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DNA分子标记技术在农作物品种鉴定上的应用


· 种子科技 ·
文章编号: 1005-2690 (2010 )10-0019-03

· · 2010(10)
中图分类号: Q 789 文献标志码: A

· 专题综述 ·

DNA分子标记技术在农作物品种鉴定上的应用
李志勇, 谢华峰, 力, 磊 张 赵 ( 河北省种子管理总站, 河北 石家庄 050031)
摘 要:文章概述了利用 DNA 分子标记技术 FLP、 APD、 、 (R R SSR AFLP、 ISSR 和 STS 等) 进行品种鉴定的原理、 特点和研 成本低、 自动化、 不受环境影响等优点, DNA 分子标记技术在品 究概况, DNA 分子水平上进行品种鉴定具有准确可靠、 从 种鉴定方面具有广阔的应用前景。 关键词:DNA; 分子; 标记; 品种; 纯度; 真实性; 鉴定

优良品种在作物各种增产因素中占 30% ~ 40% 。 种子质量直接影响优良品种的增产效果, 品种混杂和 纯度降低会明显降低产量 [1]。 快速准确地鉴定品种和 进行纯度分析对于种子质量标准化、品种审定、假种鉴 别、产权纠纷均有重要作用 [2]。 目前,我国种子生产和 经营管理还不太规范,不合格种子屡屡混入市场,造成 减产和经济损失。 因此, 快速准确进行品种鉴定就显 得尤为重要。 多年来, 品种纯度和真伪是以形态学标 记为依据的 [3]。 这种方法虽简单经济,但周期长,花费 大,不仅受季节限制,而且很多性状的表现受栽培措施 及环境因子的影响, 鉴定者的观察经验也制约着鉴定 的准确性 [4]。 蛋白质电泳和同工酶电泳等生化标记鉴 定法也曾被用来进行品种鉴定 [5,6]。 同工酶和种子贮藏 蛋白均是基因的直接表达产物, 它们的多样性能在一 定程度上反映不同品种 DNA 组成上的差异。 从遗传 学角度上来看,品种纯度和真伪鉴定实质上是对品种 基因型的鉴定。 形态标记和生化标记均是基因表达产 物的反映, 鉴定品种真实性和纯度时是不够完美的。 因此,只有通过直接鉴定品种的 DNA 分子本身才准确 可靠 [7]。 DNA 分子标记是 DNA 水平上遗传多态性的直 接反映, 可准确可靠地用来进行品种纯度和真实性鉴 定。 但是,利用 DNA 分子标记进行品种纯度和真实性 的鉴定,首先要构建品种的标准 DNA 指纹图谱。目前, 已构建的 DNA 指纹图谱主要有限制性片断长度多态 性 (Restriction fragment polymorphism , 简 称 RFLP) 、 随 机 扩 增 多 态 性 DNA (Random amplified polymorphic DNA, 简 称 RAPD) 、简 单 序 列 重 复 (Simple sequence repeat ,简称 SSR) 、扩增片断 长度多态性 (Amplified fragment length polymorphism ,简 称 AFLP) 、内 部 简 单 序 列 重 复 (Inter-Simple sequence repeat , 简 称 ISSR) 和 序 列 标志位点 (Sequence tagged site ,简称 STS) 等。

小。 不同来源的 DNA 有不同的限制性酶切位点,经酶 切后形成的 DNA 片段大小的差异就是限制性片段长 度多态性(RFLP )[8]。 Smith 利用 RFLP 技术,用 38 个探 针成功地将 78 个玉米杂交种区分开, 共得到 288 个 RFLP 标记 [9]。 Vacino 等利用 RFLP 技术,用 2 个特异 性的麦谷蛋白和麦醇溶蛋白探针,将 54 个意大利普通 小麦品种区分开[10]。 此外,RFLP 标记技术先后在水稻、大 麦、谷子、黄瓜、辣椒等园艺作物上得到广泛应用 [11 ~ 13]。 RFLP 标记技术的优点是标记量大, 等位基因间 共显性可区分纯合子和杂合子;缺点是工作量大,成本 高,要求的 DNA 量大且纯度要高。 2 基于 PCR 的分子标记 PCR 技术由美国 K.Mullis 于 1983 年发 明 , 基 于 PCR 技术的分子标记相继产生。

2.1

RAPD

1

RFLP RFLP 技术最早是由 Grodzicker 建立的。 其原理是 检测 DNA 由限制性内切酶切后形成的 DNA 片段的大
师,从事种子管理工作。 E-mail :braverylee@163.com 。

作者简介:李志勇(1972- ),男,河北省石家庄人。 博士,高级农艺

由 Willims 、Welsh 、McClelland 等 分 别 独 立 建 立 。 用一种由 10 个核苷酸组成的随机引物, 采用 PCR 技 术对基因组的几个区域进行扩增, 产生大小不同的 DNA ,即为随机扩增多态性 [14]。 余四斌等利 用 RAPD 技 术 , 对 珍 汕 97B 和 明 恢 及其组合汕优 63 进行了分析,结果表明,有一个引 63 物 AD04 可将珍汕 97B 、 明恢 63 及其组合汕优 63 区 分开来, 并能进行纯度鉴定, 且比较了田间试验与 RAPD 结果,二者一致 [15]。 杨剑波等、邵启明等、陈洪等 用 RAPD 标记技术在汕优 63 品种的纯度鉴定上也进 行了研究 [16 ~ 18]。 陈一华等对 12 个优良玉米自交系的 DNA 进 行 了 RAPD 分 析 , 建 立 了 12 个 自 交 系 的 RAPD 图谱,可用做品种纯度和真实性鉴定 [19]。 邱丽娟 等 利 用 RAPD 标 记 技 术 分 析 了 中 国 大 豆 和 美 国 大 豆 种质,认为 RAPD 标记技术可有效区分大豆种质 [20]。 郭 旺珍等在棉花上、许明辉等在烟草上用 RAPD 标记技 术进行了分析,认为 RAPD 技术进行品种纯度鉴定是 可行的 [21,22]。 RAPD 标记技术的优点是仅需少量 DNA ,简单快 速,成本低;缺点是稳定性差,重复性不好,显性,不能 鉴定杂合子。 ·19·

