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液相色谱柱的选择和介绍


液相色谱分离速度提高及选择性优化
安捷伦液相色谱柱介绍与选择

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How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

液相色谱方法开发中如何选择色谱柱 液相色谱方法开发中如何选择色谱柱?
1.根据样品特性选择分离

模式 2 色谱柱的适应性和选择性 2.色谱柱的适应性和选择性 3.色谱柱规格的选择
我要一根ODS柱

2

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HPLC模式选择
溶于有机溶剂

硅胶的正相色谱 溶于正己烷 用不同键合相的正相色谱

溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水

用不同键合相的反相色谱 用不同键合相的反相色谱

分子量<2,000

溶于四氢呋喃

低分子凝胶渗透色谱 用不同键合相的反相色谱

溶于水

非离子化

抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相色谱

样品

离子化 硅胶基质的反相色谱 离子交换色谱 溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱 溶于水 大孔填料的离子交换色谱 用大孔填料的反相色谱

分子量>2,000

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分离模式的选择实例-三聚氰胺分析
三聚氰胺是强极性,弱碱性化合物(pKa=8),微溶于水。

模式一:离子对键合相的反相色谱 对应国标方法GB/T 22388-2008第一法(反相离子对方法) 流动相:离子对试剂(辛烷磺酸钠)溶液:乙腈 = 92:8 色谱柱:ZORBAX SB-C8 4.6x250mm,5um 模式二:硅胶基质的反相色谱(HILIC) 对应安捷伦开发的HILIC模式方法 流动相: 10mM乙酸铵:ACN=11:89 色谱柱:Zorbax Rx-Sil, Rx-Sil 2.1 2 1×150mm, 150mm 5um
4
Page 4

模式三:离子交换色谱 对应安捷伦开发的离子交换方法 流动相:50mM 甲酸铵(pH3.0):乙腈=15:85 色谱柱: ZORBAX 300SCX 4 4.6 6×150mm, 150mm 5um
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液相色谱方法开发中如何选择色谱柱?
1 根据样品特性选择分离模式 1.根据样品特性选择分离模式 2.色谱柱的适应性与选择性
适应性:色谱柱的耐受范围 选择性 不同色谱柱对同一样品的分离不同 选择性:不同色谱柱对同一样品的分离不同

3.色谱柱规格的选择

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不同反相色谱柱的pH适应范围
Extend C18 pH 2~11.5

Bonus-RP pH 2~9

Eclipse PLUS/ XDB C18 pH 2~9

Agilent TC/HC pH 2~8/9

StableBond C18 pH 1~8

pH
6
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选择性、柱效、保留对分离度的影响
选择性对分离度的影响最大
7.00

? 优化键合相 ? 优化流动相

方法开发首要因素

6.00

5 00 5.00

Resolution

4.00

Increase N Increase Alpha Increase k'

3.00

2.00

1.00

Rs = N?/4 ? (α-1)/α ? k’/(k’+1)
0.00

Plates: Alpha: k’:
7

5000 1.10 2.0

1

2

3

4

5

10000 1.35 4.5

6

7

8

9

10

15000 1.60 7.0

11

12

13

14

15

20000 1.85 9.5

16

17

18

19

20

25000 2.1 12.0

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液相色谱柱选择性比较 – 以酸碱混合物为例
Sulfamethoxazole
Acid (pKa 5.6)
O N NHSO2 H3 C

Neutral (pKa 8.0)
O H5 C 2 H5 C 2 O NH O NH

Barbital

Base (pKa 14.0)
NH2 H3 C O O N N CH3 CH3 N N

Caffeine

8

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SB-C18

2

酸碱混合物在XDB及SB上分离比较
SB-C8
2& 3

SB-Phenyl

2

3

SB-CN
2

1
0

3

1 1
10 0 0 5 10 Time (min)

3

1

5 Time (min)

5

Time (min)

10

15

15

20

0

5 Time (min)

10

XDB-C18 XDB C18
3

2

XDB-C8 XDB C8
3

2

3

XDB-Phenyl XDB Phenyl
2

1 1
0 5 Time (min) 10 0

1
5 Time (min) 10 0 5 Time (min) 10 15

(1)Barbital

(2)Sulfamethoxazole

(3)Caffeine

Columns: 4.6 x 75 mm, 3.5 μm Mobile Phase: 80% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 : 20% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35°C UV 254 nm
9
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Zorbax? 液相色谱柱
常规分析柱
Zorbax Eclipse Plus柱 Zorbax Eclipse XDB Zorbax Stable Bond 柱 Z b Extend Zorbax E d C18柱 Zorbax Bonus-RP 柱 Zorbax SB-Aq 柱 Zorbax RX HPLC 柱 原先的Zorbax ODS柱 Zorbax 正相柱 其他Zorbax 柱

高通量和LC/MS柱
Zorbax 高通量柱,LC/MS 色谱柱 Zorbax 快速分离柱 Zorbax 快速分离高通量柱 Zorbax 溶剂节省色谱柱 Zorbax 微径色谱柱 Zorbax 毛细管柱和纳流柱

生化分析柱
Zorbax 300 SB 柱 Zorbax 300Extend柱 Zorbax Poroshell柱 Z b Eclipse Zorbax E li AAA柱 Zorbax GF-250/450 凝胶柱 Zorbax Oligo HPLC柱 Zorbax SAX和SCX柱 MARS mRP column

制备柱 Zorbax PrepHT制备柱 常规分析柱
Agilent TC /HC Agilent g TC/HC (2) ( )

A il t? Agilent 液相色谱柱
10

制备柱

Agilent prep 制备柱
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安捷伦Zorbax? HPLC色谱柱
严格的质量控制 产品研究与开发 硅胶生产 键合 柱装填
? 具可追溯性 ? 可定购生产批号不同的色谱柱 ? 特殊规格定制
Extend Bonus RP E li Eclipse StableBond

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ZORBAX?硅胶类型
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面 上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致 碱性化合物发生拖尾

B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾

金属浓度(ppm) 二氧化硅 氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出 Na 10 17 56 K <3 nd Mg 4 nd Al 1.5 57 300 Ca 2 9 38 Ti nd 32 Fe 3 21 76 Zr nd 88 Cu nd <1 Cr nd nd Zn 1 88

N/A N/A nd

130 57

nd N/A N/A nd

2900 N/A 40

65 230 N/A N/A N/A N/A

Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质,

<1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅

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选择适用于pH7.5流动相的色谱柱
Zorbax Eclipse XDB-C18 (B类硅胶)

普通硅胶(A类)
由于带负电荷的残留硅羟基和酸 性表面上金属含量高 (硅羟基的 pKa低), 导致碱性化合物发生拖 尾

高纯硅胶 (B类)
ZORBAX SB-C18 SB C18 (B类硅胶)

由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾

ODS (A类硅胶) 封端

流动相: 乙腈 : 50 mMK2HPO4: 55: 45, pH 7.5 UV: 224 nm 23°C 进样量: 20 ?L (0.5 ?g / ?L)

ODS (A类硅胶) 不封端

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硅胶填料 液相色谱柱的基础…… 硅胶填料-液相色谱柱的基础
Zorbax液相色谱柱硅胶特点
Z b 硅胶的制备方法由液相色谱柱著名创始人J.J. Zorbax J J Ki Kirkland kl d发明,属于安捷伦公司的专利技术。 发明 属于安捷伦公司的专利技术

?高纯度硅胶 游离硅羟基活性降低 提供更好的峰形 ?专利的硅珠堆砌法 更好的重现性 填料颗粒更好的强度 提供不同粒径的颗粒

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Zorbax专利的硅珠堆砌技术
纯度,强度,对孔径与粒度严格控制--优级ZORBAX键合相基础
硅胶 + 脲 (pH=2) + 甲醛CH2O
或:三聚氰氨 甲醛树脂

Δ O2

250oC

粒径
1.8 1 8 ?m 3.5 ?m 5.0 ?m 7.0 ?m

孔径
80A & 300A

ZORBAX Rx

多孔硅胶微球

安捷伦拥有此项填料专利技术
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Zorbax主要的键合相
Zorbax硅胶颗粒

StableBond
二异丙基 二异丁基键合

Rx-C18/Sil
二甲基十八烷基硅烷

EclipsePlus/XDB
二甲基键合 双封端

Bonus-RP
酰胺嵌入 三封端

Extend-C18
双齿键合 双封端

SB-C18
二异丁基-C18 Rx/SB-C8 二异丙基-C8 SB-苯基 二异丙基-苯基

SB-CN 二异丙基-CN SB-C3 三异丙基 SB-AQ 二异丙基

Eclipse XDB-C18 Eclipse XDB-C8 E li XDBEclipse XDB 苯基 Eclipse XDB-CN

Eclipse Plus-C18 Eclipse Plus-C8 E li Plus Eclipse Pl -PAH PAH Eclipse Plus-苯基己基
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Zorbax主要键合相技术介绍
9Zorbax Eclipse XDB/Plus ?Zorbax StableBond ?Zorbax Extend ?Zorbax Bonus RP

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Zorbax Eclipse p
Eclipse Plus
?行业领先的峰形 ?更好的专利技术处理硅 胶基质 ?改进的双封端技术:改 进的键合试剂及键合过程 ?更加严格的质控标准,批与批 之间更加好的重现性 ?不同粒径 – 1.8, 3.5, 5um ?最高的分离效率 ?C18,C8,PAH, 苯基-己基

?致密键合 ?双封端 ?超纯坚固的ZORBAX硅胶 ?宽的 pH使用范围2-9 ?对于所有样品都有较好的峰 形 ?专利技术 ?完整的质控过程 – ?方法开发的首要选择

Eclipse XDB
?C18, C18 C8 C8, 苯基, CN ?不同粒径 – 1.8, 3.5, 5,7um ?对于快速方法开发有很广泛 的应用谱图库 ?多种色谱柱规格,从毛细柱 到制备柱 ? 使用1.8um 颗粒实现快速有 效的方法转化

