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白酒微生物的检测与鉴定


第二章 白酒微生物的检测与鉴定
第一节 白酒微生物的检测
白酒微生物可以分为有益菌和有害菌, 这里所说的有益菌和有害菌, 是因不同种类的白 酒及其生产过程中的各个阶段,相对而言的。每种菌在生长的同时,往往可以产生以某一种 酶为主的多种酶,这些酶将培养基中的成分分解或合成各种产物,并合成菌体成分。

一、有益菌的检测
有益菌主要有糖

化菌和包括产香味菌在内的发酵菌两大类。 糖化菌最好是能耐高温、 耐 酸、耐酒精且产糖化酶较多,产蛋白酶适量而不产果胶酶的菌;发酵菌主要生成适量的酒精 及各种香味成分。 (一)霉菌 首先,曲霉和根霉是主要的糖化菌。其中黑曲霉的糖化力较高;根霉也具有较高的糖化 力,且不产转移葡萄糖苷酶,并能产生多种有机酸,若与其它菌株配合使用,则有利于麸曲 白酒口味的改善;白曲(霉)的糖化力稍低,但所制得的成品酒风味较好;米曲霉的糖化力 较低,且不耐酸,但液化力及蛋白质分解力较强,一般用于制米曲汁的米曲培养。许多名酒 大曲中,大多能分离到红曲霉及拟内孢霉,它们均有较好的产糖化酶能力。红曲霉也能产多 种有机酸,并能分泌酯化酶;拟内孢霉能产多元醇,有利于增强白酒的绵甜感。少数犁头霉 也有较高的糖化力。木霉能产纤维素酶,若菌株优良且培养的得当,并与其他糖化力高的菌 株一起使用,则能提高出酒率。 关于有益霉菌的检测,主要是对霉菌孢子数的测定,可采用镜鉴法,也可采用下述的摇 落孢子数法:称取种曲 10g,烘干后摇落其孢子,经筛孔直径为 0.2mm 的筛子,求得干孢子 与干物质的百分数。 另外, 采用血球计数板在显微镜下直接计数的方法是一种常用的细胞计数方法。 此法是 将孢子悬浮液放在血球计数板与盖片之间的计数室中, 在显微镜下进行计数。 由于计数室中 的容积是一定的,所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。 具体方法如下: 1、实验材料 ①样品 种曲霉菌。 ②仪器和器具 载玻片、盖玻片、旋涡均匀器、血球计数板、电子天平、显微镜、接种

环、酒精灯、恒温摇床。 ③试剂 95%酒精、稀硫酸(1:l0)。 ④培养基 察氏液体培养基。 2、实验方法与步骤 (1)样品稀释 精确称取种曲 1g (称准至 0.002g),倒人盛有玻璃珠的 250mL 三角瓶内,加入 95%酒精 5mL、无菌水 20mL、稀硫酸(1:10)10mL,在旋涡均匀器上充分振荡,使种曲孢子分散,然 后用 3 层纱布过滤,用无菌水反复冲洗,使滤渣不含孢子,最后稀释至 500mL。 (2)制计数板 取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片, 用无菌滴管取孢子稀释液 1 小滴, 滴于盖玻片的 边缘处(不宜过多),让滴液自行渗入计数室中,注意不可有气泡产生。若有多余液滴,可用 吸水纸吸干,静止 5min,待孢子沉降。 (3)观察计数 用低倍镜头和高倍镜头观察,由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位 置,要在不同的焦距下才能看到,因而计数时必须逐格调动微调螺旋,才能不使之遗漏,如 孢子位于格的线上,数上线不数下线,数左线不数右线。 使用 16× 规格的计数板时,只计板上 4 个角上的 4 个中格(即 100 个小格),如果使用 25 25× 规格的计数板,除计 4 个角上的 4 个中格外,还需要计中央一个中格的数目(即 80 个 16 小格)。每个样品重复观察计数不少于 2 次,然后取其平均值。 (4)计算 对于 16× 的计数板: 25 孢子数(个/g)=(n/100)× 400× 000× 10 (V/m)=4× 4× 10 (nV/G) 式中:n 为 100 小格内孢子总数(个);V 为孢子稀释液体(mL);m 为样品质量(g)。 对于 25× 的计数板: 16 孢子数(个/g)=(n/80)× 400× 000× 10 (V/m)=5× 4× 10 (nV/m) 式中:n 为 80 小格内孢子总数(个);V 为孢子稀释液体(mL);m 为样品质量(g)。 (5)结果记录计算 样品稀释至每个小格所含孢子数在 10 个以内较适宜, 过多不易计数, 应进行稀释调整。 结果记入下表。

孢子数/ 计算次数 第一次 第二次 各中格孢子数 小格平均孢子数 稀释倍数 (1/g) 平均值

(二)酵母 酿酒酵母、产酯的异常汉逊酵母、球拟酵母均为有益酵母。对于酵母的检测,可以有如 下方法: 1、酵母菌发酵力的测定 (1)原理 大曲、小曲是糖化、发酵剂。其中的酵母能使酒醅中的还原糖发酵,生成酒精和二氧化 碳,反应式为: 发酵 C6H12O6 2C2H5OH+2CO2 所以可以使用在一定条件下制备的糖化液为培养基,测定发酵中生成的 CO2 量,以衡 量曲为发酵力。 (2)仪器 带发酵栓、容量为 250mL。 (3)试剂和溶液 ①硫酸溶液 5mol/L(1/2 硫酸) 。取 14mL 浓硫酸,边搅拌边缓缓加入 50mL 水中,用 水稀释至 100mL,不必标定。 ②0.1 碘液 0.2mol/L 碘液。不用标定 (4)糖化液的制备 取大米、玉米面或薯干淀粉原料 50g,加水 250mL,混匀,蒸煮 1-2h,使呈糊状。冷却 到 60℃.加入原料量 15%的大曲或小曲粉,再加入 50mL 预热到 60℃的水,搅匀。在 60℃糖 化 3-4h,至取出 1 滴与碘不嫌蓝色位置。加热到 90℃,用白布过滤,滤液备用。 (5)灭菌 用 150mL 糖化液与 250mL 发酵瓶中,赛上棉塞并包上油纸,记录液面高度。同时用油 纸包好发酵栓,一起放入灭菌锅中,在 98kPa 下灭菌 15min。

