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东北红豆杉枝叶生长时期变化规律研究


中华人民共和国教育部 东北林业大学









论文题目:东北红豆杉枝叶生长时期变化规律研究 学 生: 指导教师: 学 院: 专 业:

2009 年 6 月

东北林业大学

毕 业 论 文 任 务 书<

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论文题目 东北红豆杉枝叶中有效成分空间分布及生长时期变化规律 指导教师 专业 (班级) 学 生

2008 年 12 月 22 日

题目名称: 题目名称 东北红豆杉枝叶中有效成分空间分布及生长时期变化规律

任务内容(包括内容、计划、时间安排、完成工作量与水平具体要求) 任务内容(包括内容、计划、时间安排、完成工作量与水平具体要求) 内容: 内容: 1、总结东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量变化规律; 2、总结不同生长时期(休眠期、花期及果期)东北红豆杉枝叶中两种有效成分含量变 化规律。 时间安排: 时间安排: 2008 年 11 月-2008 年 12 月 2009 年 3 月-2009 年 4 月 2009 年 4 月-2009 年 5 月 2009 年 5 月-2009 年 6 月 完成工作量与水平要求: 完成工作量与水平要求: 在规定时间内完成实验内容规定的所有项目,达到国家统一要求的学士学位论文水平 其中,参考文献篇数:20 篇以上(其中外文文献 3 篇以上) 论文字数: 10000 字以上 查找相关文献,搜集相关资料 完成实验部分 整理实验数据 撰写毕业论文

专业负责人意见

签名: 年 月 日

东北红豆杉枝叶中有效成分空间分布及生长时期变化规律
摘 要
东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb. et. Zucc.)是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属植物, 是我国东北分布的珍贵第三纪孑遗树种、国家 I 级重点保护的野生濒危植物种类。紫杉醇 (paclitaxel,商品名 taxol)及三尖杉宁碱(cephalomannine)均为红豆杉属植物中含有的 二萜类化合物,具广谱抗肿瘤活性和独特的抗癌作用机理。 本实验探讨了不同部位、不同生长时期东北红豆杉枝叶中的紫杉醇和三尖杉宁碱含量 的分布规律,结果表明多数树冠部位的当年生枝叶中两种物质的含量低于两年生和三年生 枝叶,而两年生和三年生枝叶中两种物质含量差异不显著;阳面树冠的 3 个层次的两种物 质含量无明显差异,阳面的含量稍高于阴面。天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇含量在 休眠期达到最高,花期和果期含量无太大差异;三尖杉宁碱含量在休眠期也最高,部分植 株的当年生枝叶中三尖杉宁碱含量为花期低于果期,但有个别植株中二者含量差异不显 著;每个植株个体之间紫杉醇和三尖杉宁碱含量均差异显著。 关键词:东北红豆杉;紫杉醇;三尖杉宁碱;超声提取;HPLC 关键词:

Variation in Paclitaxel and Cephalomannine contents in nature Japanese yew
Abstract
The Japanese yew (Taxus cuspidata Sieb. et. Zucc.) is a survivor tertiary species and national level endangered species which belongs to Taxaceae. Paclitaxel and cephalomannine are both diterpenoid in Taxus with special anticancer mechanism and antitumous activity. This experiment have determined the paclitaxel and cephalomannine contents in branches and leaves of Japanese yew in different parts and periods. The results indicated that most parts of paclitaxel and cephalomannine contents in branches and leaves of current year were lower than those of biennial and perennial, but paclitaxel and cephalomannine contents in branches and leaves had no conspicuous difference between biennial and perennial; there were no conspicuous difference in three hierarchical,but the contents of the two materials in sunny side were slightly higher than the overcast side. Paclitaxel contents of current branches and leaves were highest during dormancy stage, but it had no signficant difference between flower season and fruit season. The contents of cephalomannine was highest during dormancy stage too, and the cephalomannine contents in flower season were lower than fruit season of parts of samples trees, but some had no significant difference, individual variation was significant. Key words: Taxus cuspidata; paclitaxel; cephalomannine; ultrasonic extraction method; HPLC