Eclispe系列的色谱柱所适合的pH范围为2-9,是液相中最为常见的流动相范围。而且在中等pH时, 由于其对碱性化合物的峰形分离优异(尤其是Eclipse Plus),因此一般做为方法开发的首选色谱柱。

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ZORBAX Eclipse Plus 解决了 “峰形” 问题
由于硅胶上残留的硅羟基,碱性化合物通常会出现拖尾的现像
– – – – 低的灵敏度 很差的分离度 在指定时间内分离的峰数少 很难定量

PLUS--针对碱性化合物 而特别研制的色谱柱

Eclipse Plus可以做到!!
ZORBAX Eclipse Plus C18

需要改进的峰形 需 改 峰
ZORBAX Eclipse XDB-C18
3.5 3 5 min 10 min

阿米替林 ~0.1ug, 60% 乙腈 8mM 磷酸钾缓冲盐 pH 7.0, 215nm, 1.0mL/min, 4.6x100mm 5? 色谱柱

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ZORBAX Eclipse Plus 在甲醇流动相中分离阿米替林时峰形出色
阿米替林 ~ 0.1?g 80% 甲醇 8mM 磷酸钾缓冲盐 pH 7.0, 检测器: UV 215 nm, 流速: 1.0 mL/min 色谱柱: 4.6x100mm 5?m

Tf = 1.00 Tf = 1.25

Eclipse Plus C18

Phenomenex Gemini C18 Tf = 1.26 Tf = 1.20 Phenomenex Luna C18 (2) Waters SunFire C18 Ace C18(2) Inertsil ODS (3) Tf = 1.11

Tf = 1.92

在甲醇中峰形通常会比较好,Eclipse Plus 在这个条件下非常出色。

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Eclipse Plus C18 对于酸碱混合物的分离 峰形都是最好
1. 水杨酸 2. 乙酰水杨酸 3. 右美沙芬

Eclipse Plus C18
2

Phenomenex Gemini C18

Tf = 1.01 Tf = 1.12 Tf = 1.21
1 3

Tf = 1.37
3

0

1

2

3

4

5

6

7

min

Eclipse Plus色谱柱对各种类型的化合物-酸、碱和中性化合物-也可以得到优秀的结果

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Eclipse Plus 分析样品的峰形最好
色谱柱: 4.6 x150 mm, 5um 流动相: 60:40 水:甲醇 流速: 1 ml/min 柱温: 40 °C UV 254 nm 样品: 皮质类固醇: 1. 曲安西龙 2. 泼尼松 3. 氢化可的松 4. 可的松 N= 10747 Tf= 1.03
5 10 15 20 25

Eclipse Plus C18
0

N=10968 TF=1.04
30 35

Phenomenex Luna C18 (2)
0 5 10

N=9307 TF=1.09
15 20 25

N=9377 TF= 1.08 1 08
30 35

Waters XBridge C18
0 5

N=8598 TF= 1.14
10 15

N=8737 TF=1.15
20 25 30 35
min

类固醇不是碱性化合物 Eclipse Plus 同样有最好的峰形和柱效!
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苯基-己基柱提供与C18/C8不同的选择性

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Zorbax Eclipse p PLUS 苯基-己基柱 ---- 提供不同选择性

3种不同Zorbax苯基柱提供了更丰富的选择性
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Zorbax Eclipse Plus 苯基-己基柱
-------与其它厂商的苯基 与其它 商的苯基-己基柱的比较 基柱的比较
苯甲酮

Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl y y

Rs = 1.60
苯戊酮

Waters XBridge Phenyl

Rs = 1.72

Phenomenex Ph Luna Phenylhexyl

Rs =1.43

4.6 x 100mm, 5um

Zorbax Eclipse Plus 苯基-己基柱显示出了更好的选择性及峰形。
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Zorbax Eclipse Plus 苯基-己基柱
-------不同粒径的色谱柱分析抗生素
Mobile Phase: A -20mM NaPhos (pH 2.5)/B- ACN Gradient: 20%B - 45%B in 15 min. column: 4.6 x 100mm
q Sulfaquinoxaline sulfamethoxine Oxolinic acid Nalidixic acid furazolidone thiamphenicol carbadox

1 8um 1.8um

3.5um

5.0um

Zorbax Eclipse Plus苯基-己基柱可提供三种规格的填料。粒径越小,柱效越高,分离度越好。
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Zorbax Eclipse 色谱柱
Eclipse Plus: 填料键合相:C18, C18 C8 C8, PAH PAH, 苯基-己基 填料粒径:1.8 um, 3.5 um, 5 um 色谱柱规格:内径 2.1 mm 3.0mm 4.6 mm 长度从30 mm到250mm Eclipse XDB: 填料键合相:C18, C8, CN, Phenyl 填料粒径:1.8 um, 3.5 um, 5 um, 7 um 色谱柱规格:内径从2.1 mm 21.2 mm 长度从30 mm到250mm 以及毛细管柱(0.3 mm和0.5 mm)
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Zorbax主要键合相技术介绍
9Zorbax Eclipse XDB/Plus 9Zorbax StableBond ?Zorbax Extend ?Zorbax Bonus RP

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ZORBAX StableBond色谱柱特点
专利的键合技术,为键合相提供了空间保护作用。 具有行 领先的低p 流动相稳定性 具有行业领先的低pH流动相稳定性。 pH可以低至 1,且允许在高温(80oC)下操作。

键合相 流失, 保留减弱

另 个裸露的硅羟基 , 潜在的拖尾因素 另一个裸露的硅羟基

普通硅胶柱低 pH <2不稳定, 发生水解

Zorbax StableBond 空间位阻保护 间位阻保护---抗水解能力
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ZORBAX StableBond色谱柱
在低pH和高温(pH 0.8,90°C时)卓越的稳定性
1.0 0.8

相对 对保留

0.6

StableBond S bl B d SB-C18 SB C18 (二异丁基-C18) ZORBAX Rx-C18 (二甲基-C18) C18) Competitor A-C18 冲洗溶剂: 50% 甲醇/50% 水1% TFA TFA, 90OC 溶质: 甲苯 Competitor B-C18 Competitor C-C18 Competitor D D-C18 C18 Competitor E-C18

0.4 0.2

0.0

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

冲洗用流动相柱体积

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SB系列中不容忽视的C18键合相:SB SB-Aq
通用性强-100%水相及100%有机流动相
推荐用于强极性组分的分离 在含高水相的流动相中可获得高的保留 高纯度去活硅胶基质

超乎想象的稳定性-在低pH和高温(<80oC)下,具有最长的柱寿命和最好的重现性
可用于PH 1的酸性流动相 最高可用到80oC的条件 保留的重现性较好---不发生“固定相坍塌” 品种齐全 提供从窄径柱,常规柱,到制备柱 液质联用短柱及快速分离柱等 如果流动相中水相或缓冲盐相的比例超过85%, 实 强烈推荐选用能耐高水相的色谱柱,请看以下两张幻灯片对比实验。
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可用于 可用于: 高酸性流动相 强极性样品 100%纯水流动相兼容

高水相比例的流动相往往会导致普通C18/C8 键合相出现保留时间的变化
Example: p Procainamides on Hydrophobic-C8 y p Column
1

Equilibrate with 50% ACN, then mobile p phase
Column: Eclipse XDB-C8 4.6 x 150 mm Mobile Phase: 90% 50 mM KH2PO4, pH 3.5 10% ACN Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: RT 样品: 1. 尿嘧啶 2. Procainamide 3. N-acetylprocainamide 4. N-propionylprocainamide p p yp 5. 咖啡因

1

Phase Collapse 50% l loss i in Resolution R l i After equilibrating with 100% buffer Increase in peak tailing
3

3 2

2

5 4 5 4

0

5 Time (min)

10

0

5 Time (min)

10

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SB-Aq在高水相比例的流动相条件下 保留时间具有很好的重现性
1

Equilibrate with 50% ACN, ACN then mobile phase
Column: ZORBAX SB-Aq 4.6 x 150 mm, 5 μm Mobile Phase: 90% 50 mM KH2PO4, pH 3.5 10% ACN Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: RT Detection: UV 254 nm, 4 nm 样品: 1. 尿嘧啶 2. Procainamide 3. N-acetylprocainamide 4. N-propionylprocainamide 3 5 咖啡因 5.
4 5

No Phase Collapse No loss in Resolution After equilibrating with 100% buffer Good peak shape on all peaks
1

2

2

3 4 5

0

5

10

15 min

0

5

10

15 min

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耐100%水相色谱柱-SB-Aq
塔板数:12283

卡那霉素注射液

拖尾因子 1 01 拖尾因子:1.01 供试品制备:精密量取本品1.0ml,置10ml量瓶中, 加水稀释至刻度,混匀,精密量取该溶液1.0ml置 100ml量瓶中,加水稀释至刻度,混匀,制成每ml约 0 25 溶液,即得。 0.25mg 溶液 即得

色谱条件: 色谱条件 色谱柱:Zorbax SB-Aq C18, 4.6×250mm, 5μm (880975-914) 柱温: 35℃ 流动相 1%三氟乙酸水溶液 流动相: 蒸发管温度: 115℃,空气流速:3.5mL/min流 速:1.0mL/min

仪器配置: 仪器配置 二元泵(G1312A) 手动进样器(G1328B) 柱温箱(G1316A) 数模转换器 35900E 蒸发光散射检测器 Alltech 2000 仪 器 控 制 及 数 据 处 理 : Agilent Chemstation
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有机酸在ZORBAX StableBond-Aq柱上的分离

1. 乳酸 2. 乙酸 3. 柠檬酸 4 富马酸 4. 5. 琥珀酸

液相色谱柱: Zorbax StableBond-Aq 4.6 x 150 mm, 5um 流动相: 99% 20 mM Na2HPO4, pH 2, 1% ACN 流速: 1.0 mL/min 柱温: 柱 35℃ 检测: 210 nm