(6)发酵、测定 灭菌后的糖化液冷却到 25℃左右时,在无菌条件下加入曲粉 1g,发酵栓中加入 10mL5mol/L 硫酸。用石蜡密封发酵瓶,擦干瓶外壁,在千分之一感量的天平上称量。然后, 放入 25℃保温箱中发酵 48h。取出发酵瓶,轻轻摇动,是二氧化碳全部逸出,在同一天平上 再称。 发酵力(以二氧化碳的质量分数计,g/100g)=(m1-m2)*100/m 式中 m1——发酵前发酵瓶中加内容物质质量(g) ;m2——发酵后发酵瓶中加内容物质 质量(g) ;m——曲样质量(g) 2、酵母菌死灭温度的测定 经液态培养基培养的酵母菌,在 10min 即被杀死的温度,成为该菌的死灭温度。若死灭 温度较高,则往往混有野生酵母。若死灭温度发生变化,则说明酵母不纯或发生变异。 在 3 支无菌的 5mL 麦芽汁试管中加入用麦芽汁培养 24h 的酵母悬液 0.1mL。其中 1 支 试管插入温度计,另外两只不插。将 3 支试管浸入 40℃水浴中保温。待插温度计的试管温 度达到 40℃时,即开始计时,10min 后立即取出,放入冷水中冷却。同法作 42℃、44℃…… 至 60℃试验。再将各组试管置入 25℃的保温箱中,在 7 天内无发酵现象的最低温度,即为 该酵母的死灭温度。但通常在这最低温度的基础上再加 1-2℃,作为该酵母菌的真正死灭温 度。 3、酵母菌耐酒精浓度的测定 酿酒酵母在糖化液中发酵至一定的酒精浓度, 就停止发酵。 每株酵母能忍耐的最高酒精 浓度,是检验其特性的一个重要指标。 (1)材料 ①酿酒酵母曲汁或麦芽琼脂斜面试管菌株。 ②10° 曲汁或麦芽汁 Bx ③10mL V 字型发酵管 7 支,无菌的 2mL 及 10mL 刻度吸管个 1 支,酒精灯,接种环, 无水酒精。 (2)操作 在各发酵管中按下表加入曲汁或麦芽汁,在 100kPa 蒸汽下灭菌 20min 后,再于无菌条 件下加入无水酒精,静置 2 天,使酒精扩散均匀。

发酵管号 加曲汁或麦芽汁量

1 9.4

2 9.2 0.8 8

3 9.0 1.0 10

4 8.8 1.2 12

5 8.6 1.4 14

6 8.4 1.6 16

7 8.2 1.8 18

/mL 加无水酒精量/mL 酒精含量 /mL· (100mL)-1 6 0.6

挑取试管斜面均泥 1 环,接入各发酵管。在 25℃下培养 7 天,每天观察管中产生气泡 的状况。无气泡产生的管,说明酵母菌生长和发酵受到酒精的严重抑制,故可将比此管低 1 级的酒精浓度,作为该酵母菌的耐酒精浓度。 此外,可采用合适的培养基,对酵母菌的出芽率、耐酸能力及产酯能力等进行测定。 (三)细菌 己酸菌在浓香型白酒生产中是主要的产香菌; 耐高温芽孢杆菌在酱香型白酒的大曲中占 主导地位。白酒醅中含产适量乳酸、醋酸、丙酸等有机酸的细菌,有利于白酒的风味。窖泥 中含有适量的甲烷菌及丁酸菌也有利于浓香型白酒风味的形成。 现将这些细菌的检测方法方法介绍如下:

1、己酸菌产酸能力的测定 (1)菌源 窖泥、鱼塘泥是己酸菌栖息的主要场所,所以可以从中分离己酸菌。分离培养基可选有 如下简化培养基:乙醇 2%,磷酸氢二钾 0.04%,醋酸钠 0.5%,硫酸铵 0.05%,酵母膏 0.1%, 碳酸钙 1%,硫酸镁 0.02%,pH7.0,蒸馏水配制。 (2)发酵 ①培养基:磷酸氢二钾 0.1%,硫酸镁 0.002%,硫酸铵 0.005%,硫酸钠 0.005%,硫酸 亚铁 0.0005%,酵母膏 0.05%。121℃,灭菌 30min。冷却后加入 0.2mL 酒精,0.2g 灭菌碳 酸钙。 ②发酵过程:32-34℃,发酵培养 5-7 天。 (3)测定 ①定性 取发酵液 1mL 置于小试管中,加入乙醚 0.5mL 及 2%硫酸铜溶液 1mL,充分