摘要 Abstract 1 绪论 ............................................................................................................................................. 1 1.1 植物次生代谢 .......................................................................................................................... 1 1.2 东北红豆杉 .............................................................................................................................. 1 1.2.1 东北红豆杉生物学特征 ....................................................................................................... 1 1.2.2 东北红豆杉资源的利用价值 ............................................................................................... 2 1.2.3 东北红豆杉资源及现状 ....................................................................................................... 2 1.3 紫杉醇和三尖杉宁碱 .............................................................................................................. 3 1.3.1 东北红豆杉枝叶中的化学成分 ........................................................................................... 3 1.3.2 紫杉醇 ................................................................................................................................... 3 1.3.3 三尖杉宁碱 ........................................................................................................................... 4 1.3.4 研究进展 ............................................................................................................................... 5 1.4 立题依据 .................................................................................................................................. 6 2 实验材料及方法 ......................................................................................................................... 7 2.1 实验材料 .................................................................................................................................. 7 2.2 仪器与试剂 .............................................................................................................................. 7 2.2.1 仪器………….. ................................................................................................................. ….7 2.2.2 试剂 ........................................................................................................................................ 7 2.3 实验方法 .................................................................................................................................. 7 2.3.1 样品制备 ............................................................................................................................... 7 2.3.2 色谱条件 ............................................................................................................................... 8 2.3.3 标准溶液配制 ....................................................................................................................... 8 2.3.4 标准曲线绘制 ....................................................................................................................... 8 3 结果与分析 ................................................................................................................................. 9 3.1 天然东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 .................................. 9 3.1.1 天然东北红豆杉不同树冠部位叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 ................................... 9 3.1.2 天然东北红豆杉不同树冠部位枝中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 ................................. 10 3.2 天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 ............ 10 3.2.1 当年生叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 ......................................... 10 3.2.2 当年生枝中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 ......................................... 12 4 讨论 ........................................................................................................................................... 14 4.1 天然东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量 ................................ 14 4.2 天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律 ............ 14 5 结论 ........................................................................................................................................... 15 参考文献 致谢

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不同部位和季节东北红豆杉枝叶中有效成分含量变化
1 绪论

1.1 植物次生代谢
植物的次生代谢(plant secondary metabolism)是相对于初生代谢而言的,这个概念 最早是由 Kossel 于 1891 年明确提出的[1]。绿色植物及藻类因为有叶绿素,可以通过光合 作用将二氧化碳和水转化成糖类,并放出氧气,生成的糖则进一步通过不同途径(如磷酸 戊糖途径,糖酵解途径,三羧酸循环) ,产生核酸合成的原料如核糖等,脂类合成的原料 如丙二酸单酰辅酶 A(malmyl CoA)等,并通过固氮反应得到一系列的氨基酸(合成肽 和蛋白质的重要原料) ,此过程因为对维持植物生命活动过程来说是不可缺少的,且几乎 存在于所有的绿色植物中,故习惯上称为初生代谢(primary metabolism) ,相应地糖、蛋 白质、 脂类和核酸等这些对植物有机体生命活动来说是不可缺少的物质, 则称为初生代谢 [2] 产物(primary metabolites) 。次生代谢产物在植物中的合成与分解过程称为植物次生代 谢[3]。 次生代谢产物包括生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类和有机酸等。它在维护 植物自身的生存和发展具有重要的作用。我国植物种类繁多,植物资源丰富,对植物次生 物质对植物自身作用的研究, 除学术价值外, 对这些次生物质的进一步开发利用也极具启 [4] 发指导意义 。

1.2 东北红豆杉
东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb. et. Zucc.)是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属植物, 又名紫杉、赤柏松,是我国东北分布的珍贵第三纪孑遗树种、国家 I 级重点保护的野生濒 危植物种类[5],起源于古老的第三纪,曾广泛分布于北半球,第四纪冰川时期其分布范围 大大缩小。亿万年来,地质构造的运动和地势地形的变化,使一部分红豆杉在特殊的环境 中得以保留下来,形成了明显的地理种群隔离。由于红豆杉种群竞争力弱、天然更新缓慢 和地理分布局限等客观因素, 导致红豆杉属植物早在 20 世纪 80 年代就被列入国家Ⅱ级保 护植物。90 年代以来,随着抗癌新药紫杉醇的开发利用,红豆杉原料供需矛盾日益突出, 人类掠夺式的生产经营活动,加剧了其濒危程度,1999 年我国将红豆杉属物种列入Ⅰ级 保护植物。红豆杉被称为植物王国里的“活化石”,是世界珍稀树种[6]。