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Zorbax StableBond 色谱柱
StableBond(80?)色谱柱 键合相:C18, C8, CN, C3, Phenyl, Aq 填料粒径:1.8 um, 3.5 um, 5 um, 7 um 规格:毛细管柱,快速分离柱,分析柱,半制备柱,高通量制备柱。 StableBond (300?) 色谱柱 键合相 C18, 键合相: C18 C8 C8, CN CN, C3 填料粒径: 3.5 um, 5 um, 7 um 规格:纳流色谱柱,毛细管柱,标准分析柱,半制备柱,高通量 制备柱。
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孔径的选择

较大孔径容许较大溶质分子顺畅出入孔隙, 较大 径容许较大溶质 畅出 隙 而较小孔径限制较大溶质在颗粒内部的有效传质。 样品 MW ≤ 4,000, 选择 80? 的孔径 样品 MW > 4,000, 选择 300? 的孔径

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300? 色谱柱可改善大分子的峰形
色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% TFA 流速: 0 0.75 75 mL/min 温度: RT 检测器: UV 282 nm
H3 C HO OCH 3 O OCH 3 O CH2 CH2 CH3 O H3C O OH

O CH3 CHO CH2 HC HO 3 O O N CH 3 O CH3

分子量虽小但 hydrodynamic volume (水动力学体积)较大的分子
HO O CH3

CH3 OH

SB-C3 (80?)
Pw 1/2 = 0.442

Tylosin(泰乐菌素) MW. 926

300SB-C3 (300?)
Pw 1/2 =0.125 =0 125

0

5 Time (min)

10

0

5 Time (min)

10

窄的峰宽表明待测分子进出填料孔隙没有受到阻碍
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38

Zorbax主要键合相技术介绍
9Zorbax Eclipse XDB/Plus 9Zorbax StableBond 9Zorbax Extend ?Zorbax Bonus RP

39

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

ZORBAX Extend Extend-C18色谱柱特点
专利双齿键合技术,为高pH流动相设计 最宽的pH流动相使用范围,可用于pH 2-11.5 双封端保证了碱性化合物优异的峰形 封端保 碱性化合物优异的峰形 硅胶基质,比聚合物基质有更高柱效和更好峰形

pH: 2~11.5 温度: pH >7 , < 400C ; pH <7 , 600C 碳覆盖率:12% 表面积:180m2/g 粒径:3.5, 5μm 孔径:80 ? 键合试剂:双齿 C18 封端:双

C18 Si O

C18 Si O

Silica Support

40

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Zorbax Extend C18高pH流动相 分析碱性成分
色谱柱: ZORBAX Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min 温度: RT 检测器: UV 254 nm

Extend-C18 pH H7
4 23 2,3 1 7

1. Maleate 马来酸盐 1 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6 Triprolidine 苯丙烯啶pKa 6.5 6. 6 3 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0
1

样品:

Extend-C18 pH H 11
4 7

5

5 6

tR = 8.5 85

tR = 11.4
2 6

0

5 Time (min)

0

5

Time (min)

10

高PH下, ,EXTEND C18可增加碱性化合物的保留及改善碱性成分峰形
41
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ZORBAX ExtendExtend-C18 HPLC色谱柱

--Extend Extend-C18 在高pH有长的柱寿命

42

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Zorbax Extend C18色谱柱
Z b E Zorbax Extend t d (80?)色谱柱 填料粒径:1.8 um, 3.5 um, 5 um 色谱柱规格:内径(mm):1.0, 2.1, 3.0, 4.6, 21.2 长度(mm):30, 30 50 50, 100 100, 150 150, 250 Zorbax Extend (300?)色谱柱 填料粒径:3.5 um, 5 um 色谱柱规格:内径(mm) :2.1, 4.6 长度(mm) :50, 50 100 100, 150 150, 250
以及毛细管柱规格。
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43

Zorbax主要键合相技术介绍
9Zorbax Eclipse XDB/Plus 9Zorbax StableBond 9Zorbax Extend 9Zorbax Bonus RP

44

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C18键合相的另一种选择
R O R
1

Si
1

PG

R

Zorbax BonusBonus-RP
? ? 极性酰胺键合相:与普通C18键合相相比, 具有独特的选择性,耐受高水相比例 空间位阻保护键合相和三封端 增强低 pH 空间位阻保护键合相和三封端:增强低 H 稳定性,碱性化合物峰形良好

CH3 Si CH3 CH3 R1 O Si R1 PG R

CH3 Si CH3 CH3 R
1

O

Si R1

PG

R

Zorbax BonusBonus-RP C18
极性官能团

R1

Si
O
R 11 1

NH

O

pH: 2~9 温度: < 600C 碳覆盖率:9.5% 表面积:180m2/g 粒径 3.5, 5μm 粒径: 孔径:80 ? 键合试剂:C18 封端:三
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45

ZORBAX BonusBonus-RP HPLC色谱柱在中低pH值的稳定性测试

Bonus-RP的三封端增强了在pH7的 稳定性,每10,000倍柱体积约相当于 个月的工作时间。 一个月的工作时间

46

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Zorbax Bonus-RP ---可用于100%水相的色谱柱
天麻中天麻素分析
组分名称:天麻素 塔板数:10471 拖尾因子 1 03 拖尾因子:1.03

色谱条件: 色谱柱:Zorbax Bonus RP, 4.6×250mm, 5μm (880688-901) 柱温:35℃ 流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(4:96) 检测波长:220nm 流速:1.0mL/min 进样体积:10μl
47

仪器配置: 四元泵带真空脱气机(G1354A) 自动进样器(G1367A) 柱温箱(G1316A) 紫外检测器(G1314A) 仪器控制及数据处理:Agilent Chemstation

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Zorbax Bonus Bonus-RP RP 色谱柱
填料粒径 1.8 填料粒径: 1 8 um, 3 3.5 5 um, 5 um, 7 um 色谱柱规格:内径(mm) 1.0, 2.1, 3.0, 4.6, 21.2 柱长(mm) 30, 50, 75, 100, 150, 250

分析柱 快速分离柱 节省溶剂柱 窄径柱 微径柱 制备柱 分析柱,快速分离柱,节省溶剂柱,窄径柱,微径柱,制备柱

48

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ZORBAX主要反相键合相
系 系列 键合相 StableBond Eclipse Plus Eclipse XDB Extend Bonus-RP C18, C8, C3 Ph C3,Phenyl,CN, l CN AQ 1.8,3.5,5,7um 毛细管柱, 1.0,2.1,3.0,4.6, 9.4, 21.2mm 柱长 20,30,50,75,10 0,150,250mm 1~8 30,50,75,100,1 50,250mm 2~9 20,30,50,75,10 0,150,250mm 2~9 C18, C8, PAH, phenyl-hexyl h lh l 1.8,3.5,5um 213046 2.1,3.0,4.6mm C18, C8, Ph Phenyl, l CN 1.8,3.5,5,7um 10213046 1.0,2.1,3.0,4.6, 9.4,21.2mm C18 C18

粒径 内径

1.8,3.5,5um 毛细管柱, 1.0,2.1,3.0,4. 6, 21.2mm 30,50,100,15 0, 250mm 2~11.5

3.5,5,7um 102130 1.0,2.1,3.0, 4.6,21.2mm

30,50,75,100 ,150,250mm 2~9

耐受 pH 范围 特点

低pH流动相极 其优异的稳定 性;丰富的键 合相选择

方法开发首选柱, 方法开发首选柱, 高pH流动相 对于碱性化合物 对于碱性化合物 优异的稳定性 峰形优异 峰形优异

独特的选择 性;高水相 分离碱性化 合物
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49

在实际应用中如何选择色谱柱 在实际应用中如何选择 色谱柱
方法中所要求的固定相选定键合相 —以C18柱为例 C18柱为例 色谱条件中所使用的流动相的性质 pH H值 水相比例

如果流动相含有高于85%的水相

BonusBonus -RP 或 StableBond StableBond-Aq
酸性
当碱性物质色谱峰峰形是首要考虑因素时
50
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General guidance on choosing a column based on sample type
较强极性
SB-Aq Bonus-RP SB-C8 SB C8 Eclipse XDB-Phenyl

Zorbax反相色谱柱选择的建议
极性
Eclipse Plus/XDB-C8/C18 Eclipse XDB-CN Eclipse XDB XDB-Phenyl Phenyl SB-C3

中等极性
Eclipse Plus/ XDB-C18 Eclipse Plus/ XDB-C8 Eclipse XDB XDB-CN CN Eclipse XDB-Phenyl SB - all

弱极性
Eclipse Plus XDB-C8 Eclipse Plus/ XDB-C18 Eclipse XDB XDB-CN CN SB-C8 SB-C18

Other columns will work in some cases and could provide a better separation, depending on the actual analytes and excipients present in the sample.

结论:色谱柱的键合相选择,主要从色谱柱的耐受性出发。而对于化合物选择性, 流动相的pH H和色谱柱键合相不同,都会有差异。此表中总结的选择建议,是基于 和色谱柱键合相不同 都会有差异 此表中总结的选择建议 是基于 极性强弱,通常极性较强时,水相比例较高,则建议首选能耐高水相的色谱柱。

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液相色谱方法开发中如何选择色谱柱?
1.根据样品特性选择分离模式 2 色谱柱的适应性和选择性 2.色谱柱的适应性和选择性 3.色谱柱规格的选择
我要一根ODS柱

检测要求 分离规模 分离速度

52

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按分离规模来选择
色谱柱类型 毛细管柱 (填充或开 管) 微型柱 微径柱 纳流柱 (填充或开 管) 窄径柱 分析柱 溶剂节省柱 常规柱 制备柱 半制备柱 制备柱 0.1, 0 1 0.075 2.1 3.0 4.0/4.6 9.4 >20 100~200ng 50~120 μg 150~500 μg 0.1~1.5mg 1~10mg >20mg 200~500 nl/min 0.1~0.5 0.3~1.5 0.5~3 5~10 >20
++++++

内径 (mm) ( ) 0.5, 0.3

上样量

流速 (ml/min) ( )

灵敏度提高

应用范围

1~10μg

1~15 ul/min 10~100 μl/min

+++++

较高灵敏度,LCMS,多肽,蛋白

1.0

10~50 μg

++++

高灵敏度,LCMS

较高灵敏度,LCMS,多肽,蛋白 高灵敏度,LCMS,节省溶剂 分析,节省溶剂 常规分析 mg级的制备 数百mg~g的制备

++ +

安捷伦提供各种规格的色谱柱 请参见消耗品目录 安捷伦提供各种规格的色谱柱,请参见消耗品目录。
53
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液相方法对色谱柱的要求
? 峰形 ? 分离度 ? 色谱柱寿命 ? 重现性 ? 效率

如何提高液相分离速度?