摇动混匀,放置一定时间,待分层后的乙醚呈现蓝色,即可证明有己酸生成,颜色越深含量 越高。 ②定量 1M 三乙醇胺(取 15g 含量为 75%的三乙醇胺,用蒸馏水配成 100mL) ;1N 醋酸溶液;6.45%硝酸铜溶液。铜试剂(取 1M 三乙醇胺 9 份,1N 醋酸溶液 1 份,6.45%硝 酸铜溶液 10 份,三者在测定前临时混合) ;显色剂(取二乙基二硫代氨基甲酸钠——简称 DCC0.1g,溶于重蒸的正丁醇 100 中) 。 定量的操作过程: 事先将己酸发酵液用 2N 硫酸调至 pH2-3, 10 倍稀释酸化液 2-3mL 取 置于 100mL 分液漏斗中,加入铜试剂 3mL,再加入氯仿 5mL,抽提 2min,静置分层,水洗 氯仿层,分层后去水,4000r/min 离心 5min。取离心后的氯仿层 4mL,加入 DDC0.5mL,混 匀后与 450nm 波长下进行比色。有工作曲线计算结果。 工作曲线:称取 0.1000g 己酸,用氯仿溶解定溶 100mL。分别取标准己酸菌氯仿液 0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0mL,按照上述操作加铜试剂及氯仿,抽提,水洗,离心,加 DDC 混合比 色,魂之工作曲线。 2、嗜热芽孢杆菌的检测 汾酒中芽孢杆菌菌落较大,中间稍凸,向四周扩散,边缘不整齐,白色粉状,表面干燥, 革氏阴性杆菌,单个、成双或短链,有芽殖,多数生在中间,其中主要是枯杆菌,有水解淀 粉、分解蛋白质的能力,V、P 反应正,产膜,能产生二乙酰与 2 ,3 - 丁二醇,这些物质 对增加汾酒的绵甜与清香有一定作用,故芽孢杆菌仍看作是汾酒发酵的有益菌。 3、丙酸菌产酸能力的测定 (1)菌源 可采取窖泥为试样,以乳酸盐为碳源,酵母煮汁和消化蛋白为氮源,进行多次增殖后, 在无氧条件下做平板分离儿得到菌株。 (2)发酵 ①培养基:葡萄糖 2g,消化蛋白 1g,酵母煮汁 100mL,碳酸钙 1g,在 59kPa 蒸汽压下 灭菌 20min。 ②发酵过程:取 1 环原菌,接种于上述培养基中发酵 1 天后,在添加适量的碳酸钙继续 发酵 2 周即可。 (3)测定 ①原理:丙酸菌能将乳酸等发酵为丙酸和乙酸。而丙酸和乙酸均为挥发酸,故测定发酵 液中挥发酸的含量,即可知该菌的发酵能力。

②测定过程及计算:取发酵液 50mL,加入 2mL 浓度为 2.5mol/L 的硫酸,用水蒸汽蒸 馏,先将冷凝器直立,煮沸 10min 后,再蒸馏至馏出液为 400mL。 取出馏出液 200mL,测定其酸度。若改算为滴定 200mL 馏出液的酸度所需要的 0.1mol/LNaOH 的毫升数,则此数成为酸度,以 a 表示。 再取馏出液 200mL,加入上述蒸馏,缓慢地蒸馏出 100mL,称为半量馏出液。用 0.1mol/LNaOH 滴定中和,所消耗的毫升数用 b 表示。 以 P 表示水蒸气馏出液 200mL(相当于原发酵液 25mL)中所含丙酸在中和时所消耗的 0.1mol/LNaOH 毫升数;以 E 表示水蒸气馏出液 200mL 中乙酸在中和时所消耗的 0.1mol/LNaOH 毫升数。则 P 及 E 的计算式如下: P=(b-0.366*a)/0.219 E=a-P

100mL 发酵液中丙酸及乙酸的含量分别为 丙酸=7.4*P*4(mL) 乙酸=6*E*4(mL)

4、丁酸菌产酸能力的测定 (1)菌源 可采取窖泥为土样,将葡萄糖豆芽汁培养基煮沸片刻后,加入少量土样。继续煮沸 4-5min,加塞冷却至 35℃,保持此温度培养 2 天后,用厌氧分离法分离得到原菌。 (2)发酵 ①培养基:采用碳酸钙葡萄糖豆芽汁培养基:葡萄糖 10g,豆芽汁 100mL,59kPa 蒸汽 灭菌 15min 后,加入经干热灭菌的 CaCO35g,再常压灭菌 30min。 ②发酵过程:将原丁酸菌接种于上述培养基中,称瓶重。在 40℃下培养 14 天后,再称 重。 瓶的减轻量为丁酸菌发酵产生的氢气和二氧化碳的量, 部分二氧化碳为丁酸及其他酸类 与碳酸钙化合时产生。瓶的减重多少,表明丁酸菌发酵力的强弱。 (3)测定及计算 取发酵液 5mL,经滤纸过滤,将 2mL 滤液加入小试管中。再加入 CaCl-HCl 液 0.5mL 及氯仿 1mL。用手指压住管口,上下翻转 10 次,静置与管架上。管中上部液体分为 2 层, 下层为溶解丁酸铜的氯仿液。若氯仿液呈无色,则表明丁酸含量很少或无丁酸;若为蓝色或 绿色,色泽越重,表明丁酸含量越高。 将含丁酸盐的发酵液全部过滤所得的滤液及洗渣液进行蒸发浓缩, 则丁酸钙结晶成鳞片