1.2.1 东北红豆杉生物学特征
东北红豆杉为常绿乔木,高 10~17 m,胸径 10~13 cm,树冠倒卵形或宽卵形,大枝 平展。树皮红褐色或灰红褐色,片状剥裂。叶条形,有短柄,生于主枝上者为螺旋状排列, 生于侧枝上者叶柄基部左右扭转,成不规则羽状排列,约成 45°角斜展,柔软,先端凸尖, 基部渐狭, 上面光绿色, 下面灰绿色, 两面中脉隆起, 背面有两条灰绿色气孔带, 1.5~2.5 长 cm,宽 2 mm 左右。枝互生,幼时深绿色,老时红褐色。雌雄异株;球花单生于前年枝
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的叶腋;雄蕊 6~14 枚,集生成头状,花药 5~8 裂,淡黄色;雌花具 1 胚珠,卵形淡红色。 种子坚果状,卵圆形稍扁,有 2~3 条棱线,红褐色,有光泽;假种皮杯形,淡红色。肉 质,富浆汁,基部有数对黄色鳞片。花期 5~6 月,果期 7~8 月,种子 9 月成熟[7-9]。 东北红豆杉性喜凉爽湿润气候,幼树时喜荫庇,7~8 年后喜光,抗寒性强,可耐-30℃ 以下的低温,最适温度 20℃~25℃,属阴性树种。喜湿润,怕涝,适于疏松、微酸性、湿 润(土壤含水率 40%~60%) 、排水良好的砂质土壤,忌积水和沼泽地。种子发芽后幼苗生 长较慢。4 月中旬芽开始膨大,4 月下旬为芽的开放期,5 月上、中旬为新芽展叶期,老 叶脱落更新多在 5~6 月[10]。

1.2.2 东北红豆杉资源的利用价值
1.2.2.1 药用价值 东北红豆杉提取物中的主要化学成分具有多种药用价值,其中紫杉醇等紫杉烷二萜类 次生代谢产物具有独特机理的抗癌作用,被认为是癌症治疗的重大进展之一,对食道癌、 肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌[7]、鼻咽癌、膀胱癌、前列腺癌及急性白血病有特殊的防治 效果,特别是对晚期卵巢癌和转移性乳腺癌治愈率达33%,总有效率在75%以上[9],对大肠 癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、头颈部口腔癌[11]也有一定疗效,据报 道紫杉醇还可用于治疗若干种慢性炎症性疾病,其中包括继发性进行性多发性硬化症、风 湿性关节炎以及外用治疗牛皮癣和特应性湿疹等[12]。 除此之外,有报道证明红豆杉属植物具有利尿、通经、降血糖、降血压、杀虫止痒的 作用,对糖尿病、肾病、风湿病、肠胃病、糖尿病等有独特疗效[13]。 1.2.2.2 重要的用材树种 东北红豆杉木材纹理均匀,材质致密芳香,韧性强,坚硬,弹性大,具光泽,耐蚀性 强,比重约0.51~0.76,是著名的上等工业用材和家具用材,力学性质测试表现其干燥时不 翘不裂。可供雕刻、制作玩具、文具、船桨及美术工艺品等细加工制品用[14,15]。 1.2.2.3 绿化树种 红豆杉属植物树型端正优美,枝叶茂密,叶片常年翠绿,种子生于肉质红色假种皮中, 酷似红豆,鲜红夺目,点缀在绿叶丛中令人陶醉。可在植物园、公园、风景区、自然保护 区、居住环境区等绿地广泛种植,可孤植或群植,又可植为绿篱,适合于修剪为各种雕塑 物式样。由于其生长缓慢,枝叶繁多而不易枯疏,故剪后可较长期保持一定形状,应用矮 化技术处理的东北红豆杉盆景造型古朴典雅,枝叶紧凑而不密集,舒展而不松散,红茎、 红枝、绿叶、红豆使其具有观茎、观枝、观叶、观果的多重观赏价值。而且红豆杉既耐寒、 常绿,又有极强的耐荫性,所以是高纬度地区园林绿化的良好材料[10,14]。 1.2.2.4 其他利用价值 东北红豆杉果食成熟后味蜜甜,可直接食用或开发罐头等绿色食用产品,其果实有 驱蛔虫、消积食等药用效果。其种子可榨油,心材可生产一种燃料[14]。 综上,东北红豆杉不仅仅具有很高的药用价值,可应用于多种癌症临床的治疗,而 且具有一定的经济价值、生态价值、社会价值及文化价值。