54

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提高液相分离速度 - 安捷伦色谱柱解决方案
采用新型填料技术色谱柱: 小粒径填料色谱柱 – 1.8um RRHT或3.5um RR 实心多孔层填料色谱柱 – Poroshell 300和Poroshell 120

55

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为什么小颗粒填料可以实现快速分离?
0.0045 0.0040 0 0035 0.0035

提高分析速度
? 采用短色谱柱 ? 采用小粒径色谱填料 ? 高流速运行

HETP (cm/ H /plate)

0.0030 0.0025 0.0020 0.0015 0.0010 0.0005 0.0000 -0.0005 0.0 0.2 0.4 0.6

9颗粒度越小,HETP 越低,柱效越高, 分离度越好 实现 分离度越好。实现 与传统颗粒同样柱 5.0 μm 效时,只需更短的 色谱柱。
3.5 μm

2mL/min

5.0 mL/min

9对于小颗粒,提高 流速 HETP不会提 流速,HETP不会提 1.8 μm 高,因此可以真正 通过提高流速来提 高分离速度而不会 损失柱效。
1.2 1.4 1.6
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Interstitial linear velocity (ue- cm/sec)

0.8

1.0

56

改善分离度和灵敏度:相同柱尺寸
mAU 175 150 125 100 75 50 25 0 0
mAU 175 150 125 100 75 50 25 0

1 2 3

4

Rs (5,6) = 8.5

5

6

Rs (6,7) = 2.25

7
1.5 1.75

1.8 um
2 min

Smaller Particle Columns: Same speed – Higher Resln. 1 2 3 4 5 6 7 4-Acetamidophenol Caffeine 2-Acetamidophenol Acetanilide Acetylsalicylic Acid Phenacetin Salicylic Acid

0.25

0.5

0.75

1

1.25

1

2 3

4

Rs (5,6) (5 6) = 6.0 60

5
0.5 0.75 1 1.25

6

Rs (6,7) (6 7) = 2.07 2 07

7
1.5 1.75

3.5 um
2 min

0 mAU 175 150 125 100 75 50 25 0 0

0.25

1

2

4 3
0.5 0.75

Rs (5,6) = 4.7

5
1 1.25

6

Rs (6,7) = 1.61

Column: SB-C18, 4.6 x 30 mm 5 um

7
1.5 1.75 2

Detector: 254 nm Injection Volume: 1 ul Mobile Phase: 1% Formic Acid Acetonitrile (82:18) Flow: 2.0 ml/min

0.25

min

Resolution Enhancement RRHT (5,6) = 1.8x ? Resolution R l ti E Enhancement h t RRHT (6 (6,7) 7) = 1.4x 14
?
57
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缩短柱长
Column Length (mm) 150 100 75 50 30 15
?

Column Efficiency N(5 ?m) 12,500 8,500 6000 4,200 N.A. N.A.

Column Efficiency N(3.5 ?m) 21,000 14,000 10 500 10,500 7,000 4,200 2,100

Column Efficiency N(1.8 ?m) 35,000 23,250 17 500 17,500 12,000 6,500 2,500
Efficiency ff Analysis (N) Time

分析时间 * -33% -50% -67% -80% 80% -90%

Pressure Peak

Volume

Solvent S l t Usage

内装小颗粒的更短的色谱柱,可以获得与内装更大颗粒的长色谱柱的相同柱效

58

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如何做到提高分离速度而不损失分离度?
成比例缩短 分析时间 缩短色谱柱柱长 成比例减少 溶剂用量 = 维持分离度 (改善分离度)

缩小填料粒径

59

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提高速度,保持良好的分离度
1

Rs(1,2) = 4.8

2

3 N=21848

4.6 x 250 mm, 5 μm 1 ml/min

29.65 4 N=22680 30 min

0

1 2

5 3

10

15 12.71 4 N=11691 15

20

25

Rs(1,2) = 3.5

4.6 x 100 mm, 3.5 μm 1 ml/min
20 25 30 min

1 .0 2

5 3 N=6568 4 15 Rs(1,2) 4.15 4 N=6104 5

10

= 3.3
10 15 12 3

4 6 x 30 mm 4.6 mm, 1.8 1 8 μm 1 mL/min
20 4 0.5 1 1.5 20 2 2.5 25 30 min 25 30 min

0 N 6463 N=6463 2.09 N=6460 0

Rs(1,2) = 3.1
5 10

4.6 x 30 mm, 1.8 μm 2 mL/min

15

1.8um RRHT Columns:

14x faster than 4.6 x 250mm, 5um ? Time Saving of up to 95%
?
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60

色谱柱规格变小,不仅分离时间缩短,而且平衡时间也减少。
色谱柱 尺寸 (mm) 柱内 体积 (Vm) 平衡时间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min

4.6 x 50 4 6 x 30 4.6 4.6 x 15 4.6 x 150

0.5 mL 0 3 mL 0.3 0.15 mL 1.54 mL

色谱柱 尺寸 (mm)
2.1 x 50 2.1 x 30 2 1 x 15 2.1

柱内 体积 (Vm)
0.10 mL 0.06 mL 0 03 mL 0.03

平衡时间 流速 0.2 0 2 mL/min
5 min 3 min 1 5 min 1.5

1.0 1 0 mL/min
60 sec 36 sec 18 sec

单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
61
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小颗粒填料的优势
1. 更快的分离速度
z z

使用小颗粒可以在更短的色谱柱上加快分离速度且保持一样 的柱效 平衡时间缩短之后进 步加快分离速度 平衡时间缩短之后进一步加快分离速度

2. 更高的柱效
z z

提高柱效,提高了分离度 提高柱效,提高了灵敏度 灵敏度=信噪比

3. 更低的运行成本
z z

使用更少的有机溶剂 分离时间缩短,提高工作效率
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62

600bar RRHT (1.8um Zorbax色谱柱)
Dimensions 4.6 x 150 4.6 x 100 4.6 x 75 4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 20 3.0 x 150 3.0 x 100 3.0 x 50 3.0 x 30 3 0 x 20 3.0 2.1 x 150 2.1 x 100 2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 20 Dimensions 4.6 x 150 4.6 x 100 4.6 x 75 4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 20 3.0 x 150 3.0 x 100 3.0 x 50 3.0 x 30 3 0 x 20 3.0 2.1 x 150 2.1 x 100 2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 20 Eclipse Pl Plus s C18 Eclipse Pl Plus s C8 959994-902 959964-902 959964-906 959951-902 959941-902 959941-906 959931-902 959931-906 959994-302 959964-302 959941-302 Eclipse Plus PhHex Eclipse PAH 959964-912 959941-912 959931-912 Eclipse XDB-C18 XDB C18 Eclipse XDB-C8 XDB C8 E tend C18 Extend-C18 959964-918 928975-902 928975-906 728975-902 959941-918 927975-902 927975-906 727975-902 959931-918 924975-902 924975-906 724975-902 926975-902 926975-906 726975-902 928975-302 927975-302 924975-302 926975-302 926975 302 928975-306 927975-306 924975-306 926975-306 926975 306 728975-302 727975-302 724975-302 726975-302 726975 302 728700-902 727700-902 724700-902 726700-902 Bonus-RP

推荐的2个起始选择 : ? 959941-902 ? 959741-902 都是Eclipse 都 p Plus C18

959964-306 959941-306

959964-312 959941-312

959794-902 959764-902 959741-902 959731-902 SB-C18 829975-902 828975-902 827975-902 824975 902 824975-902 826975-902 829975-302 828975-302 827975-302 824975-302 826975 302 826975-302 820700-902 828700-902 827700-902 824700-902 826700-902

959764-906 959741-906 959731-906 SB-C8 829975-906 828975-906 830975-906 827975-906 824975-906 824975 906 826975-906 829975-306 828975-306 827975-306 824975-306 826975 306 826975-306 820700-906 828700-906 827700-906 824700-906 826700-906

959764-912 959741-912 959731-912 SB-Phenyl 829975-912 828975-912 827975-912 824975-912 824975 912 829975-312 828975-312 827975-312

959764-918 928700-902 928700-906 959741-918 927700-902 927700-906 924700-902 924700-906 926700-902 926700-906 SB-CN SB-AQ SB-C3 829975-905 829975-914 828975-905 828975-914 827975-905 827975-914 824975-905 824975 905 824975 824975-914 914

Rx-Sil

828668-901 828975-901 830668-901 827668-901 827975-901

829975-305 828975-305 828975-314 828975-309 828668-301 828975-301 827975-305 827975-314 827668-301 827975-301 824975-305 820700-905 828700-905 828700-914 827700-905 827700-914 824700-905 824700-914

820700-912 828700-912 827700-912 824700-912

828768-901 828700-901 827768-901 827700-901

63

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

采用RRHT可以实现快速高效分离
人参皂苷分析实例
DAD1 B, Sig=203,16 Ref=off (XIYANGSHENG\DEF_LC 2006-10-18 16-54-29\XYS000005.D) 70 60 50 mAU 40

