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人教版选修三1.2基因工程的基本操作程序


基因工程的基本操作程序
?目的基因的获取
?基因表达载体的构建 ?将目的基因导入受体细胞 ?目的基因的检测与鉴定
总结 练习

(一)目的基因的获取
自然界中已有的物种中分离出来 1.来源: 人工的方法合成

2.目的基因:主要是指编码蛋白质的基因 3.获取方法:
(1)基因文库中获取

(2)PCR技术扩增

(3)化学方法人工合成

(1)从基因文库中获取目的基因
1. 基因文库概念: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导 入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种 生物的不同的基因,称为基因文库 2. 基因文库种类: 基因组文库: 含有一种生物的全部基因

部分基因文库: 含有一种生物的部分基因 (cDNA文库)

基因组 文库与 部分基 因文库 的关系

3. 基因文库构建
限制酶

(1)基因组文库的构建 提取某种生物的全部DNA 限制酶 一定大小的DNA片段 与载体连接

基因组DNA

基因重组

体外包装

导入受体菌中储存

受体菌

基因组文库

(2)cDNA文库的构建
逆转录酶 mRNA 水解RNA 核酸酶H DNA聚合酶 载体连接导 该生物 入受体菌群 cDNA文库

杂交双链 单链DNA

双链DNA

思考:为什么用生物发育某个时期mRNA反转录得 的DNA只有这种生物的部分基因? 某个时期的发育是基因选择性表达的结果

基因组文库与cDNA文库的区别

原核细胞的基因结构

编码区:指导蛋白质合成,即编码蛋白质 原核细胞基因 非编码区:不能指导蛋白质的合成,起调控 表达作用,如启动子、终止子 非编码区 启动子:起始转录,有与RNA聚合酶结合位点

终止子:终止转录的DNA片段

真核细胞的基因结构

启动子

终止子

外显子:能编码蛋白质 编码区 的DNA序列 (间隔、不连续) 内含子:不能编码蛋白 质的DNA序列 真核细胞基因 非编码区:与原核生物具有相似功能的启 动子、终止子

(一)目的基因的获取 (1)从基因文库中获取目的基因 (2)利用PCR技术扩增目的基因
前提:一段已知目的基因核苷酸序列,以便合成引物 原理:DNA的复制 模板 (目的基因) 条件 原料(脱氧核苷酸) 引物(一小段单链DNA) 热稳定DNA聚合酶(耐高温) 扩增形式: 指数形式(2n)

高温变性

低温退火

适温延伸

(二)利用PCR扩增目的基因 1、过程

复习:
目的基因获取 基因表达载体构建 1.基因工程操作程序: ____________,____________ 目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 ____________________,______________________. 基因文库中获取 PCR技术扩增 2.目的基因获取方法:____________,____________ 化学方法人工合成 ________________。 基因组文库 部分基因文库 3.基因文库种类:____________,____________ 生物体外复制 4.PCR进行的场所___________ ,短时间内大量扩增 目的基因 __________. DNA双链复制 模板DNA 5.PCR原理___________ ,所需条件______________, 引物 Taq酶 四种脱氧核苷酸 _____________,______________,______________.

随堂闯关

PCR技术扩增过程

1.DNA变性(90℃-95℃): 单链DNA 双链DNA模板在热作用下,氢键 断裂,形成_______ 2.退火(55℃-60℃): 引物 与 DNA 模板结合,形成局部双链。 3.延伸(70℃-75℃):
合成链在

taq酶

作用下延伸,合成互补的DNA。

4.重复循环多次

(一)目的基因的获取
(1)从基因文库中获取目的基因 (2)利用PCR技术扩增目的基因 (3)运用化学方法人工合成
前提:基因比较小、核苷酸序列已知 蛋白质 推测 mRNA 推测 基因DNA 合成 核苷酸 的核苷酸 的氨基 序列 序列 酸顺序 目的 基因

(一)目的基因的获取
(1)从基因文库中获取目的基因
基因序列未知或只知一小段;

一种生物中提取多种目的基因

(2)利用PCR技术扩增目的基因
核苷酸序列已知; 目的基因较大

(3)运用化学方法人工合成
核苷酸序列已知;
目的基因较小

(二)表达载体的构建

基因工程的核心

1.构建表达载体的目的是什么?

2.表达载体需由哪几部分组成?各部分的作用
是什么?

3.如何构建表达载体?

