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蛋白质浓度测定方法比较


基因组DNA提取及鉴定 提取及鉴定 基因组

1、0.1g 细胞 2ml epp,混匀。 、 细胞→ ,混匀。 2、+ 、+700?l bufferA,65℃,10m’,中间混匀一次 、+ , ℃ , 3、+苯酚350?l,+氯仿 、+苯酚 ,+氯仿 、+苯酚 ,+氯仿350?l,混匀 ,12000rpm,5m’ ,混匀3m, , 4、上清500?l 至1.5ml epp,+ 、上清 ,+500?l(等体积)氯仿,混匀 ,+ (等体积)氯仿, 3m’,12000rpm,10m’ , , 5、上清400?l到1.5ml epp,+异丙醇 、上清 ,+异丙醇 到 ,+异丙醇400?l(0.7-1×), ( × 12000rpm,2m’,(掏出 ,(掏出 , ,(掏出DNA,毛细管) ,毛细管) 6、沉淀用70%乙醇洗 次,每次 、沉淀用 乙醇洗2次 每次3m’ 乙醇洗 7、自然凉干(10m’),+ 、自然凉干( ),+30?lTE,充分溶解 ),+ , 8、琼脂糖凝胶电泳鉴定 、

蛋白质浓度测定方法比较

一、 实验目的 学习三种蛋白质浓度的测定方法, 学习三种蛋白质浓度的测定方法,并比 较优缺点。 较优缺点。

二、 实验原理与步骤
1、 Lowry法(Foling-酚法) 、 酚法) 法 酚法 反应原理: 反应原理: 磷钼酸、 OH- 磷钼酸、磷钨酸 Pr+CuSO4 →→→ Pr-Cu络合物(紫红色)→→→蓝色化合物 Pr-Cu络合物(紫红色)→→→蓝色化合物 络合物 蛋白质测定的范围: - 蛋白质测定的范围:25-250?g/mL 标准蛋白BSA 250?g/mL 标准蛋白 测定波长: 测定波长:660nm

测定步骤:标准蛋白 测定步骤:标准蛋白BSA 250?g/mL 依次向试管中加入试剂: (1)依次向试管中加入试剂:
管号 BSA(mL) D.W(mL) [Pr](μg/mL) 试剂甲(mL) 试剂甲(mL) 试剂乙(mL) 试剂乙(mL) A660 作图, (2)A660——[Pr]作图,求待测蛋白浓度 A660 作图 室温反应10分钟(双缩脲反应) 10分钟 5.0 室温反应10分钟(双缩脲反应) 立即振摇,30℃水浴20分钟 水浴20 0.5 立即振摇,30℃水浴20分钟 1 0 1.0 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 待测1 待测1 待测1 待测1, 1.0 0 1.0 0

2、紫外线(UV)吸收法: 、紫外线( )吸收法:
原理:蛋白质分子中Tyr, Phe的苯环含有共轭双键 的苯环含有共轭双键, 原理:蛋白质分子中Tyr, Try, Phe的苯环含有共轭双键,因此蛋白质具有 UV吸收的性质 吸收高峰在280nm 吸收的性质, 280nm处 UV吸收的性质,吸收高峰在280nm处。 测定范围:0.1- 测定范围:0.1-1mg/mLpr 测定波长: 测定波长:280nm 标准蛋白BSA: 标准蛋白BSA: 1mg/mL BSA 测定步骤: 测定步骤: (1)向各试管中依次加入各种试剂: 向各试管中依次加入各种试剂:
管号 BSA(mL) BSA(mL) D.W(mL) [Pr](mg/mL) A280nm 1 0 4.0 2 0.5 3.5 3 1.0 3.0 4 2.0 2.0 5 3.0 1.0 6 4.0 0 待测1 待测1 4.0 0 待测1 待测1, 4.0 0

(2)以A280nm-[Pr]作标准曲线,求待测蛋白浓度 A280nm-[Pr]作标准曲线, 作标准曲线

3、考马斯亮蓝显色法(Bradford法) 、考马斯亮蓝显色法( 法
实验原理:[Pr]↑→→→→CBBG-250-Pr复合物 ↑→→→A 实验原理:[Pr]↑→→→→CBBG-250-Pr复合物 ↑→→→A595↑ 标准蛋白BSA: 标准蛋白BSA: 250μg/mL BSA 操作步骤: 操作步骤: (1)依次向各试管中加入各种试剂: 依次向各试管中加入各种试剂:
管号 BSA(mL) BSA(mL) D.W(mL) [Pr](μg/mL) CBBG-250(mL) CBBG-250(mL) A595nm 5.0 1 0 1.0 2 0.2 0.8 3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 待测1 待测1 待测1 待测1, 1.0 0 1.0 0

