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抗体的制备及应用ppt


抗体的制备及应用

一、抗体的一些基本概念
?

单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
多克隆抗体 (Polyclonal Antibody) 多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体

?

抗原(antigen ,Ag)
表位,抗原结合位点,抗原决定簇(epitope)
1

Ag
2 3

4

1 Ag

B1

4
3

B2 B3 B4 多克隆抗体

2

B3

B3

B3

B3

单克隆抗体

1、单克隆抗体的特点
特异性强,具有抗原结合位点的专一 性。(不是抗原的专一性!) ? 因结合位点的单一性,有时不易捕捉 抗原,一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。 ? 抗体的性质相同,容易纯化、标记。
?

脑垂体分泌的一些激素:
hFSH 促卵泡激素 hLH 促黄体生成素
α β

α

β

hTSH 促甲状腺激素 hCG

α

β α β

#绒毛膜促性腺激素

单克隆抗体有交叉反应是由于不 同的抗原上有完全相同的表位(100% 的交叉反应),或有相似的表位(不同 程度的交叉反应)。

产生凝集反应的原理

2 1

3 1 1

1

2 1 2

2
3 2

1
2 3

3

3 1

1

1

2 3
2 1

购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验,使用浓度多少
? ? ? ? ? ?

WB(Western blotting ,免疫印迹) IH (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) IC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) IEM (Immune lectron microscopy,免疫电镜) FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)

2、多克隆抗体的特点
多抗是单抗的混合物,因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。 ? 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成,只要其 中含交叉反应的抗体,多抗就有交叉 反应,所以多抗更容易有交叉反应。

比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体,多种抗 体都可与抗原结合。 ? 抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体, 提纯、标记的方法有所差别。同时,血 清中含有的杂蛋白比较多.
?

二、抗体的制备
1、单克隆抗体的制备
? ? ?

无法采用生物化学的方法从多抗中分离 必须采用细胞杂交的方法来制备 能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问 题也有机遇问题

制备单克隆抗体的基本原理:
致敏的B淋巴细胞 (能够分泌特异性的抗体 ,
不能在体外长期生存 )

骨髓瘤细胞 (myeloma) (不能分泌特异性的抗体,
但能在体外长期生存)

阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)
1 2 1 2
2 2 2

(既能分泌特异性抗体, 又能够在体外长期生存)

克隆化培养
(产生单克隆的阳性杂交瘤细胞)

生产单克隆抗体

2、多抗的制备
? 常用的免疫动物

? 免疫的基本步骤
? 如何免疫兔子

1)常用的免疫动物
?

?

?

兔子(rabbit):最常用于自制抗体, 抗体量较多。(新西兰,大耳白) 小鼠(mouse):可用于自制抗体,但 抗体量很少。(BALB/C,昆明鼠) 大鼠(rat):可用于自制抗体,免疫过 程要麻醉动物。(Wistar大鼠)

?

?

?

羊(sheep、goat):常用于较大批量地 生产抗体(商品)。 马(horse):常用于大批量生产治疗用 抗体(商品)。 豚鼠(guinea pig):国外实验室常用。

2)免疫的基本步骤
?

?

基础免疫:首次,抗原用量大,用佛式完全 佐剂(Complate Freund’ adjuvand , 含矿物油,卡介苗等). 加强免疫:第2次以后,抗原量减半,多次, 间隔2-4周,用佛式不完全佐剂 (Incomplate Freund’ adjuvand , 不含卡介苗).

取血测效价: 加强免疫两次或三次以后的第7天取血。 ? 放血制备血清: 最后一次免疫后7-10天放血。 (在三角瓶中加一些生理盐水,放血放置一段 时间,凝固,吸取血清,离心,分装,冻存)
?

3) 如何免疫兔子
? ? ? ? ?

?

2000g(雌雄均可),健康,无病原(小鼠20g,大鼠200g) 基础免疫 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) 0.5ml佛式完全佐剂(CFA)(小鼠0.2ml) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射(注意
不要剪毛)

? ? ? ? ?

?

加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5ml抗原(蛋白量减半) 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射

? ? ? ? ?

?

免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法:1:104以上,能达到1:106。 免疫双扩散: 1:16以上,能达到1:64 效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)

单抗与多抗的区别
抗体组成 抗体性质 纯化标记 种属来源 制备周期 制备技术 经费

单抗 单一 个体的属性 容易,效果好 绝大多数是小鼠 长 (最短4个月) 复杂 多

多抗 复杂 群体综合的性质 难度高一些 兔子、羊、豚鼠等 短(2个月) 简单 少

什么情况需要制备单抗
目的蛋白有结构类似物 ? 抗原不纯,无法分开 ? 多抗效果不好(已排除非特异性反应) ? 希望将抗体用于治疗,研制成药品 ? 希望将抗体用于诊断,研制成诊断试剂
?