1.2.3 东北红豆杉资源及现状
东北红豆杉的自然地理分布区大致可分为欧亚陆块主体和邻近各岛屿两个部分,其 大致的地理范围为:123°~155°E,32°30′~53°N,垂直分布于海拔 250~1200 m 之间。欧 亚陆块主体分布区主要包括:中国东北,朝鲜北部,俄罗斯阿穆尔边疆;邻近岛屿分布 区包括:俄罗斯萨哈林岛、日本岛和朝鲜济州岛等[16]。我国东北红豆杉多生于红松、鱼
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鳞云杉、白桦、紫椴和山杨等为主的针阔混交林内,分布海拔 600~1200 m,主产于吉林 省长白山区,即吉林安图、汪清、和龙、抚松、浑江、长白及通化地区。向南延伸至辽 宁省东部山区的宽甸、桓仁、凤城和岫岩等地。向北延伸至黑龙江省张广才岭东南部, 老爷岭山区,小兴安岭南部的宁安、东宁、鸡西、绥棱等地[8]。其自然地理区域位于千 山山脉走向线及其东南侧,长白山山脉走向线及其东南侧,经老爷岭至小兴安岭南端与 产于我国的本属其他种类构成间断分布形式[17]。 目前,东北红豆杉资源严重不足,可利用的野生资源十分有限,人工繁殖栽培的技术 也有限,相当一部分人缺乏必要的扦插繁育技术,盲目扦插,不仅导致繁育失败,而且造 成了野生资源的浪费,使东北红豆杉野生资源日趋濒危,难于满足生产需要。我国的红豆 杉资源开发研究起步较晚,研究力量弱也很分散,设备不足、资金短缺。 综上,由于其特殊的繁殖生物学和生态学特性、种群结构不合理及原生生境破坏较严 重,致使东北红豆杉种群处于濒危状态,因此,在对其进行研究、开发、利用的同时,应 着力加强保护。保护的措施包括:严禁盗采盗伐东北红豆杉;对天然种群分布相对集中的 区域应建立围栏进行封育管理;对东北红豆杉母树集中的区域进行适当的林下植被清理, 增加天然下种的机会等[16]。

1.3 紫杉醇和三尖杉宁碱
1.3.1 东北红豆杉枝叶中的化学成分
到目前为止, 从东北红豆杉枝叶中分离得到了紫杉烷类二萜化合物、 倍半萜类化合物、 甾体类化合物、木脂素类化合物、黄酮类化合物、糖苷类化合物及其它类化合物等多种成 分[18],多数物质是通过植物次生代谢途径而生成,其中最重要的成分是紫杉醇和三尖杉 宁碱。

1.3.2 紫杉醇
紫杉醇是二萜类化合物,其化学名为:5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟 基紫杉-11-烯-9-酮-4,10-双乙酸酯-2-苯甲酸酯 13-酯-(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨 酸,其分子式为 C47H51O14N,相对分子质量为 853.9,熔点 213-216℃,具有高度亲脂性, 不溶于水[19],外观为白色结晶或无定型粉末,其结构如图 1-1[20]。

图 1-1 紫杉醇的化学结构

早在 1856 年,Lucas H 就从欧洲红豆杉(Taxus baccata)叶片中提取到粉末状碱性组
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分,即紫杉碱(taxine)[21]。1958 年,美国国家癌症研究所(NCI)组织化学、生态、药理 及临床方面的专家对 35000 种植物提取物进行抗癌活性的筛选工作。1963 年,参加 NCI 筛选目的 Research Triangle Institue 的化学家 M. E. Wall 和 M. C. Wani 首次从红豆杉树皮和 木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选试验中,Wani 和 Wall 发现紫杉醇粗提物对离体 培养的鼠肿瘤细胞(包括 L1210 和 P388 白血病、Walker256 肉瘤癌、肉瘤 180 以及 B16 黑色素瘤细胞)有很高活性。他们开始分离这种活性成分,但是由于该活性成分在树中含 量极低,分离工作花了他们数年时间,直到 1971 年,他们才同 Duke 大学的化学教授 Andrew T. McPhail 一起,通过 X-射线分析确定了该活性成分的化学结构,并把它命名紫 杉醇(taxol)[22]。 1982年紫杉醇开始在临床上进行试验,1989年完成Ⅱ期临床,1990年进行Ⅲ期临床, 1992年12月29日美国FDA正式批准用于晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌的治疗。它是经FDA认 证,目前最好的天然抗癌药物之一,是治卵巢癌、乳腺癌的首选药物,对白血病、肺癌、 脑癌、直肠癌等疗效也显著,并且毒性试验表明它的毒副作用很小。总之,紫杉醇是一种 有效治疗多种癌症的天然植物提取物,其独特的抗癌机制使之成为全球抗癌药物研究热 点。2003年全球紫杉醇销售额已经超过20亿美元,并且还在以每年20 %的速度递增[23]。 近年来,国内外的研究人员又从不同角度对紫杉醇抗癌机理、临床应用等方面开展研 [24] 究 。对于紫杉醇的作用机制,目前普遍认同四种机制,第一,紫杉醇与微管中β蛋白N 端第31位氨基酸和第217~231位氨基酸结合,促进微管蛋白聚合、微管装配,防止解聚, 使微管稳定。导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝,抑制了细胞分裂和增殖, 使癌细胞停止在G2期和M期,直至死亡,进而起到抗癌作用[25]。第二,紫杉醇可以调节体 内的免疫功能,通过作用于巨噬细胞,导致癌坏死因子(TNF-α)受体的减少以及(TNF-α) 的释放,还可促进白细胞介素-1(IL-1)及干扰素(IFN-α、IFN-β)的释放,对癌细胞起 杀伤或抑制作用[26]。第三,紫杉醇可作用于细胞凋亡受体途径的Fas/Fasl通路,或激活半胱 氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族(cysteinyl aspartate proteases caspases)诱导细胞凋亡[27]。第四,紫 杉醇可抑制肿瘤细胞迁移。用紫杉醇处理过的鼠成纤维细胞只能产生扁平足状突起和丝状 假足,不能移动[11]。 随着对紫杉醇的需求越来越大, 紫杉醇的来源问题一直受到人们的关注。 到目前为止, 扩大其来源的方法主要包括筛选高产红豆杉栽培品种、化学合成、改进提取工艺、加强天 然林保护、代谢调节、基因工程、细胞培养、真菌发酵、寻找紫杉醇类似物、寻找红豆杉 替代植物等,这些方面都有相关的科研人员开展了研究工作。