(2)以A595nm-[Pr]作标准曲线,求待测蛋白浓度 A595nm-[Pr]作标准曲线, 作标准曲线

蔗糖酶km值的测定 蔗糖酶 值的测定

一、实验目的: 实验目的: 掌握sucrose酶的 测定的实验方法。 酶的km测定的实验方法 掌握 酶的 测定的实验方法。 二、实验原理: 实验原理: 蔗糖酶是一种水解酶,催化反应:蔗糖 水 蔗糖酶是一种水解酶,催化反应:蔗糖+水→→G+F 每水解1molS,生成2mol还原糖,因此可用比色皿测定还原 ,生成 还原糖, 每水解 还原糖 糖量,即可知底物的水解速度。还原糖可还原3, 二硝基水杨 糖量,即可知底物的水解速度。还原糖可还原 ,5-二硝基水杨 氨基-5-硝基水杨酸 酸(DNS)生成红棕色的氨基化合物,即3-氨基 硝基水杨酸。 )生成红棕色的氨基化合物, 氨基 硝基水杨酸。

三、实验步骤
只试管, 取8只试管,按下表分别加入如下试剂: 只试管 按下表分别加入如下试剂:

管号 1 2 3 4 5 6 7 8

H2 O 蔗糖 ) (ml) (ml) ) 0.5 0.75 1 1.5 2 2.5 3 4 4.5 4.25 4 3.5 3 2.5 2 1

↓ 每管加酶液0.5 ml 每管加酶液 ↓ 37℃准确作用 min ℃准确作用5 ↓ NaOH 0.5 ml ↓ 每管取0.5ml 每管取 ↓ DNS 0.5ml ↓ 沸水浴3min 沸水浴 ↓ 冷却 ↓ DW 4ml ↓ A520

作图, 作图 以1/A520——1/S作图,求Km

测定的意义: 四、Km测定的意义 测定的意义 1、酶的特征性常数,进行酶学研究必须测定的一个参数; 、酶的特征性常数,进行酶学研究必须测定的一个参数; 2、代谢研究(特别是分支代谢途径的调节), 、代谢研究(特别是分支代谢途径的调节),Km代表 争 代表E争 ), 代表 的能力, 夺S的能力,对反应速度(代谢)的计算非常重要。 的能力 对反应速度(代谢)的计算非常重要。 五、注意事项: 注意事项: 1、底物浓度应选择在Km值附近; 、底物浓度应选择在 值附近; 值附近 2、反应时间应尽可能短,以保证反应初速度; 、反应时间应尽可能短,以保证反应初速度; 3、酶活力不能太高,否则不易控制; 、酶活力不能太高,否则不易控制; 4、加样应为一个人操作,保证各管间隔一致。 、加样应为一个人操作,保证各管间隔一致。

DNS-aa的聚酰胺薄膜层析 的聚酰胺薄膜层析

一、实验原理: 实验原理: 荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨( 能与氨基酸的N末 荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨(DNS-Cl),能与氨基酸的 末 ) 能与氨基酸的 端结合生成荧光物质DNS-aa,DNS-Cl也可与多肽或蛋白 端结合生成荧光物质 , 也可与多肽或蛋白 质的游离氨基结合,生成DNA-Pr或DNS-肽,经酸水解后 质的游离氨基结合,生成 或 肽 释放出DNS-aa,各种 释放出 ,各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不 在聚酰胺薄膜的分配系数不 一样, 紫外光下发黄色荧光。 一样,DNS-aa在360或280nm紫外光下发黄色荧光。 在 或 紫外光下发黄色荧光 二、实验步骤: 实验步骤: 1、取聚酰胺薄膜1张(一人一张),铅笔做上样点标记 、取聚酰胺薄膜 张 一人一张), ),铅笔做上样点标记 2、上样,毛细管上样直径<2mm,多次上样 、上样,毛细管上样直径 , 3、展层(通风橱内) 、展层(通风橱内) 4、检测,用吹风机吹干,紫外光检测 、检测,用吹风机吹干,

实验错开做,以避免仪器和试剂使用拥挤! 实验错开做,以避免仪器和试剂使用拥挤! DNA提取实验放在第一或第二个做 DNA提取实验放在第一或第二个做 分光光度计和水浴锅已调好,请不要调动波 分光光度计和水浴锅已调好, 长和温度,比色皿专用,请勿混用。 长和温度,比色皿专用,请勿混用。 实验报告


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