Rg1/Re分离度:>2.0 >2 0

*DAD1 B, Sig=203,16 Ref=off (XIYANGSHENG\XIYANGSHEN 2006-10-18 19-00-50\XYS000013.D) *DAD1 B, Sig=203,16 Ref=off (XIYANGSHENG\DEF_LC 2006-10-18 16-54-29\XYS000005.D)

Rb1

mAU

RRHT- 放大图

70 30
20

60
0 50 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Rg1 R 10

Re

4.6x50mm, 1.8um, @ 25 °C

20 min
min

40

30

RRHT
20 10

4.6x150mm, 5um, @ 25 °C
HPLC

0 20 40 60 80 100

120 min min

64

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采用RRHT可以实现快速高效分离
三聚氰胺分析实例
Zorbax SB SB-C8 C8 4.6x250mm,5um

14min

Zorbax SB-C8 4 6x50mm 1 8um 4.6x50mm,1.8um

3min

65

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压力公式
粘度 viscosity 流速 flow 长度 length

ηFL ΔP = 0 2 2 K π r dp
specific Permeability column Radius 柱内径 particle Diameter 粒径
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66

RRHT的典型颗粒尺寸分布和优化设计分布的比较
Goal: Achieve lower backpressure vs. a typical PSD

Small amount of slightly larger particles 少量较大颗粒

Engineered PSD N Narrower PSD

Engineered Bimodal Distribution:
Lower level of fines 较少细微颗粒
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2

Only 3% compromise in resolution 25% gain in back pressure reduction
2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8

特别设计的双分布 :
分离度仅仅降低3% 反压降低25%
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Particle Size (um)
67

4.0

不同粒径分布的1.8μm SB-C18颗粒反压比较
300
Columns: ZORBAX SB-C18 Dimensions: 4.6 x 30mm, 1.8 μm 250 Eluent: 85:15 ACN:Water Flow Rates: 0.05 – 5.0 mL/min Temp: p 20°C 200 Sample: 1.0μL Octanophenone in Eluent Detection: UV 245nm Narrow 1.8 1 8μm – Narrow PSD

Pressure e (Bar)

150 100

25% HIGHER Pressure at Optim m Flow Optimum Flo (2.0 (2 0 mL/min)

Production 1.8μm – Wider PSD

System Pressure (No Column)

50 0 0 1 2 3 4 5

Fl Rate Flow R t (mL/min) ( L/ i )
68
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

使用RRHT色谱柱在新的RRLC系统上
-在更低的压力下得到了比竞争厂家W更好的分离能力
Rapid Resolution Column A l Time Anal. Ti
0.620 mAU 700 600 0.370 0 500 400 0.209 300 200 100 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 min

Competitor W Competitor W, 2.1 x 50mm,1.7um 0 914 min 0.914 i 3.50 0.18 – 0.30 %RSD

RRHT, SB-C18, 2.1 x 50mm, 1.8um 0 949 min 0.949 i 3.69 0.025 – 0.094 %RSD

Resolution Precision

Pressure
0.505 0.725 0.908 0.664 0.986 6

440 bar

700 bar (+60%)

Sample: Phenones Test Mix Flow Rate: 1ml Gradient: 35-95% ACN in 0.9min T Temperature: t 50° Injection volume: 1?l Injection Technique: ADVR, OI, MCO WL: 245nm D t R Data Rate: t 80Hz 80H
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69

0.821

高分离度快速液相色谱柱(RRHT)方法转化
z

降低色谱柱长 调整流速 调整进样体积 调整洗脱时间

z

z

z

70

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

缩短柱长
含有更小颗粒填料的更短的色谱柱 Selectivity选择性 Retention保留 Plates塔板数

Rs =
N∝

N

4
L

?

α-1 α

?

k' k'+1
N N P
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Column Length =

dp
Particle Size Particle Size = =

To Maintain Rs: e.g.: L/2
71

dp/2

保证柱长比粒径值一致 保证柱长比粒径值 致,则可以保证同样的柱效。 则可以保证同样的柱效 000990P2.PPT

“按比例缩小(scaling)” – 很容易的方法转换
– 不改变色谱柱的内径在方法转换中简单
易行
mAU 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min

Eclipse XDB-C18 4.6 x 150 mm, 5 um 6 ul inj.

红色 – 不需要改变的参数 蓝色 – 改变的参数

mAU 80 60 40 20 0 0 2

Rapid Resolution Eclipse XDB XDB-C18 C18 4.6 x 100 mm, 3.5 um 4 ul inj.
4 6 8 10

Sunscreens: 1 2 1. 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone hydroxy 4 methoxybenzophenone 2. Padimate-O 3. 2-ethylhexyl trans-4-methoxycinnamate 4. 2-ethylhexyl salicylate
12 14 16 18 min

mAU 60 40 20 0

Rapid Resolution HT Eclipse p XDB-C18 4.6 x 50 mm, 1.8 um 2 ul inj.
0 2 4 6 8 10 12

Mobile phase: ( 85:15) MeOH: water Flow = 1.0ml/min. LC: Agilent 1100

14

16

18

min

72

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改变色谱柱内径时流速需要相应地改变
F2 = F1 x(ID2/ID1)2
Column: 1.8 μm SB-C18 Mobile Phase:A: 0.1% TFA, , 5% MeCN, , (v/v) ( ) B: 0.08% TFA, 95% MeCN (v/v) Gradient: 0:12.5%B, 3.5:60%B, 4:60%B Sample: 0.1 mg/ml each x 0.5 ul injection Temp: 70?C Detection: 230 16 nm Ref=360,100 230,16 Ref=360 100 LC: Agilent 1100
Procainamide P i id Procaine Nadolol Pindolol Lidocaine Disopyramide py Propranolol Nifedipine Nimodipine Nisoldipine

3.0 x 50 mm, 1.8 μm F= 1 mL/min

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

min

4.6 4 6 x 50 mm, mm 1.8 1 8 μm F= 2 mL/min

0.5 0 5

1

1.5 5

2

2.5 5

3

3.5 3 5

4

min

73

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

进样体积转换
进样体积正比于柱体积

? Volumecolumn2 ? l 2 ? Inj.Vol.col.1 × ? = Inj.Vol. col. 2 ? ? Volume column1 ? ?
Zorbax o ba column co u volume o u e = 3.14 3 x r2 x L x 0 0.6 6 ( (r a and d L in c cm) )

? 0.4mlcolumn2 ? ? i.e. 20 μlcol.1 × ? ? = 4 μlcol. 2 ? 2.0ml column1 ? ?
74
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

梯度坡度与时间和流速
k’ (“K prime”)梯度坡度影响K*-与等度容量因子K’相当 提高K’或K*通常可提高分离度。可以分别通过降低溶剂强度或降低梯 度坡度来实现

? ( (End% - Start%) ) ? % Gradient G di t Slope Sl =? ? # Column Volumes ? ? ?
? (100% - 20%) ? i.e. 8% = ? ? 10 col. volumes ? ? ?
# column volumes= (Flow x Gradient Time) / column volume
柱体积个数 = (流速x梯度洗脱时间) / 柱体积

Zorbax column volume = 3.14 x r2 x L x 0.6 (r and L in cm)
75
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

时间转换
运行时间或梯度时间调整

? Length column2 ? ? = Time Time col.1 × ? col. 2 ? ? Length ? L th column1 ?
? 150mm ? i.e. 25min. × ? ? 250mm ? = 15min. ? ?

*assumes flow is proportional for columns 1 and 2
76
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

转换运行时间(梯度) 较短色谱柱 流速不提高
流速 进样体积 运行时间 梯度时间 = 进行相应转换 = 进行相应转换 =根据柱长相应降低 =根据柱长相应降低

长度变化 度
150 mm e.g. 15mins 50 mm 5mins 35-60% over 5mins
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=减小1/3

35-60% over 15mins
77

梯度转换:
ZORBAX SB SB-C18 C18分离BSA消化物肽谱
mAU 40 30 20 10 0 0 mAU 40 30 20 10 0 20

Original method 4.6 x 250 mm, 5 μm 50 μL inj.

Normalized view of RRHT to compare to original method

40

60

80

100

120

140

160min

RRHT 4.6 x 50 mm, 1.8 μm 10 μL inj.

mAU 40 30 20 10 0 0 20

original column min. %B 0 2 150 50 155 75 160 75 165 2

RRHT column min. %B 0 2 30 50 31 75 32 75 33 2

RRHT 4.6 x 50 mm, 1.8 μm 10 μL inj.
Mobile phase: A: 0.1% TFA B: 0.08% TFA in acetonitrile Flow =1 mL/min. gradient Temp. : 50 C Binary Pump Mixer installed
120 140 160min

40

60

80

100

78

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

方法转换软件

免费下载网址: http://intranet chem agilent com/Library/software/Public/AgilentMethodTranslator zip http://intranet.chem.agilent.com/Library/software/Public/AgilentMethodTranslator.zip
79
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欧亚甘草根部萃取物
-需要高分离度的色谱柱来对关键化合物进行定性定量
条件: Agilent 1200 RR LC 色谱柱: ZORBAX RRHT SB-C18, 4.6 x 150mm, 1.8um 流动相: A=1% 乙酸水溶液: B=1% 乙酸乙腈溶液 梯度: 5- 100% B in 30 min. 流速: 1.0 mL/min 温度:室温 检测器: MWD 254 nm 样品: 欧亚甘草根部提取物, 旋涡处理并在使用前滤膜过滤 Glycyrrthetin nic acid
30

Glycyrrhizic c acid

G
14.6 min

GA
25.5 min

Standards

0

5

10

15

20

25

min

G Li Licorice i Root R Extract E

14.6 min

Peak Capacity @ Rs 1.0 = 442

25.5 min

GA

0

5

10

15

20

25

30

min
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

80

Zorbax SB-C18(2.1x100mm, 1.8?m)分析BSA酶解肽谱
MW D 1 A, Sig =2 1 2 ,4 R e f=3 5 0 ,2 0 ( N EW D IG ES T1 05 0 6 2 1 X1 50 U \P EPM APN EW T RYP 2 7. D ) mAU 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5