1.3.3 三尖杉宁碱
三 尖 杉 宁 碱 ( cephalomanine) 是 最 难 与 紫 杉 醇 分 离 的 一 种 伴 生 物 , 分 子 式 : C45H53NO14,分子量:831.91,结构式如图 1-2 所示[28]。三尖杉宁碱是紫杉醇的紫杉烷 类同系物,母核完全相同,只是在侧链部分略有不同,其 C-13 侧链末端是个双键,而 紫杉醇的 C-13 侧链是苯环,三尖杉宁碱可以经过结构修饰转变为紫杉醇[29]。它在某些 红豆杉植物中含量仅次于紫杉醇,药理实验表明它也具有较强的抗肿瘤活性,将它开发 成新的抗肿瘤药或将其转化为紫杉醇是有效地利用植物资源的又一途径[30]。

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图1-2 三尖杉宁碱的化学结构

1.3.4 研究进展
从太平洋红豆杉树皮中分离鉴定出抗癌新药紫杉醇之后, 红豆杉资源的开发受到了极 大的关注,因其具有防癌、抗癌巨大的药用功能,且被列为世界濒危物种,国家Ⅰ级保护 植物,成为征服癌症的“希望之树”,成为价值昂贵的植物黄金。因此,紫杉醇及其他紫杉 烷类次生代谢产物含量的影响因素备受关注。 Erik等从英国和荷兰的5个不同的地方采集了750个枝叶样本并分析了每个样本中紫杉 醇、10-脱酰基紫杉醇、三尖杉宁碱、巴卡丁Ⅲ和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的含量[31]。结果显示 不同物质在不同品种红豆杉中含量差异很大。苏应娟等曾报道过我国粤北连州地区南方红 豆杉不同组织中紫杉醇的含量,并且发现与相应T. cuspidata和T. yunnannesis的组织相比含 量较高[32]。郑德勇曾对云南红豆杉、东北红豆杉及南方红豆杉的紫杉醇含量进行考察,结 果表明,不同树种的植物原料中紫杉醇含量有一定的差异,其中云南红豆杉样品中紫杉醇 含量最高,树木各部位平均含量达1.49×10-4(w/w),其次为南方红豆杉及东北红豆杉, 其树木各部位平均含量分别为1.25×10-4(w/w)和1.08×10-4(w/w)[33]。 紫杉醇及其衍生物的含量随季节而变化,不同生长季节叶中的紫杉醇含量的动态变化 , 较大。张鸿等分别于4月、9月随机采集同一地点的红豆杉树皮各l0份,分别进行紫杉醇含 量测定。结果显示,采集于4月的红豆杉树皮中紫杉醇含量明显高于采集于9月的样品[34]。 张凤梅的实验结果显示,从3月份气温回升,植物开始萌动生长,东北红豆杉中紫杉醇的 含量降低,随着植物光合能力的增强,紫杉醇的含量也增加,7月份的紫杉醇在叶中积累 量最大,达到0.02384%。之后东北红豆杉叶中的紫杉醇含量降低趋势,尽管在随后的几个 月内紫杉醇含量又逐渐增加,但增加量还是很有限[35]。 储存方法的不同也会导致测定得到的紫杉醇及其衍生物含量不同, 的研究表明, Fett 叶在冰冻下 96h、25℃下真空 96h(均为避光条件)及新鲜提取显示的紫杉醇含量无显 著差异,但叶在 60℃、96h,紫外光谱上紫杉醇峰出现变化,表明在此条件下紫杉醇有 降解[36]。ElSohly 等的研究证明保存干剪枝有利于紫杉醇的保存[37]。薛艳华等以东北红 豆杉新鲜枝叶为材料,比较不同烘干预处理方法对紫杉醇含量的影响,分别进行了自然 风干、烘箱干燥、微波干燥三种不同的干燥方法,通过对干燥时间和紫杉醇含量的综合 考虑,最终确定微波干燥法为最佳提取方法[38]。 以上这些因素都或多或少影响红豆杉中次生代谢产物的含量, 但由于这些因素并非单 独作用,除非采取严格的实验控制否则很难单独考察各个因素的影响。
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1.4 立题依据
东北红豆杉枝叶中某些紫杉烷类物质具有独特的抗癌活性, 其中紫杉醇和三尖杉宁碱 是具有代表性的两种物质。 紫杉醇现已广泛应用于卵巢癌等癌症的临床治疗, 三尖杉宁碱 虽与紫杉醇相比具有稍弱的抗癌活性,但是仍可以特定过程合成紫杉醇。 野生红豆杉资源匮乏严重阻碍了我国药用紫杉醇的产业化发展, 对天然东北红豆杉枝 叶中两种有效成分含量变化规律的研究, 可以指导人们对野生东北红豆杉资源合理、 有效、 充分的利用。 这样不仅为紫杉醇大量生产提供解决途径, 又可以避免野生资源遭到毁灭性 的破坏。同时,紫杉醇及三尖杉宁碱作为红豆杉植物的次生代谢产物,对其含量变化研究 可以从更深的层次揭发植物与环境的内在联系, 为全面、 深入认识植物与环境的相互关系 提供新的研究途径。