状先析出。趁热过滤,烘干后,将粗丁酸钙称重,可计算出 100g 葡萄糖经丁酸菌发酵后所 得的粗丁酸钙的克数。

二、有害菌的检测
(一)有害菌的种类 这里所指的有害菌, 主要是指菌种纯培养的也太发酵法白酒及麸曲固态发酵法白酒和小 曲酒而言。 1、霉菌 青霉菌的生长温度较低,在制曲过程中极易污染此菌,能使成品酒呈苦味。灰绿曲霉及 孢子成灰褐色的小克银汗菌,是以 AS3.4309 菌株制麸曲时污染的“水毛菌”。 念珠霉是制大曲中“穿衣”及小曲挂白粉的主要菌,多被视为不良菌。但也有人分离到对 淀粉分解力较强的念珠霉,这说明念珠霉不一定都是不良菌。所以选育优良菌株时,不能因 某一株菌种某些性能较差而轻易地将应该菌同属、 同种的菌均下不同的结论。 链孢霉的生存 能力很强,一旦侵入曲房,就很难除,常在酒糟上生长。如果将酒糟远运至原理白酒生产车 间,可用此菌或某些细菌等在酒糟上培养营养价值较高的饲料。 在大曲中,犁头霉含量较多,一般表现为糖化力很低、且其大量的孢子使成品酒成苦涩 味或霉苦味。但是在汾酒中也分离到糖化力较高的菌株,被用于六曲香酒的生产中。 2、野生酵母 在以自然发酵的方式的白酒生产中,所谓野生酵母是相对于酿酒酵母和产酯酵母而言 的。当然也存在有害的杀伤酵母。 3、细菌 乳酸菌在大曲、小曲及其酒醅、酒醪中均有存在。酒醅、酒醪中含有少量的乳酸菌和醋 酸菌,如前所述,对白酒的口味有利,但含量较多则不利。若在麸曲及酒母培养中大量污染 这两种菌,则会导致酸败。 丁酸菌在麸曲培养过程中进行堆积而不翻拌时可常见, 它会影响出酒率。 粘液菌及大多 存在于陈酒糟及窖头泥中的枯草芽孢杆菌和马铃薯菌等,通常也是影响白酒生产中的有害 菌。但是枯草芽孢杆菌在酱香型大曲制作过程中可谓是有益菌,它能分泌多种蛋白酶。 在传统的大曲酒和小曲酒的培曲和发酵过程中, 通常是有益菌和有害菌共存, 且这些菌 相对数量,在不断变化之中。由于制曲或发酵条件等控制不当,有时候也会滋生某些腐败性 的细菌等,使成曲及酒质劣化。

(二)生产过程中有害菌的检测 1、水、空气、管道中微生物的检测 ①水的检测:将水样 1mL 于无菌培养皿中,与肉汤琼脂培养基均匀混合制成平板,在 37℃下培养 24-28h,计菌落数。若菌落为 0-100 个/mL,则为清净水;100-1000 个/mL 则为 可疑水;1000 个/mL 以上则为污染水。 ②空气:将麦芽汁琼脂及肉汤琼脂平板,放在待检测房间的中央,打开皿盖 5min 后再 盖好。麦芽汁琼脂培养皿倒置与 30℃保温箱中,肉汤琼脂培养皿导致与 37℃保温箱中,分 别培养 24h 后, 计菌落数。 通常认为在 5min 内以 100cm2 表面沉降的微生物量, 相当于 10m3 空气的微生物量,据此可求得 1m3 的空间的微生物量。 过滤空气纯度的检查, 可用酒精棉球将压缩空气的排放口擦拭消毒。 先使压缩空气排放 1min,再将平板培养基对准排气口 1min。然后加盖,置于保温箱中培养。 ③管道:先堵住管道的一端,再加入一定量的无菌水浸泡 10-20min。然后使水从另一 端流入无菌容器。取其 1mL 做平板检测。 2、曲、酒母、发酵醪(醅)的检测 (1)镜检法 ①直接法:在载玻片中央,用滴管注入 1 滴无菌水。用接种环挑取酒母,或醪液,或曲 的浸泡液 1 环,加入上述无菌水中。涂匀后小心地盖上盖玻片,要避免产生气泡,再用显微 镜观察菌况。 因试样中往往会含有蛋白质及树脂等杂质, 其形状类似于某些细菌, 故可在发酵菌液中 滴加 10% NaOH 溶液,使蛋白质等溶解后再镜检。 镜检时,通常找 20 个视野,每个视野中约 50 个菌体细胞。入戏可观察到约 1000 个细 菌细胞,以反映镜检时相对可靠度。根据 20 个视野内各种菌的比例,可知试样的质量。 优良的酿酒酵母多呈圆形或椭圆形,大小整齐,通常为 6-10μm;健壮的细胞具有紧密 附着的原生质薄膜,原生质均一或成颗粒状;液泡较小或无液泡;细胞繁殖活跃。若细胞具 有大量粒状原生质,液泡大,无芽殖细胞,则表明酵母菌已衰老。 ②染色法: 如对细菌的革兰氏染色, 测定酵母死活数的美兰染色和测定酵母细胞肝糖含 量的碘液染色法等。具体方法如下: 通常优良的菌株的死细胞数应少于 10%;正常的酿酒酵母,应有 70-75%的细胞含有肝 糖。 A.革兰氏染色:

a.涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做 一薄而均匀、直径约 lcm 的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 b. 干燥 于空气中自然干燥。 亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 c.固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色,常用加热法,即将 细菌涂片膜向上,通过火焰 3 次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染 色。 d.初染 于制片上滴加结晶紫染液,染 lmin 后,用水洗去剩余染料。 e.媒染 滴加卢戈氏碘液,lmin 后水洗。 f.脱色 滴加 95%乙醇脱色,摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需 时 30s 至 lmin),水洗。 g.复染 滴加石炭酸复红液复染 lmin,水洗。 h.滤纸吸干,油镜镜检。 B.测定酵母死活数的美兰染色:载片中央加一滴 0.01%美兰→无菌操作沾取少许酵母 菌于染液中→用镊子夹一盖玻片由一侧小心盖于液滴上(避免产生气泡)→静置 3′→镜检→计 死细胞数(30′后观察死细胞是否增加)。 C. 测定酵母细胞肝糖含量的碘液染色法: 在洁净的载玻片上滴一小滴哥氏碘液 (Lugol) , 取一环酵母菌液与碘液混匀,盖上盖玻片,镜检,菌体呈淡黄色,肝糖粒呈红褐色,在高倍 镜下观察。 (1) 培养法

A.野生酵母检查法: 通常除产酯酵母及发酵力强并能赋予成品久良好的口味的酵母之外 的酵母,均可成为野生酵母。其检查方法可以有如下几种。 a.酒石酸法:将酵母液接种于含 2%酒石酸的无菌麦芽汁中,于 30℃培养 24-48h。若能 进行发酵,则表明野生酵母存在,但某些野生酵母也不能发酵该培养基,故该法不能检测出 所有的野生酵母。 b.加入法:将被检酵母也在 50℃下加热 20min,杀死绝大多数酿酒酵母后,立刻用冷却 水冷却。 再将其转接于麦芽汁中, 观察野生酵母的生长状况; 或于醋酸钠琼脂平板培养基上, 观察子囊孢子形成的状况。酿酒酵母通常不形成子囊孢子,若形成也需要 72h 以上;但野生 酵母容易生成子囊孢子,且只需要 24-48h。采用该法,在 5*105 个/mL 酵母浓度下,只要 1 个野生酵母存在,也能检出。 c.高氏法: 培养基为: 碳酸钙 0.5g, 琼脂 1.5g, 自来水 100mL, 自然 pH, 灭菌 20min。 121

使用时将其制成平板, 并尽可能的使碳酸钙在保持悬浮状态时凝固。 由于培养基不含营养成 分,酵母菌不能增殖,故接种量应该大一些,也可以划线培养。在 25℃下培养数天后,大 部分能产生孢子的酵母即可形成子囊孢子。 此外,检出野生酵母的方法还有很多,如酒石酸蔗糖法、结晶紫法、对生长素的要求实 验、血清试验、巨大菌落形态观察等。但在酿酒酵母存在下,任何方法均难检出野生酵母, 因能产生混浊的野生酵母,本身即属于酵母属,故要识别其为哪一类是困难的。 B.比较法: 取盛有 250mL 麦芽汁的 500mL 三角瓶 2 个, 121℃灭菌后, 瓶接种 10-20mL 经 1 纯培养酿酒酵母,另每瓶接入 10-20mL 被检液。于 25℃培养 48h,比较其酸度,检验是否 污染杂菌。 C.酵母浸出汁培养法:将酵母培养液 1mL 接入酵母浸出汁中,25℃保温培养。若在 1-2 天内即产生混浊,则表明污染杂菌;无杂菌存在,则数日后培养液仍未清澈。 酵母浸出汁的制备:称取 200g 无淀粉压榨酵母及 2g 干蛋白,拌入 2L 水中。待蛋白溶 解后,在 121℃蒸汽下加热 10min。冷却后,将浸出液过滤,分装于三角瓶中,110℃蒸汽灭 菌 15min 即可。 D.克兰西思氏法:取发酵液 3mL,加入 1%氯化铵 3mL 摇匀,静置 1h 后,加 2mL 无菌 水稀释。取上述稀释液 2mL,与 15mL 麦芽汁琼脂培养基混匀后,倾入培养皿,与 25℃培 养 5d。挑取典型菌落进行形态观察和生理生化试验,检测酸败菌的种类。 E.基塞耳与达金氏法:培养基配方为:酵母膏 0.5g,硫酸锰 0.2g,麦芽汁 100mL,三氯 化铁 0.005g,磷酸二氢钾 0.5g,放线菌酮 0.005g,氯化钙 0.15g,氯化钾 0.4g,琼脂 15g, 蒸馏水 1000mL。将污染醪液在上述平板培养基上划线培养,凡乳酸菌均能生长良好,再挑 取典型菌落进行形态观察和生理生化试验。 必要时, 还应对原料上的霉菌等进行检测。 如采用改进的马铃薯葡萄糖培养基培养犁头 霉;用麦芽汁氯化钠培养基检测青霉菌等。

第二章

白酒微生物的鉴定

研究某种微生物的性状,确定其是否属于已知的某分类单元,这种工作称之为鉴定。鉴 定工作要进行到分类学上哪个分类单元的水平,则需看研究的目的。所以,有时人们将鉴定 叫做分类,这种说法其实是错误的,至少是不确切的。因为所谓分类,是将许多微生物的分

类群加以排列。而在排列这些分类群时,对于多细胞生物,则多半带有系统发生学的含义。 但就目前来说,微生物形态学的特征在鉴定和分类工作中占有重要的地位。当然,也正在逐 步地确立根据微生物的组成成分进行分类的化学分类学的地位。 关于各类微生物的鉴定方法,人们往往借助于一些经典著作,在本书中不必综述。这里 仅将白酒工业中某些菌种鉴定的实例,简介如下。