三、抗体的纯化
? 盐析法(硫酸铵沉淀) ? 辛酸-硫酸铵沉淀法 ? 离子交换法 ? 亲和层析法 ? 凝胶过滤法

1、盐析法(硫酸铵沉淀)

? 原理 ? 在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中
的溶解度降低而产生沉淀 ? 硫酸铵是最常用的中性盐 ? 不同蛋白质的盐析常数不同 ? 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L)

?
? ?

主要步骤
在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀; 4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀; 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0.313g/ml 45%饱和度: 0.277g/ml 40%饱和度: 0.243g/ml 最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析, 测定浓度。

?

? 特点
? ? ? ?

成本低,步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低,电泳后可见到明显 的杂带,不适合于做各种标记。 需要高速离心机。

2、正辛酸-硫酸铵沉淀法
原理 两步沉淀: ? 先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下 (pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀. ? 后加硫酸铵使抗体沉淀.
?

? 主要步骤:
? ? ? ? ? 调节样品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),搅拌30分;。 室温高速离心(10000g,30分钟),收集上清液; 再加入硫酸铵(40%饱和度); 4℃高速离心(10000g,15分钟) ,弃上清; 溶解沉淀,透析,测定浓度。

? 特点
? ? ?

?

成本较低,步骤较复杂。 抗体回收率很低。 抗体纯度高,电泳后杂带很少,适合于各种 标记。 需要高速离心机,耐高速离心的玻璃离心管。

3、离子交换法
?
?

原理
利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合 力的差异进行物质分离. DEAE是一种阴离子交换剂,自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基) 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷. 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子 (Cl-)置换被分离的组分.

?

? ?

带负电荷 的被吸附上

带负电荷少 的先被置换

带负电荷多 的后被置换

-

- -+ -

-

+

+ +

+

-

连续梯度洗脱:
NaCl Tris

梯度混合仪

阶段洗脱:
离子强度

倒入一定浓度的NaCl溶液

T
蛋白浓度

通过离心来分离
T

?
? ?

主要步骤
先用硫酸铵沉淀抗体,粗提; 将样品过柱; 洗去没有结合的物质; 用梯度NaCl溶液洗脱,等量收集洗脱液; 紫外分光光度计测量,保留A280值明显升高的样品; 汇集样品,浓缩,测定浓度。

?
? ? ?

? 特点
? 成本较低,步骤较简单。 ? 抗体回收率较高。 ? 抗体纯度较高,电泳后可见少量杂带,适 合于各种标记。 ? 纯化后抗体体积大,需要浓缩。 ? 需要冷柜,自动收集器。

4、亲和层析法
?
?

原理
利用蛋白质之间的特异性结合 (抗体-抗原,受体-配体) 将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配 的物质。 洗脱一般采用改变pH值的方法

?

?

使用前

样品结合(Binding)

洗脱(Elution)

?
? ?

主要步骤
将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱); 将腹水或血清处理后过柱; 用结合缓冲液洗柱子,直到A280值为零; 用甘氨酸缓冲液洗脱抗体,等量收集洗脱液; 测定洗脱液的A280值,保留A280值明显升高的样品; 汇集样品,浓缩,测定浓度。

?
? ? ?

? 葡萄球菌A蛋白
?

?
? ? ?

(staphylococcal protein A,SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 分子量42000,等电点pH5.1 可与大多数动物Ig的Fc段结合 一个SPA分子有4个相似的活性部位 与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差

? 特点
? ? ? ? ? 成本高,步骤较简单。 抗体回收率低。 抗体纯度高,适合于各种标记。 纯化后抗体体积大,需要浓缩。 需要自动收集器。

5、凝胶过滤法(分子筛)
?
?

原理
将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经 路径的差异,使不同分子质量的组分分离. 大分子物质直接从凝胶颗粒外通过,走得快;小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来,走得慢。 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)

?

?

? 主要步骤
?

? ? ?

将腹水或血清处理后上柱,样品要浓; (可用G-200,柱子要长,80-100cm) 待样品入柱后,用缓冲液过柱; 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 收集第一峰。

?特点 ? 成本高,步骤较简单。 ? 抗体回收率较高,分离条件缓和,抗 体活性不受影响。 ? 抗体纯度较高。 ? 需要自动收集器。


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