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2 实验材料及方法

2.1 实验材料
不同树冠部位枝叶:2007 年采集于黑龙江穆棱东北红豆杉自然保护区,80℃下烘干至 恒重,然后粉碎干燥保存备用的枝叶样品。 不同生长时期枝叶:在黑龙江穆棱东北红豆杉自然保护区中,分别于 2008 年 5 月(花 期) 、2008 年 9 月(果期) 、2008 年 11 月(休眠期)对选中的 10 株成树进行样品采集。采 集部位为向阳面下部。所有样品采集后在 80℃下烘干至恒重,然后粉碎干燥保存备用。

2.2 仪器与试剂
2.2.1 仪器
高效液相色谱仪 Waters2487 型紫外检测器 Waters1525 型进样泵 AB104 型电子天平 氮吹仪 FW100 型粉碎机 AS20500A 型超声清洗器 Allegra 64R 高速冷冻离心机 MultitempⅢ型恒温循环水浴 色谱柱:C18 柱(250mm×4.6mm,5?m) 美国 Waters 美国 Waters 瑞士 北京八方世纪科技有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 天津 Auto science 美国 Beckmann 美国 Amersham biosciences 美国 Thermo Hypersil 公司

2.2.2 试剂
乙腈 超纯水 100%甲醇 色谱纯 色谱纯 分析纯 迪马公司 MiliQ 纯水系统制备 天津市大茂化学试剂厂

2.3 实验方法
2.3.1 样品制备
精密称取东北红豆杉干样粉末 0.5 g 于 5 mL 容量瓶中,加入 4 mL 80 %甲醇,在室温 下超声波(工作频率 40 kHz、功率 170 W)辅助提取 30 min 后,冷却至室温,定容至刻 度, 摇匀。 取其中 3 mL 上清液氮气吹干, 加入 100 ?L 80 %甲醇漩涡震荡 1 min, 13000 rpm 离心 10 min,备用。
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2.3.2 色谱条件
色谱柱:Thermo Hypersil gold C18 柱(4.6 mm×25 cm×5 ?m) ;柱温:室温;检测波 长:227 nm;流动相:乙腈/水溶液(体积比 45/55) ;流速:1 mL/min;进样量 20 ?L。