目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在, 并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能 够表达和发挥作用。 基因表达载体的组成:
a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因

? 启动子: 位于基因的首端的一段特殊的DNA片断, 它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能 驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质

启动子 结构蛋白基因
调节基 因
RNA聚合酶

操纵基 因

结构基 因

RNA聚合酶

终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA 片断,能终止mRNA的转录

标记基因: 作用是为了鉴别受体细胞中是否含 有目的基因,从而将有目的基因的 细胞筛选出来

基因表达载体的构建过程: 1.用一定的_________切割 限制酶 质粒,使其出现一个切 黏性末端 口,露出____________。
同一种限制酶 2.用_____________切断目 相同 的基因,使其产生_____ 的黏性末端 ___________。 切口 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处, DNA连接酶 再加入适量___________,形成了一个重组 DNA分子(重组质粒)

(三)将目的基因导入受体细胞 1.转化: 导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法

花粉管通道法
2.方法 导入动物细胞 ——显微注射法 导入微生物细胞 —— Ca+ 处理法

1.农杆菌特点:易感染双子叶植物和裸子植物。
Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上

2. 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 转 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 化

(三)将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 导入植物细胞 基因枪法 花粉管通道法

方法 导入动物细胞 ——显微注射法 导入微生物细胞 —— Ca+ 处理法

导入动物细胞
含目的基因 的表达载体 提纯
取卵 (受精卵)
显微 注射

显微注射技术

雌性动物输 卵管或子宫 发育 转基因 动 物

移 植

含目的基因 的受精卵

问题
为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞 是受精卵?

导入微生物细胞
1.常用菌: 大肠杆菌 2.微生物作受体细胞原因: 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 处理细胞→ 感受态 细胞 →表达载体与感受态细胞混合→ _________细 感受态 胞吸收DNA分子。 3.转化方法: Ca2+

(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
?导入目的基因后需要检测哪些方面? ?各采取什么方法?

?如何操作?
?前两步检测的目的是什么?

(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交

分子 检测

③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原-抗体杂交 个体 鉴定: 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等

DNA分子杂交技术
1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
提取受体生 物全部DNA
适当限制 酶切割 用同位素标记的

DNA片段
目的基因片段杂交

显 出 杂交带

(表明目的基因已插入)

分子杂交技术
2. 检测目的基因是否转录出了mRNA
用同位素标记的 目的基因片段杂交

提取受体生 物的mRNA

显 出 杂交带

(表明目的基因已转录出了mRNA)

抗原—抗体杂交技术
3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质
提取受体生 物的蛋白质
与相应抗体杂交

显 出 杂交带

(表明目的基因已形成蛋白质产品)

个体水平鉴定
例:用棉铃饲喂棉铃虫,如虫吃后不出现中毒症状,说明
未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死

亡,则说明摄入了抗虫基因并得到表达。

归纳: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因
? 从基因文库 ? 利用PCR技术扩增 ? 化学方法人工合成

2. 构建基因表达载体
? 目的基因、启动子、终止子、标记基因

3. 将目的基因导入受体细胞
? 农杆菌转化法、显微注射法、Ca+处理法

4. 目的基因的检测与鉴定
? 检测:是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定

随堂闯关

1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容,正确的组合是

2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) ①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥

3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因,该抗 性基因在基因工程中的主要作用是 A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.有利于对目的基因是否导入进行检测 C.增加质粒分子的分子量 D.便于与外源基因连接
4. 有关基因工程的叙述正确的是 A.限制酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成是在细胞内完成的 C.质粒都可作为运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

5.哪项不是基因表达载体的组成部分( A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因

)

6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( A.基因枪法 B.显微注射法 C.农杆菌转化法 D.花粉管通道法

)

尝试设计
胰岛素是治疗糖尿病的特效药,长期以 来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取, 100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素,其产 量之低和价格之高可想而知。 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌 生产出人的胰岛素,想一想,如何设计?

高梦昕 战扬 王秦威 王泽威 丛丹日

4 4 4 4 4

21 21 21 21 21

李梦颖 曲姣蓉 张宁 杜鹏 胡子涵

4 4 4 4 4

19 19 19 19 19

金虹豆
努尔比耶 彭博

4
4 4

21
21 20

高荣
邢伟洪 耿楚惠 任猛 李隆彰 高林腾 滕春光 丁朝熙

4
4 4 4 4 4 4 4

19
19 19 19 19 19 19 19

戚晏铭
朱家岐 曲萌萌 宋慧南 刘衍敏 高瑞

4
4 4 4 4 4

20
20 20 20 20 20


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