图分类号 TS253.9 : 文献标识码 A : 文章编号 1002-6630(2007)06-0240-03 :

收稿日期:2006-07-17 作者简介:杨德玉( 1 9 5 0 - ) ,男,副教授,本科,主要从事天然蛋白质的提取和应用研究。

356. [2] [3] 凌关庭. 食品添加剂手册[M]. 北京: 化学工业出版社, 1989: 148-149. TAHARA S, FUJIWARA K, MIZUTANI J. Neutral constitutes of volatlies in culture medium of Sporobolomyces odorus in the presences of fatty acid and oils[J]. Agric Biol Chem, 1973, 37: 2855-2861. [4] DUFOSSE L, SOUCHON I, FERON G, et al. In situ detoxification of the fermentation medium duringγ -decalactone production with the yeast Sporobolomyces salmonicolor[J]. Biotechnol Prog, 1999, 15: 135-139. [5] BERGER R G, NEUHAUSER K, DRAWERT F. Characterization of the odour principles of some basidomycotes Bjerlandera adusta, Poria [11] [10] [9]

biological production of gamma(R) decanolide and gamma(R) octanolide. US: 4950607[P]. 1990-08. FARBOOD M I. Fermentation process for preparing 10-hydroxy-C18 carboxylic acid and γ -decalactone derivatives. Eur: Patent EP0578388 [P]. 1994-09. GGTFIELD I L. Biotechnological production of natural flavor materials [C]//TERANISHI R, WICK E L, WERHOFF P. Flavor chemistry, thirty years of progress. New York: Kluwer, 1999: 211-227. SCHRADER J, ETSCHMANN M W, SELL D, et al. Applied biocatalysis for the synthesis natural flavour compounds current industrial processes and future prospects[J]. Biotechnology Letters, 2004, 26: 463-472. [12] WACHE Y, AGUEDO J M, NICAUD J M, et al. Catabolism of hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia

aurea, Tyromyces sambuceus[J]. Flav Frag J, 1986(1): 181-182.
[6] [7] [8] SARRIS J, LATRASSE A. Production of odoriferous gamma lactones by Fusarium pore[J]. Agric Biol Chem, 1985, 49: 3227-3230. FARBOOD M I. Production of γ -decalactone. Int: Patent WO8301072 [P]. 1983-07. CARDILLO R, FUGANTI C, SPUARCLA G. Process for the micro[13]

lipolytica[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 61: 393-404.
苏畅, 任大明, 杜毅, 等. 生物合成天然手性γ -癸内酯[J]. 香精香料 化妆品, 2004(4): 22-24.


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具有相同的九元环双内酯 母核,但侧链结构不同,A3...2.2 紫外线与氯化锂复合诱变: 经不同时间紫外处理...高产菌株选育也比较困难,因此在高通量筛选的条 件...
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