1: 三尖杉宁碱 2: 紫杉醇 对照品( )和样品( ) 图 2-1 对照品(a)和样品(b)的色谱图

2.3.3 标准溶液配制
精密称取紫杉醇和三尖杉宁碱标准品各 10 mg,于 10 mL 容量瓶中以 80 %甲醇为溶 剂,超声波溶解并定容,摇匀备用。

2.3.4 标准曲线绘制
分别精密吸取紫杉醇和三尖杉宁碱标准溶液 2、10、30、60、100、200 ?L 于 2 mL 容 量瓶中,以 80%甲醇定容,摇匀,室温条件下超声提取 30 min,按照选定的色谱条件,分 别对不同浓度的标准溶液进样分析,每样重复测定 3 次。分别以质量浓度(?g/mL,紫杉 醇 x1、三尖杉宁碱 x2)为横坐标,峰面积值 y 为纵坐标进行回归计算,得紫杉醇和三尖杉 宁碱的回归方程和相关系数分别为:1=44173x1+34319, 2=0.998 8, y R 线性范围: ?g/mL~100 1 2 ?g/mL;y2=39214x2+198.38,R =0.999 5,线性范围:1 ?g/mL~100 ?g/mL。

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3 结果与分析
3.1 天然东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量
3.1.1 天然东北红豆杉不同树冠部位叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量

紫杉醇含量(?g/g)

40 30 20 10 0

当年生

两年生

三年生

阳上

阳中

阳下 阴上 采样部位

阴中

阴下

图 3-1 不同树冠部位叶中紫杉醇含量

由图 3-1 可知,除阴中外,其他各部位当年生叶中紫杉醇含量均低于两年生和多年生 叶,最高者为阳下部位,含量为 15.36 ?g/g,最低者为阴下部位,含量仅为 7.64 ?g/g,阳 上、阳中和阴中三个部位的多年生叶中紫杉醇含量高于两年生叶,其他部位与之相反;树 冠中部多年生叶中紫杉醇含量最高, 当年生和两年生叶中紫杉醇含量无明显规律; 阳面叶 中紫杉醇含量高于阴面叶。
三尖杉宁碱含量(?g/g)

当年生
40 30 20 10 0

两年生

三年生

阳上

阳中

阳下 阴上 采样部位

阴中

阴下

图 3-2 不同树冠部位叶中三尖杉宁碱含量

由图 3-2 可知,除阴中外,其他各部位当年生叶中三尖杉宁碱含量均低于两年生和多 年生叶,最高者为阴中部位,含量为 12.61 ?g/g,最低者为阳上部位,含量仅为 6.60 ?g/g; 阳上、阳中、阴上和阴下四个部位的多年生叶中三尖杉宁碱含量均高于两年生叶;树冠中 部当年生叶和多年生叶中三尖杉宁碱含量高于上部和下部, 而树冠上部的两年生叶中三尖 杉宁碱含量高于下部, 树冠中部叶中最低; 除阳上部位当年生叶中三尖杉宁碱含量与阴上 部位差异不显著之外,其他部位的阳面叶中三尖杉宁碱含量均比阴面高。
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3.1.2 天然东北红豆杉不同树冠部位枝中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量
60

紫杉醇含量(?g/g)

当年生
40

两年生

三年生

20

0

阳上

阳中

阳下 阴上 采样部位

阴中

阴下

图 3-3 不同树冠部位枝中紫杉醇含量

由图 3-3 可知,除阳下和阴下外,其他各部位当年生枝中紫杉醇含量均高于两年生和 多年生枝, 最高者为阳中部位, 含量为 47.23 ?g/g, 最低者为阴下部位, 含量为 23.89 ?g/g; 阳中、阳下、阴中和阴下四个部位的多年生枝中紫杉醇含量均高于两年生枝;阳上和阴上 部位与之相反; 树冠中部当年生枝中紫杉醇含量高于上部和下部, 两年生和三年生枝中紫 杉醇含量无明显变化规律;阳面当年生枝中紫杉醇含量高于阴面,其他二者无明显规律。
三尖杉宁碱含量(?g/g)
40

当年生
30

两年生

三年生

20 10 0

阳上

阳中

阳下 阴上 采样部位

阴中

阴下

图 3-4 不同树冠部位枝中三尖杉宁碱含量

由图 3-4 可知,除阴中外,其他各部位当年生枝中三尖杉宁碱含量均低于两年生和多 年生枝,阳上、阳下和阴中三个部位的多年生枝中三尖杉宁碱含量高于两年生枝,其他部 位与之相反; 当年生、 两年生及三年生枝中三尖杉宁碱含量在树冠纵向分布及树冠阴阳面 分布上均无明显差异。

3.2 天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期 变化规律
3.2.1 当年生叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律
在天然东北红豆杉三个生长时期内对选取的 10 株东北红豆杉成树的阳下部位当枝叶 中三尖杉宁碱和紫杉醇含量进行了生长时期变化规律研究:
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图 3-5 不同生长时期当年生叶中紫杉醇含量