Gradient time 20min

Peaks 477

5 MW D 1 A, Sig =2 1 2 ,4 R e f=3 5 0 ,2 0 ( N EW D IG ES T1 05 0 6 2 1 X1 50 U \P EPM APN EW T RYP 3 1. D )

10

15

20

25

min

mAU 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 5 MW D 1 A, Sig =2 1 2 ,4 R e f=3 5 0 ,2 0 ( N EW D IG ES T1 05 0 6 2 1 X1 50 U \P EPM APN EW T RYP 3 5. D ) mAU 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 5 10 15 20 25 min 10 15 20 25 min

30 min

535

45 min i

587

81

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

RRHT分析 分析“干净”样品具有超长的使用寿 干净 样品具有超长的使用寿 命
苯甲酮和类丙甲酮的分离度
Resol lution 2 1 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 Pl lates 10000 5000 0 0 2000 4000

苯甲酮的塔板数

Rs

塔板数)

进样次数

进样次数

注意: 压力为 585 bar
苯甲酮的峰宽
Peak k Width (10%)

色谱柱压力
Pre essure (bar) 600 400 200 0 0 2000 4000

0.006 0.004 0.002 0 0 2000 4000 PW (benz)

实际压力

进样次数

进样次数

82

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

高温高流速下色谱柱稳定性
Long Lifetime of RRHT Column at 80C
12000

10000

8000

Initial Plates 10,010

Plates

Final Plates 10, 089 Final Inj # 5425
Plates

6000

4000

2000

Column: Zorbax RRHT StableBond C18, 1.8 ?m Pressure at 80°C = 355 bar Column: 2.1 2 1 x 50mm, 50mm Flow Rate: 1 mL/min Mobile Phase: 40% ACN: 60% Water

0 1 499 718 853 988 1153 1305 1506 1641 1776 1911 2046 2181 2319 2508 2643 2778 2913 3085 3220 3468 3603 3738 3887 4054 4189 4324 4537 4756 4892 5033 5201
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Injection Number

83

RRHT分离蛋白样品( (“脏的 脏的”样品 样品)
Pressure vs. Injection #
150

140

色谱柱: ZORBAX RRHT SB-C18 2.1 x 30mm, 1.8 μm

130

在600次进样后,压力只增加了 8 bar!!
bar 120 End Press

110

100

90 0 100 200 300 Inj # 400 500 600 700

84

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

600bar RRLC在线过滤器和接头
Description RRLC In-line filter, 2 mm, max 600 bar Part number Porosity 0.2 祄 Frit Flow diameter rate 2 mm <1 mL/min Part number Replacement Frits 5067-1555 (10/pk)

5067-1551

?m

RRLC In-line filter, 4.6 mm, 5067-1553 max 600 bar

0.2 祄

?m

4.6 mm

1-5 mL/min

5067-1562 (10/pk)

孔径0.2 ?m筛板能够有效保护RRHT色谱柱 ?4.6mm/3.0mm ID的色谱柱可以配置P/N:5067-1553+筛板:P/N5067-1562 ?2.1mm ID色谱柱可以配置P/N:5067-1551 +筛板:P/N5067-1555 手紧式聚酮(Polyketone)色谱柱接头可耐 600 bar压力 PN: 5042-8957 (10/pk)

85

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

1100快速液相升级包

5188-5323

4.6 mm RRHT 1100 Fast LC Kit – VWD
- 0.17 mm capillaries, 80 ul mixer, 5 ul semi-micro VWD cell
- two 4.6 x 50 mm Zorbax 1.8 um columns

5188- 5324

4.6 mm RRHT 1100 Fast LC Kit – DAD
- 0.17 0 17 mm capillaries capillaries, 80 ul mixer, mixer 5 ul semi semi-micro micro DAD cell
- two 4.6 x 50 mm Zorbax 1.8 um columns

5188-5328

2.1 mm RRHT 1100 Fast LC Kit – MS/DAD
- 0.12 mm capillaries, 80 ul mixer, 1.7 ul micro DAD cell - 0.12 mm std ALS and WP ALS needle seats - two 2.1 x 50 mm Zorbax 1.8 um columns

86

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

在1100液相上采用升级工具包更新后
采用RRHT色谱柱减少分析时间可达95%
1

R (1 2) = 4 Rs(1,2) 4.8 8

2 3

4 6 x 250 mm 4.6 mm, 5 μm
N=21848 29.65 4 N=22680
15 20 25 30 min

0

1

2 3

5

10

Rs(1,2) = 3.5

12.71
4

4.6 x 100 mm, 3.5 μm
N=11691
15 20 25 30 min

.

0 1

2 3

5

10

N=6568 Rs(1,2) 4.15 4 N=6104
5

= 2.9
10

4.6 x 30 mm, 1.8 μm 1 mL/min
15 1 2 3 4 0.5 1 1.5 20 2 2.5 25 30 min 20 25 30 min

0

N=6463 2.09 N=6460
0 5

Rs(1,2) = 2.9
10

4.6 x 30 mm, 1.8 μm 2 mL/min

15

Columns: ZORBAX SB SB-C18 C18 Mobile Phase: 50% 20 mM NaH2PO4, pH 2 2.8: 8: 50% ACN Flow Rate: 1 mL/min Temperature: RT Detection: UV 230 nm Sample: 1. Estradiol 2. Ethinylestradiol 3. Dienestrol 4. Norethindrone
87
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

目前被USP接受的RRHT色谱柱
ZORBAX Eclipse Plus C18 Octadecyl y silane chemically y bonded to ZORBAX Eclipse XDB-C18 porous silica or ceramic microL1 particles, 1.5 to 10 ?m in diameter, or ZORBAX StableBond SB-C18 a monolithic rod ZORBAX Extend-C18 Extend C18 ZORBAX Eclipse Plus C8 Octylsilane chemically bonded to ZORBAX Eclipse XDB-C8 L7 totally porous silica particles, 1.5 to 10 ?m in diameter ZORBAX SB-C8 Phenyl groups chemically bonded to ZORBAX SB-Phenyl L11 porous silica particles, 1.5 to 10 ?m in diameter
The definitions of L1, L1 L7 and L11 – C18, C18 C8 and Phenyl – columns have been modified to include sub 2-micron particles! Agilent 1.8um choices are listed for each. This reduces resistance to trying the columns from those pharma and generic pharma companies i worldwide ld id th that tf follow ll th these methods. th d
88
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

提高液相分离速度 - 安捷伦色谱柱解决方案
采用新型填料技术色谱柱: 小粒径填料色谱柱 – 1.8um RRHT或3.5um RR 实心多孔层填料色谱柱 – Poroshell 300和Poroshell 120

89

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

为什么Poroshell可以实现快速分离?

分子在填料粒子中 最大的扩散深度被减小

90

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

Poroshell薄壳型液相色谱柱
-在普通液相上实现快速分离 Poroshell 300 ---适合大分子(>4000)快速分离 5um填料颗粒 填料颗粒
键合相:300StableBond-C18, 300Extend-C18, 300StableBond-C8, 300StableBond-C3

Poroshell 120 ---适合小分子(<4000)快速分离 适合小分子( )快速分离 即将 即将上市 市 2.7 um填料颗粒,比亚二微米填料压力低50%
键合相:120 120StableBond-C18, St bl B d C18 120St 120StableBond-C8, bl B d C8 120Eclipse 120E li Pl Plus-C18, C18 120Eclipse Plus-C8, 120Extend-C18

91

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

使用全多孔硅胶填料分离多肽/蛋白
--流速的影响
分离度降低
mAU 1000 800 600 400 200 0 0.25 mAU 1000 800 600 400 200 0 00 0.25 25 mAU 1000 800 600 400 200 0 0 0.25 mAU 1000 800 600 400 200 0 0 0.25

全多孔 SB-C18
(2.1 x 75mm, 5 ?m)

3 mL/min
0-100%B / 0.67 min
0.3 0.35 0.4 0.45

0.5 min
0.5

min

2 mL/min
0-100%B in 1 min
03 0.3 0 35 0.35 04 0.4 0 45 0.45 05 0.5

1 mL/min
0-100%B in 2 min
0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

1. 2. 3. 4.

神经降压素 核糖核酸酶 Lysozyme Myoglobin
min* min*

0.5 mL/min
0-100%B in 4 min
0.3

1
0.35

2

3

4

0.4

0.45

3 min
0.5 min*

Agilent 1100 WPS with AutoBypass; Piston Stroke: 20?L, Temp.: 70°C, Det.: 215 nm Mobile Phase: A= 95% H2O, 5% AcN with 0.1%TFA; B= 5% H2O, 95% AcN, with 0.07%TFA

? 使用全多孔颗粒时,随着流速增加,峰明显变宽。

92

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使用Poroshell色谱柱分离多肽/蛋白
--流速增加对分离度的影响
独特的选择性
mAU 1000 800 600 400 200 0 0.25 mAU AU 1000 800 600 400 200 0 00 0.25 25 mAU 1000 800 600 400 200 0 0 0.25 mAU 1000 800 600 400 200 0 0 0.25

不变的柱效和分离度

3 mL/min
0-100%B 0.67 min
0.3 0.35 0.4 0.45

Poroshell 300SB-C18
(2.1 x 75mm, 5?m)

0.5 0 5 min
0.5

min

2 mL/min
0-100%B 1 min
03 0.3 0 35 0.35 04 0.4 0 45 0.45 05 0.5

1 mL/min
0-100%B 2 min
0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

1. 2. 3. 4.