一、产酯酵母的鉴定
四川省食品发酵工业研究设计院名优酒研究中心, 曾以娄德酵母分类著作为依据, 从形 态和生理特征两方面,对 2 株产酯酵母进行了鉴定。 (一)材料和方法 1、菌株 2.155,2.182 2、菌株优化 将上述 2 菌株制成菌悬浊液,在麦芽汁平板培养基上划线,于 28℃培养 3 天后,挑取 典型菌落,转接于麦芽汁琼脂试管斜面上,培养后作为测试菌株。 3、形态特征的实验内容 ①在麦芽汁中培养 3 天,在室温下一个月后观察其形态特征。 ②在麦芽汁琼脂试管斜面培养基上培养 3 天,在室温下一个月后观察其形态。 ③在加盖片的马铃薯琼脂培养基上培养 3 天后观察假菌丝。 ④采用石膏块、高氏、麦氏及克氏培养基,观察子囊孢子的形成及其形态。 4、生理特征的试验项目 包括能发酵的糖类、能同化的糖类、同化乙醇以及硝酸钾的状况、能否利用盐酸乙胺, 以及产酯能力等。 (二)试验结果 1、形态及培养特征 ①2.155 菌株:在麦芽汁中,28℃培养 3 天,细胞呈圆形、卵形、椭圆形、腊肠性,多 边芽殖;细胞大小为(2.6-1.5)um× (5.1-16.7)um。能发酵麦芽汁,培养液呈轻微混浊; 在室温下 1 一个月后,培养液变清,沉淀较紧密。 在麦芽汁琼脂试管斜面培养基上,28℃下培养 3 天,细胞呈圆形、卵形、椭圆形、腊肠 性。细胞大小为(2.6-6.2)um× (5.1-17.4)um。菌落呈乳白色,无光泽;中间隆起,有细

皱纹,稠如奶油;边缘呈细齿状;直径 2.5-5mm。在室温下一个月后,菌落呈乳黄色,略扩 展。 在加盖片的马铃薯琼脂培养基上,能生成假丝酵母状的假菌丝。 在石膏块、高、麦氏以及克氏培养基上,未能形成子囊孢子。 ②2.182 菌株:在麦芽汁中 28℃培养 3 天,细胞呈圆形、卵形、椭圆形、腊肠性,多边 芽殖;细胞大小为(2.6-5.1)um× (6.4-18.0)um。发酵液呈微浊状态,在室温下 1 一个月 后,发酵液变清而沉淀较紧密。 在麦芽汁琼脂试管斜面培养基上,28℃ 下培养 3 天,细胞呈圆形、卵形、椭圆形、腊肠 性。细胞大小为(3.2-5.5)um× (7.2-18.0)um。菌落呈乳白色;中间隆起,呈似放射状, 有细皱,稠如奶油;边缘呈细齿状;直径 2.5-3.5mm。在室温下一个月后,菌落呈浅乳黄色, 略有扩展。 在加盖片的马铃薯琼脂培养基上,生成假丝酵母状假菌丝。 在石膏块、高氏、麦氏、克氏培养基上,未能生成子囊孢子。 2、生理特征 ① 发酵糖类:2 株菌种均能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、1/3 棉子糖;对乳糖、蜜二糖以 及可溶性淀粉均不能发酵。2.182 能发酵半乳糖,但 2.155 无此能力。 ② 能同化的碳源及氮源:2 株菌种对葡萄糖、半乳糖、乙醇、赤藓醇、甘露醇、乳酸、 甘油、硫酸铵、硝酸钾均能同化;而对乳糖、棉子糖、蜜二糖、海藻糖、纤维二糖、可溶性 淀粉、D-木糖、鼠李糖、肌醇、甜醇、阿东醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖均不能通话。 3、定名结果 2 株菌种具有如下特征:多边芽殖,无掷孢子,无子囊孢子,有假菌丝而无冬孢子,菌 落无色素等,故属于半知菌纲、丛梗孢目。隐球酵母科、假丝酵母属(Candida) 。又因它们 均具有如下生理性能:均可发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖,2.182 尚可发酵半乳糖, 均能同化硝酸盐、赤藓醇,均不同化蜜二糖,均能在 25-30℃ 下生长,故可定名为产膜假丝 酵母(Candida pelliculosa) 。

二、己酸菌的鉴定
据报道, 某单位从泸酒老窖泥中分离所得产己酸的梭状芽孢杆菌菌种, 其形态特征及生 理特性相似, 故属于同一种的不同株。 按经典著作 《伯杰氏细菌鉴定手册》 第八版分类系统, 被列入梭菌属中产己酸的己酸菌仅有 1 个种,命名为克氏梭状芽孢杆菌(Clostridium

kluyveri) ,并认为严格厌氧;在普通实验室培养基上不生长,不利用葡萄糖,不水解明胶; 不能直接由乙酸合成己酸。上述特性,与老窖泥中分离所得的己酸菌菌株的特性不吻合,故 这些菌种难划入《伯杰氏细菌鉴定手册》中梭菌属水解明胶的 5 个种内。所以,从泸酒老窖 泥中分离得到己酸菌菌株,被初步定名为泸曲梭菌(Clostridium lushun) 。 对己酸菌菌株发酵液中己酸的测定, 定性分析可采用硫酸铜显色法和纸层析法; 定量分 析可采用比色法或气相色谱法。具体方法如下: 定性:采用硫酸铜显色法,即取 10mL 发酵液置试管中,用滴管滴入 20%硫酸铜溶液 5 滴,发酵液若呈兰绿色,则证明有已酸存在。兰绿色愈深,己酸产量愈高。 定量:一是分光光度计法,根据内蒙轻工科学研究所试制的简易定量分析方法,即是采 用醋酸铜为显色剂, 利用有机溶剂乙醚为抽提剂, 对过量的己酸发酵液显色抽提后进行比色。 根据标准曲线即可得知已酸含量。