图 3-6 不同生长时期当年生叶中三尖杉宁碱含量

图 3-5 为三个时期当年生叶中紫杉醇含量的差异, 结果表明当年生叶中紫杉醇含量在 三个时期的大小关系为:花期<果期<休眠期。 图 3-6 结果表明, 1 号树和 6 号树当年生叶中三尖杉宁碱含量在花期和果期差异不 除 显著外,其他植株花期的当年生叶中三尖杉宁碱含量均低于果期。10 株成树当年生叶中 三尖杉宁碱含量均在休眠期达到最高值。
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3.2.2 当年生枝中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期变化规律

图 3-7 不同生长时期当年生枝中紫杉醇含量

图 3-8 不同生长时期当年生枝中三尖杉宁碱含量

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图 3-7 结果表明,3 号和 4 号树当年生枝中花期和果期紫杉醇含量无明显差异,10 号 树当年生枝中花期紫杉醇含量高于果期,而其余 7 株树则相反,但是 10 株树当年生枝中 紫杉醇含量均在休眠期达到最高值。 图 3-8 表明,当年生枝中三尖杉宁碱含量在花期和果期差异不显著,但是休眠期三尖 杉宁碱含量明显高于花期和果期。

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4 讨论

4.1 天然东北红豆杉不同树冠部位枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱的含量
将树冠划分为向阳面和向阴面,在每个方位的垂直方向划分为上、中、下 3 个层次分 别采集当年生、二年生和多年生针叶和小枝,测定其紫杉醇和三尖杉宁碱的含量,结果表 明,多数树冠部位的当年生枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量低于两年生和三年生枝叶, 而两年生和三年生枝叶中两种物质含量差异不显著; 阳面树冠的 3 个层次的三尖杉宁碱和 紫杉醇含量无显著差异, 当阳面的两种物质含量稍高于阴面。 分析其原因可能为不同树冠 部位接受阳光辐射的程度、 水分的运输等因素存在一定的差异性, 进而造成了环境的差异。

4.2 天然东北红豆杉当年生枝叶中紫杉醇及三尖杉宁碱含量的生长时期 变化规律
天然东北红豆杉当年生枝叶中三尖杉宁碱含量在休眠期最高, 部分样树的当年生枝叶 中三尖杉宁碱含量为花期低于果期, 但是有个别个体二者含量差异不显著; 天然东北红豆 杉当年生枝叶中紫杉醇含量在休眠期也达到最高,花期和果期含量无太大差异。 根据以上研究结果, 我们推断导致休眠期两种成分含量较高的原因可能是温度较其他 时期低,有效物质分解代谢比较缓慢,而花期为生长旺盛时期,果期为结实期,此两种时 期三尖杉宁碱和紫杉醇的分解代谢途径也处于旺盛期, 因此其含量较低。 但是两种物质在 植物体内的代谢和转化过程及控制机理等目前还不是十分清楚,有待于今后的研究。

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5 结论
东北红豆杉(Taxus cuspidata)是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属植物,又名紫杉、赤 柏松是我国东北分布的珍贵第三纪孑遗树种、国家 I 级重点保护的野生濒危植物种类。紫 杉醇(paclitaxel,商品名 taxol)为红豆杉属植物中含有的一种二萜类化合物,具有独特的 抗癌作用机理,目前主要应用于治疗卵巢癌和乳腺癌等。三尖杉宁碱(cephalomannine) 是某些红豆杉属植物中的主要成分之一,含量仅次于紫杉醇,也具有较强的抗肿瘤活性。 本研究对穆棱东北红豆杉自然保护区内的天然东北红豆杉中紫杉醇及三尖杉宁碱的 分布规律及随着生长时期的含量变化变化规律进行了比较分析。 1 多数树冠部位的当年生枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量低于两年生和三年生枝 叶,而两年生和三年生枝叶中两种物质含量差异不显著;阳面树冠的 3 个层次的三尖杉宁 碱和紫杉醇含量无显著差异,阳面的两种物质含量稍高于阴面。 2 天然东北红豆杉当年生枝叶中三尖杉宁碱含量在休眠期最高,部分样树的当年生 枝叶中三尖杉宁碱含量为花期低于果期,但是有个别个体二者含量差异不显著;天然东北 红豆杉当年生枝叶中紫杉醇含量在休眠期也达到最高,花期和果期含量无太大差异。

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参考文献:
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理学通讯, 2005, 41(5): 657-658.

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致谢


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