Neurotensin Rnase A Lysozyme Myoglobin
min* i * min*

0.5 mL/min
0-100%B 4 min
0.3

1

2
0.35 0.4

3
0.45

4

3 min
0.5 min*

Agilent 1100 WPS with AutoBypass; Piston Stroke: 20?L, Temp.: 70°C, Det.: 215 nm Mobile Phase: 95% H2O, 5% AcN with 0.1%TFA; B= 5% H2O, 95% AcN, with 0.07%TFA ?使用A= Poroshell 色谱柱,随着流速增加,分离度没有变化。

93

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Poroshell快速分析β淀粉酶

P Poroshell h ll在2分钟内同样能将杂质与β淀粉酶很好地分开
94
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Poroshell能在1分钟之内快速高效分离蛋白质和肽

只有Poroshell能在高流速下高效地分离蛋白质和肽!
95
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Poroshell快速高分离度分析BSA酶解产物

96

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安捷伦其它色谱柱

97

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安捷伦凝胶色谱柱
GPC(凝胶渗透)色谱柱 ? PLgel系列 ? Zorbax PSM S “S”系列 GFC(凝胶过滤)色谱柱 ? PLaquagel-OH系列 ? Zorbax PSM S 系列 ? Zorbax GF-250/450(筛分蛋
白和其他生物大分子的理想凝胶柱)

? 多种分子量范围选择 ? 提供相应保护柱 ? 宽分子量范围混床柱适合未知样品分 子量初步确定

98

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Zorbax SAX和SCX离子交换柱
? 基于稳定可靠的Zorbax硅胶基质,永久 键合的季胺或磺酸基 ? 对于水溶性小分子化合物和生物大分子 提供高效分离 ? 与有机改性剂兼容 ? Bio-SCX II系列专门为优化多肽和蛋白质 的2D LC/MS分离而设计,具有极强的保留 分离而设计 具有极强的保留 性能和良好的峰形

99

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Zorbax SCX用于三聚氰胺分析
(国标快速方法GB/T 22400-2008)
色谱柱:ZORBAX 300SCX

标准样品色谱图 (5ppm)

4.6×250mm,5um 检测 240nm; 检测: 流速:1.5mL/min; 柱温: 30℃; 进样量:10μL; 流动相:50mM 磷酸盐缓冲液 (pH3.0):乙腈=60:40

样品色谱图 (溶液浓度2.27ppm;样品含量 7.57 mg/kg)

100

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手性柱
ChiraDex
β-环糊精键合到多孔硅胶颗粒上 —— USP L45 应用:巴比妥酸盐,苯并噻唑,钙拮抗剂,PTH-氨基酸

Ultron
ES-OVM 键合卵类粘蛋白 —— USP L57,附方法开发指南 应用:分离药物对映异构体,比如己基巴比妥,布洛芬和普罗吩胺,氟苯氧丙 离 物 体 布 普 氟 氧 胺、氯曲米通、cloperastin的对映体。 ES-Pepsin 键合胃蛋白酶 应用:最适合于分离其它色谱柱难分离的碱性化合物。药物,多肽, eperisone,敏克静。

101

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特殊应用色谱柱
氨基酸分析 ? Eclipse AAA 糖分析柱 ? Zorbax糖分析柱 寡核苷酸分析柱 ? Zorbax Oligo g ( (IEX/RP色谱柱) 多环芳烃分析柱 ? Eclipse PAH

102

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安捷伦全系列制备柱
Agilent Prep
颗粒 – 5,10um 表面积 – 400 m2/g 孔径 – 100? 碳载量 C18 – 24% 固定相 – C18, C18 Silica 内径 – (4.6), 21.2, 30 and 50 mm和散 装填料 pH范围 范围 – 2~10 (C18), 1~8 (Silica)

ZORBAX
颗粒 – 5, 7um 表面积 – 180 m2/g 孔径 – 80?, 300? 碳载量 – Eclipse XDB-C18 – 12% 固定相 – 所有ZORBAX分析柱的键合相 (反相、正相、GF、离子交换) 内径– 9.4mm 和 21.2mm

103

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安捷伦新一代反相色谱柱 — Agilent TC(2)/HC(2)

104

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Agilent g e t TC-C18(2)&HC-C18(2) C C 8( )& C C 8( )液相色谱柱
硅胶颗粒 高纯度, 高比表面积 (290m2/g) , 孔径170? 非ZORBAX 硅胶颗粒 键合相:两种C18键合相 TC-C18(2), 常规碳载量(12%) HC-C18(2), ( ), 较高碳载 较高碳载量( (17%) ) 规格 4.6×250mm, 4.6×150mm, 5μm

105

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Agilent TC-C18(2)&HC-C18(2)液相色谱柱
? 新一代TC(2)/HC(2)色谱柱对于碱性和酸性化合 物都能提供优异的峰形。 ? 与其它厂商的色谱柱相比,TC(2)/HC(2)峰形更 佳,柱效更好。 ? TC(2)与HC(2)的选择性略有不同。

106

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

不同色谱柱的酸性/碱性/中性化和物测试
mAU 160 140 120 100 80 60 40 20 0 mAU 160 140 120 100 80 60 40 20 0

1 Tf2=1.07 3 2
5

4 5
10

N=12949 6
15 20 25

TC-C18(2) 7 Tf7=1.26
30 min

1 Tf2 0 96 3 Tf2=0.96 2
5 10

4

N=12250 5
15 20 25

HC C18(2) HC-C18(2) 7 Tf7=1.17
40 min

6
30 35

mAU 140 120 100 80 60 40 20 0
mAU A 120 100 80 60 40 20 0

1 Tf=1.58 3 2
5

4 5
10 15 20 25

N=13761 6
30 35

SYMMETRY-C18 7 Tf=1.74
40 min

测试条件: A- 20 mM KHPO4 pH 7 B- Methanol 35%A/65%B 23°C, 1.0 ml/min 254 nm Injection: 2ul 测试标样: 1.Uracil 2.普萘洛尔 3.Butyl Paraben 4 邻苯二甲酸二丙酯 4. 5.萘 6.Acenaphthene 7.阿米替林

1 Tf=1.42 2 1
5

3

4 5
10 15 20 25

N=13196 6
30 35 40

CAPCELL-PAK 7 Tf=1.54
45 min

mAU 100 80 60 40 20 0

Tf=1.29 2

3 5
10

4

N=10749 6
20 30 40

LUNA-C18(2) 7 Tf=1.28
50 min

107

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不同色谱柱的酸性/碱性/中性化和物测试
Norm. 140 120 100 80 60 40 20 0
Norm. 120 100 80 60 40 20 0 mAU 100 80 60 40 20 0 Norm. 140 120 100 80 60 40 20 0

1 Tf2=1.72 2 1 3
10

4 5
20 30

N=14183 6
40

KROMASIL-C18 7
50

Tf=3.36
min

Tf2=1.30 2 3 1
10

4

5
20 30

N=11098 6
40 50 60

INERTSIL-ODS(3) 7
70

Tf 1 72 Tf=1.72
min

Tf2=1.21 3 2 1 Tf2=1.66 2 1 3 4 5,2 1 Tf7=1.14 3 2
10
10

4
20

N=10756 5
30 40

DIAMONSIL-C18 7
50 60 70

6 N=12283 6

Tf7=1.45 Tf7 1.45
min

3
10

4

5
20 30

7
40 50 60

SINOCHROM ODS Tf7=3.68
70 min

mAU 160 140 120 100 80 60 40 20 0 mAU 120 100 80 60 40 20 0

N=12121 6
20

Basic compounds 2 and 7 were adsorbed.
40 60 80

HYPERSIL-ODS(2) 7 Tf7=5.80
100 min

4,5

N=16849 6
20 30 40 50

YMC-PACK Pro C18 7 Tf7=3.28
60 min

108

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TC(2) 和 HC(2) 对碱性化合物具有最好的峰形
可以从对称的峰形获得什么?— 更高柱效、更高灵敏度
HC-C18(2) HC C18(2) TC-C18(2) LUNA-C18(2) DIAMONSIL-C18 CAPCELL-PAK INERTSIL-ODS(3) SYMMETRY-C18 YMC PACK P YMC-PACK Pro C18 KROMASIL-C18 SINOCHROM ODS HYPERSIL-ODS(2) 0.0
Tf 阿米替林 Tf 普奈洛尔

USP 拖尾因子最接 近1.0, 表示最对称 的峰形。

1 0 1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

Tf

109

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不同色谱柱的操作压力比较
Diamonsil C18 Inertsil ODS(3) Hypersil ODS(2) TC C18(2) Capcell-Pak Capcell Pak Luna C18(2) HC C18(2) K Kromasil il C18 SinoChrom ODS Symmetry C18 YMC pack pro C18

0

50

100 压力(bar) 力( )

150

200

流动相: 65% methanol, 35% phosphate pH7.0

110

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不同色谱柱用于熊果酸和齐墩果酸分析比较
色谱条件 色谱柱: 流动相: 流速: 温度: 检测波长: 进样体积: 4.6×250mm, 5μm 10% 0 0.03M 03M 磷酸盐, pH 3.0 30 90% ACN 0.5ml/min 0 5ml/min 25℃ 214 214nm 5ul

111

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

不同色谱柱用于熊果酸和齐墩果酸分析比较
2

Luna C-18 Dikma Diamonsil C-18

1

样品: 对照品 1.齐墩果酸 2.熊果酸

? HC-C18对难分离物质具有 很好的分离度 最好的分离度

Intersil ODS3 Alltech Apollo C-18 Agilent HC C-18
0 5 10 15 20 25 30 35 min

最高的柱效

色谱柱 Agilent HC C-18 Allt h Apollo Alltech A ll C-18 C 18 Intersil ODS3 Dikma Diamonsil C-18 Luna C-18
112

分离度1,2 1.76 1 59 1.59 1.24 1.12 1.32 熊果酸 21056 17670 14050 11699 18711

理论板数 齐墩果酸 20986 18123 14109 12017 18570
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不同色谱柱用于熊果酸和齐墩果酸分析比较
Luna C-18 Dikma Diamonsil C-18 Intersil ODS3 1 2