三、甲烷菌的鉴定
能产生物能---沼气的细菌, 统称为甲烷细菌。 甲烷细菌在自然界分布极广, 十壤、 污泥、 池沼、湖泊,凡是污物腐烂的地方,栖息的甲烷面最多。几于所有有机物都可以用于甲烷发 酵。只有矿物油、醚类、木质素较难以作为沼气发酵的基质。 对甲烷发酵,人们虽然早有所知,但对它的研究,则是近百年的事。1904 年,奥梅良 斯基分离出一株甲烷细菌,称为奥氏甲烷杆菌,后来发现它并不是纯种。1967 年,布赖持 研究证明,它是短秆乙醇氧化茵——S 菌和甲烷长杆菌构成的共生互营联合体——共栖种。 由于甲烷菌培养困难,以致半个世纪以来甲烷茵的研究进展很慢。直到 1958 年。在巴克尔 描述的 8 个甲烷细菌中,也仅有 3 个纯种。自从亨格持发明了厌氧滚管法,逐为甲烷菌分离 创造了有利条件,后经本断改进而日臻完善。20 世纪 70 年代,科学家们对甲烷菌的生理学 进行了深入的研究,发现甲烷细菌的细胞内含有 F420、F342 等荧光物质,推动了甲烷菌的 研究深入。1985 年,伯杰氏分离鉴定的甲烷茵已超过 30 种。 甲烷菌的鉴定可根据甲烷菌的如下特征与形态进行:① 甲烷菌只行在严格的厌氧条件 下,才能够生长。② 甲烷菌只能以氢气、二氧化碳、甲醇、乙醇、乙酸为能源和碳源,才能 很好生长,不能在其他培养基中生长。③ 产生氏过程命,必然有甲烷产生。首先,形态上该 菌细胞呈长杆状,两头钝圆,中部略细,直或不规则弯曲,单个黄双连,液态培养时成几个 和几十个细胞的长链,也有成团的。菌宽为 0.45~0.5μM,长 2~5.5μM,细胞能均等分裂或 不等分裂.芽孢染色为阴性,不耐热,革兰氏呈阳性,菌落不运动。鞭毛染色呈阴性,电镜

观察未见鞭毛。采用滚管培养 7 天后,呈现针状大菌落,其直径为 0.1~0.25MM,菌落为丝 状,中部较细,向外缘逐趋稀疏,边缘扩散,菌落表面呈不规则凸起;菌落成黄褐色,荧光 明亮而持久。菌体超微结构,负染电镜照片显示出菌体具有深色的小斑点;超薄切片有薄而 平滑的细胞壁,有些细胞可见到内膜的内膜结构,均显示接近细菌全长的纤丝状 DNA 区. 与产甲烷杆菌科为绝大多数中的特征相似。其次,生理特性:该菌只能利用氢气为能源,以 二氧化碳为碳源进行生长和产甲烷,不能利用甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醇、乙醇、葡萄 糖及三甲胺。属温性细菌,生长温度为 25~45℃ 最适生长温度为 35℃ 。生长 PH 为 6.0~9.0, 生长最佳 pH 为 7。 茅台试点期间,只从共栖种中分离出 1 种中烷短杆菌,在显微镜下稍有不慎,很容易把 杆菌看成球菌。在空气中分离,真空下培养,恐有许多疏漏。 成郁生物研究所以先进的设备、熟练的操作,从窖泥小发现多种甲烷细菌。其荧光菌的 形态有长杆状、小球状、梨形、叠形等。在各名酒厂老窖泥中,栖息的甲烷菌种类及数量和 分布情况各打所不同。 产甲烷细菌有独特的 F420、F342 特征,在氧化状态下,在 420nm 处可见其发出的蓝绿 色或亮绿色焚光,这是甲烷细菌独有的特性。利用这一特性,可以在滚管上检出琼脂上的菌 落是否为甲烷菌。这是分离鉴定甲烷菌的重要于段。 对于甲烷发酵, 存在异种间的协同作用酒精发酵时需要酵母菌, 丙酮发酵时需用丙酮菌, 然而甲烷发酵并不足依靠一种甲烷菌来完成的。常常是上壤细菌混合培养,协同作用,通过 接力赛的力式,一棒传—棒,最终产物才是甲烷与 CO2。在甲烷比氧发酵过程中,首批微生 物将有机物降解,再由生酸菌生成乙酸及氢。然后才由甲烷面生成中烷及 CO2。即甲烷的生 成是出三大菌群协同作用的结果。 即使在甲烷菌之间, 也在相互协同作用。 巴克尔实验认为, 缓慢氧化型甲烷杆菌将 C4--C6 的脂肪酸分解成丙酸;而产甲烷的丙酸杆菌把丙酸分解成乙 酸、甲烷及 CO2。从 C4-C6 的简单脂肪酸到生成甲烷,还需 3 种甲烷茵的协同作战,足以说 明甲烷发酵的复杂性。至于甲烷与己酸菌的共栖中的作用,生成己酸和各种气体,目前我们 知道的还很少。