1

2

样品: 六味地黄丸 1.齐墩果酸 2.熊果酸
2

? HC-C18对难分离物质具有 很好的分离度 最好的分离度

1

Alltech Apollo C-18

1 2 1 2

最高的柱效

Agilent HC C-18

15

20

25

30

35

min

色谱柱 Agilent HC C-18 Alltech Apollo C-18 Intersil ODS3 Dikma Diamonsil C-18 Luna C-18
113

分离度1,2 1.70 1 70 1.67 1.30 1.17 1.31

理论板数 熊果酸 齐墩果酸 20094 18085 15716 13137 17050 21148 20114 14798 12476 18705
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Agilent HC-C18色谱柱批与批之间的重现性
2

保留时间RSD (%) 1 0.24 2 0.28

1

色谱条件 色谱柱: 流动相: 流速: 温度: 检测波长: 进样体积: 样品:
Rs 1.72 Rs 1.76 Rs 1.76

Agilent HC C-18 4.6×250mm, 5μm 10% 0.03M 磷酸盐, pH3.0 90% ACN 0 0.5ml/min 5ml/min 25℃ 214nm 5ul 1 齐墩果酸 2. 1. 2 熊果酸

A B

? 极佳的重现性说明生产工艺的稳定性 ? 同时保证了方法的重现性

C
5 10 15 20 25 30

min

114

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不同色谱柱用于人参皂苷Rg1,Re,Rb1分析的比较
样品: 1. Rg1 2. Re 3. Rb1;色谱条件 参照中国药典2005年版方法
Rs1,2 = 2.27 2 27
1 2

? 最佳的分离度 ? 梯度条件下基线较平稳
3

Agilent TC C18

30

40

50

60

70

80

90

100

110

min

Rs1,2 = 1.44

1 2

基线漂移
3

Diamonsil C18

30

40

50

60

70

80

90

100

110

min

1

Rs1,2 = 1.97

2 3

Apollo C18

30

40

50

60

70

80

90

100

110

min i

115

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

不同色谱柱用于人参皂苷Rg1,Re,Rb1分析的比较
样 : 1. Rg1 2. Re 3. Rb1;色谱条件 样品 色谱条件 参照中国药典 参 中 典2005年版方法 年版 法
1 2 3

Rs1,2 2.23 2 23

Kromasil C18

30

40

50

60

70

80

90

min

1

2

Rs1,2 2.26

基线漂移
3

Hypersil ODS-2

30

40

50

60

70

80

90

min

1 2

基线漂移
Rs1,2 1.66
3

Inertsil ODS-3

30

40

50

60

70

80

90

min

116

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人参样品,条件参照中国药典

Rb1 Rg1 Re

TC-C18(2) column with Gradient condition condition,detect detect at 203nm
117
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

中药双黄连口服药
mAU

1
600 500 400 300 200 100 0 2 4 6 8

Agilent TC-C18(2)

N=17178; Tf=1.08; Rs1,2=2.15 2

Sample: Shuanghunaglian Granules 1. 绿原酸 2. 杂质

10

min

HPLC Conditions Column: 4.6×250mm, 5μ Mobile Phase: 85% 0.4% Phosphoric acid ; 15% ACN Flow Rate: 1.0ml/min Temperature: 30℃ UV Detection: 327nm

mAU 700 600 500 400 300 200 100 0 2 4 6 8 10 min

N=17477; Tf=1.04; Rs1,2=2.27

Agilent HC-C18(2)

Injection volume: 10ul

118

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

银杏内酯的分析
ELSD
mV 30

1

25

20

1.白果内酯 1 2.银杏内酯A 3.银杏内酯B 4.银杏内酯C
2 3

15

10

4
5

0 0 5 10 15 20 25 min

TC-C18(2),150mm,20%THF/MeOH(10/25) 80% water, isocratic,1ml/min
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

119

Agilent TC-C18色谱柱分离头孢菌素类药物
1 2 4 5 3 Agilent TC C18, 4.6×250mm, 5μm (P/N:5189925-902 5189925 902) 流动相: A:乙腈, B: 50mM 磷酸二氢钾, 时间 (min) A% B% 0 4 96 20 18 82 流速: 1 ml/min 柱温: 25℃ 检测波长: 254 nm 进样: 5 ul 色谱柱:

色谱条件:

样品: ?头孢羟氨苄 ?头孢拉定 ?头孢唑啉 ?头孢硫脒 ?头孢哌酮

120

How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

Agilent TC-C18色谱柱分离十四种磺胺类药物
mAU 80

磺胺胍、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲 氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺异恶唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺硝苯
Sulfaguanidine Sulfadiazine Sulfathiazole Sulfapyridine
2.902 7.813 8.700

Sulfameter Sulfamethazine

Sulfisoxazole Sulfadimethoxine Sulfaquinoxaline
20.816

Sulfanitran

Sulfamethoxypyridazine
24 4.862 25 min

60

Sulfamerazine
9.182

Sulfachloropyridazine S lf Sulfamethoxazole th l
17.990

10.308

15.385

13.461

20

0 0 5 10 15 20

65%B; 25min, 65%B; 27min, 95%B, 34min, 95%B

色谱条件: 色谱柱 色谱柱: A il t TC C18,4.6 Agilent 4 6×250mm, 250 5μm(P/N:5189925-902 5189925 902) 流动相: A: 0.2% HAc,B:甲醇 ;0-3min,10%B; 4min, 20%B; 8min, 20%B; 15min, 30%B; 17min, 45%B; 19min,45%B; 24min, 流速: 1ml/min 检测波长:275nm 柱温: 30℃ 进样量: 20μl
How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

121

14.396 1

16.135

40

12.877

21.527

奶粉原料中水溶性维生素分析
色谱柱:Agilent TC C-18 250X4.6mm 流动相: 色谱柱 流动相 A 0.1%TFA Water B ACN 0~4min 5%B; 4~6min 25% B; 6~10min 25%B 后运行时间:5min 柱温:25 ℃ 流速:1ml/min 检测波长:280nm±4 nm 参比:500nm±100nm
mAU AU 35

Folic acid

30

VB3
25

VB2 VB6

20

15

VB1

10

5

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min

? 峰形尖锐、对称,分离度好 ? 未使用离子对试剂, TC C-18 色谱柱对极性组分也能提供较好的保留 ? 方法重复性比使用离子对试剂更好
122
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Agilent TC-C18 色谱柱对食品饮料中的防腐剂的测定
标准样品
1 苯甲酸 3 对羟基苯甲酸甲酯 5 对羟基苯甲酸丙酯 2 山梨酸 4 对羟基苯甲酸乙酯

酱油中的防腐剂
苯甲酸

果汁奶饮料中的防腐剂

山梨酸

色谱条件: 色谱柱: Agilent TC C18, 4.6×250mm, 5μm (P/N:5189925-902) 流动相: A:乙腈, B: 20mM 乙酸胺, pH 4 时间 (min) A% B% 0 30 70 8 60 40 12 90 10 17 90 10 流速: 1 ml/min 柱温: 30℃ 检测波长: 时间 (min) 波长 0 5.8 6.4 5 ul 260 nm 230 nm 260 nm
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进样 进样:
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Agilent TC-C18 色谱柱对食品饮料中的甜味剂的测定
标准样品
1. 2. 3. 乙酰磺胺酸钾 糖精钠 阿斯巴甜 色谱条件: 色谱柱: Agilent TC-C18, 4.6×250mm, 5μm (P/N:5189925-902) 流动相: A:乙腈, B: 20mM NaH2PO4/H3PO4, pH 2.5 时间 (min) A% B% 0 15 85 6 30 70 10 85 15 流速: 1 ml/min 柱 柱温: 30℃ 检测波长: 214 nm 进样: 20 ul

果汁饮料中的甜味剂
糖精钠

乳饮料中的甜味剂
乙酰磺胺酸钾

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Agilent HC-C18 色谱柱对食品中着色剂的测定
pH = 2.2 时 峰形尖锐且具有很好的分 离度

色谱柱:Agilent HC-C18 5um, 4.6mm(i.d)×250mm,p/n 518905-902 流动相A: Water (5mM NH4OAc) 调节pH至4.5,B: Methanol 梯度:0-7min 15%-35% B;7-12 min 35%-98% B;12-18min 98% B;Post run 5 min 流速1 mL/min 检测波长254 nm
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Agilent HC-C18分离羰基-DNPH 衍生物 (EPA TO-11 )
mAU 2 0 250 200 150 100 50 0 5 10 15 20 25 min

1

2

3

4

5

6

7

89

10

11

12

13

特点:

1. 高分离度, 尖锐的峰形, 1 尖锐的峰形 Agilent HC-C18 HC C18表现出了很好的分离性能 2. 环境样品,对于非极性衍生物,Agilent HC-C18是理想的选择

色谱柱: Agilent HC-C18, HC C18, 4.6 x 250mm, 5um 流动相: 溶剂 A:水 B:乙腈 梯度:开始60% B, 30 min 75% B, 35 min 100% B 流速: 1 mL/min 检测器: UV 230 nm 温度: 35?C 样品: 10 ul 进样 样品: DNPH 衍基衍生物 (Supelco 标准品s) (1) 甲醛-2,4-DNPH (2) 乙醛-2,4-DNPH (3) 丙烯醛-2,4-DNPH (4) 丙酮-2,4-DNPH (5) 丙醛-2,4-DNPH (6) 丁烯醛-2,4-DNPH (7) 异丁烯醛-2,4-DNPH (8) 2-丁酮-2,4-DNPH (9) 丁醛-2,4-DNPH (10) 苯甲醛-2,4-DNPH (11) 戊醛-2,4-DNPH (12) p-甲苯 甲醛-2,4-DNPH (13) 己醛-2,4-DNPH

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