四、乳酸菌、醋酸菌的鉴定
在白酒生产中,通常将乳酸菌.芽孢杆菌等均认为有害菌,但不宜一概而论,应分别研 究。研究细菌的方法,在形态上首先要分清是球菌还是杆菌,并作一系列的生理实验。.最 重要的形态鉴别方法为革兰氏染色法、芽孢染色法、及鞭毛染色法;经常采用生理生化鉴别

法包括糖发酵,糖产酸,V.P.反应,吲哚反应,甲基红是试验,硫化氢及过氧化氢酶的生成 等。 (一)乳酸菌的鉴定 贝吉氏细菌分类系统,将同型或异型乳酸菌统归于乳酸菌科,包括:乳酸杆菌和乳球菌 的各个属;而在克拉西尼柯夫的系统中,则将各种乳酸菌归于各个科。 有的白酒厂,主要从如下几方面对生产中分离到的乳酸杆菌株作鉴定;观察菌落形态, 作革兰氏染色,观察细胞形状、大小、排列,异染颗粒和荚膜的有无。大多数乳酸菌不产过 氧化氢酶,用 5%~10%浓度的双氧水,滴至菌落表面时,不产生气泡,这一特性,可明显地 与芽孢杆菌。肠杆菌及醋酸菌区分开。可是,足球菌在葡萄糖基质上偶尔也产过氧化氢酶, 但在蔗糖基质上则不产过氧化氢酶。 进行牛磺胆酸钠或抗胆汁试验, 是区别双球菌和乳链球 菌的重要依据。在 1mL 培养 24h 的新鲜肉汁菌液中,添加 0.1~0.3mL 的 10%牛磺胆酸钠或 甘油酸钠。若呈白色均匀的混浊,则为牛磺胆酸钠不溶解菌体的象征,谓抗胆汁;若加入牛 磺胆酸钠后,菌液清凉透明,则证明菌体已被溶解,谓不抗胆汁。硝酸盐还原性是足球菌的 重要特性产生乳酸的足球菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 亚硝酸盐与托洛斯独夫(Trosdorf) 氏试剂和格利斯氏(Gress)试剂反应,分别呈蓝色和红色,采用上述试验,可将乳球菌鉴 定到属。鉴定乳杆菌的方法则更为简易,将乳杆菌的发酵液进行纸上层析,若产乳酸且革兰 氏染色为阳性,则即可鉴别。 通常,从清香型大曲及酒醅中分离到的乳酸菌,多为同型发酵乳杆菌。 (二)醋酸菌的鉴定 也是从形态及生化两方面进行鉴定;醋酸杆菌呈短杆至球杆状,有些变异型呈丝状体, 有单个、双链或短链。培养 24h 的新鲜醋酸菌,革兰氏染色呈阴性,醋酸菌除过氧化菌群之 外,其余群不产过氧化氢酶,醋酸菌在酵母汁葡萄糖液中培养 5 天后,纸上层析证明有醋酸 或非挥发性酸层析不显酸斑,具有如上特性者,即为醋酸菌。 醋酸杆菌为极毛杆菌科的一个属。 大部分醋酸菌能利用葡萄糖产醋酸; 除过氧化菌群外, 均可氧化乙醇为醋酸;醋酸菌能氧化葡萄糖为葡萄糖酸;氧化甘油生成磷酸二羟丙酮;氧化 甘露醇为 5-酮葡萄糖酸。醋酸菌是清凉茶醇发酵的重要微生物。因此,醋酸菌在固态清香 型大曲酒醅中不能简单地认为是有害杂菌, 应保证其一定的含量。 清香型白酒的中温大曲中 的醋酸菌, 其生酸能力较强, 通常 1mL 发酵液在滴定酸度时要消耗 0.1mol/L 的 NaOH 2~3mL。 若需将醋酸菌菌种鉴定到种,则可根据佛拉都(Frateur)氏醋酸群和种的检索表加以鉴定。

习 题 一、填空题 1、 酒精中微量物质经过老熟过程中的氧化还原于酯化作用, 生成了 物质,从而增添了酒的 2、平板划线分离法常用于 二、是非题 3、酒精发酵的主体是细菌。 4、青霉菌的孢子耐热性强,它的繁殖温度较高,是制麸曲和大曲时,常见的杂菌。 5、醋酸菌的形态各异,但在大曲中以球菌居多,且是典型的好氧性菌。 6、青霉在大曲或酿酒生产上完全属于有害菌。 7、强化曲和普通曲的区别是前者人为地接入大量的有益微生物。 8、根霉具有一定的产酸能力。 9、曲霉菌对碳源的选择顺序是:麦芽糖、淀粉、糊精、葡萄糖、以麦芽糖为最好。 三、选择题 10、曲霉是 微生物。 ,突出了自身的独特风格。 和菌落蔓延性小的微生物的分离纯化。 和 类

A、好氧性;B、兼性好氧性;C、厌氧性 11、从理论上讲,有益微生物(主要指酵母菌)的最适宜温度是 A、25-27;B、28-30;C、31-34 12、醋酸菌有一个致命的弱点是干燥 A、高;B、中;C、低 13、乳酸菌是 菌。 温的环境下芽孢会失去发芽能力。 。

A、酵母;B、霉;C、细 14、己酸菌、丁酸菌等窖泥功能菌的最适温度是 A、25-28;B、28-30;C、30-32;D、32-34 15、根霉所产生的酸主要是 A、乙酸;B、延胡索酸;C、乳酸;D 己酸 16、进行乳酸发酵的主要微生物是 A、霉菌;B 细菌;C 酵母菌、 乳酸菌 ;D 。 。 ℃ 。


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