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2.2 SSR
根据微卫星重复序列两端的保守序列设计引物 , 用 PCR 来扩增重复序列的多态性。 SSR 主要依赖于基 本单元次数的变异, 而这种变异在生物群体中是大量 存在的。 目前,SSR 标记已广泛应用于种质鉴定等。 李 晓辉等利用 58 对引物对 21 份玉米骨干自交系及其组 配的 13 杂交种进行了 SSR 分析, 利用两个或三个引 物组合构建的 SSR 图谱, 通过统计测验可将 13 个杂 交种区 分开来,认为 SSR 技术可准确 、快 速 地 鉴 定 玉 米杂交种种子纯度 [23]。 Senior 等在 4% Metaphor 琼脂糖 上检测了 70 对 SSR 引 物 对 94 个 玉 米 自 交 系 的 扩 增 产物,共检测到 365 个等位基因变异 [24]。 SSR 标记的优点是具有大量的等位差异, 多态性 十分丰富,并且操作简便,稳定可靠;缺点是前期工作 量大,必须开发大量的引物。

2.5

STS STS 通过设计特定的引物,使其与基因组 DNA 序

2.3

AFLP

由 Zabeau 等(1993 )发明。 通过对基因组 DNA 酶 切片段的选择性扩增来检测 DNA 酶切片段长度的多 态性。 结合了限制酶切和 PCR 技术,可在一个反应内 检测大量的限制性片段, 具有 RFLP 技术的可靠性和 PCR 技术的高效性。 Smith 等利用 AFLP 技术将 44 个 玉米自交系分成不同类别, 并认为 AFLP 是一种很准 确的方法, 可以 将亲缘关 系非常近的 品种区分开 [25]。 Weng 等利用 AFLP 分析 了来自半干 旱热带作 物 国 际 研究所的 10 个花生品种,获得 78 个多态性谱带,认为 AFLP 是构建花生指纹图谱的有效方法 [26]。 但 是 ,AFLP 技 术 操 作 复 杂 ,成 本 较 高 ,并 且 该 项 技术受到专利保护,只能用于非盈利性的科学研究。

列中特定位点结合, 从而可用来扩增基因组中特定区 域,分析其多态性。张建成等采用 10 份花生品种材料, 对通过数据 库查询设 计 合 成 的 SSR 引 物 和 其 他 作 者 发表的 SSR 引物及 STS 引物进行了评估,并基于品种 间简单匹配系数做了聚类分析,获得 62 个能产生多态 性片段的 SSR 和 STS 引物对, 总共获得 427 条带,对 所采用的 10 份花生品种区分率达到 100% , 说明 SSR 和 STS 标记应用于花生品种鉴定有效 [30]。 D′ovidio 利用 STS 标记对硬粒小麦品种进行了鉴定, 认为 STS 方法 对于干种子鉴定是一个合适的方法, 而且可像蛋白质 电泳那样成为标准方法 [31]。 准确快速地进行品种鉴定是品种监督检验工作的 重要基础。 从理论上讲,利用 DNA 分子标记进行品种 鉴定是切实可行的, 但本文介绍的几种分子标记都不 尽完美。下一步工作就是简化 DNA 分子标记技术的步 骤,降低成本,实现自动化,从而使 DNA 分子标记技术 得到更广泛的应用。
参考文献:

2.4

ISSR

是由 Zietkiewicz 等发明的。 以 PCR 扩增为基础, 采用 17-22 碱 基 的 重 复 锚 定 引 物 扩 增 重 复 序 列 之 间 的片段, 既利用了基因组中丰富的 SSR 序列信息,同 时又克服了 RAPD 、RFLP 、AFLP 和 SSR 技术等诸多缺 点,具有操作简单、标记重复性好、稳定程度高等优点。 李 进 波 等 应 用 ISSR 技 术 对 12 个 水 稻 光 温 敏 核 不 育 系进行 DNA 指纹分析,选择 3 个多态性丰富的引物扩 增出的 8 个多态性 DNA 片段可作为鉴定标记, 能够 正确区分供试的水稻品系, 认为 ISSR 标记具有简便、 快速、多态性丰富等优点,可用于进行品种鉴定 [27]。 李 尚禹等运用 ISSR 技术, 对吉林省主推 6 个玉米杂交 种及其父本、母本共计 18 份基因图谱进行鉴别,从 30 条 ISSR 引物中选出 4 条扩增效果明显、 特异性高的 引物,结果表明,运用 ISSR 技术提高了玉米品种鉴定 和纯度鉴定的准确性 [28]。 谢甫绨等采用 ISSR 分子标记 技术对大豆品种 ( 系 ) 进行研究,结果表明,ISSR 分子标 记技术能很好地用来区分不同来源的大豆品种 ( 系)[29]。 但是,ISSR 与 RAPD 相似, 不能鉴别检测位点的 纯合与杂合状态。 ·20·

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· 种子科技 ·
文章编号: 1005-2690 (2010 )10-0021-03

· · 2010(10)
中图分类号: S 513.038/062 文献标志码: A

· 实验研究 ·

制种玉米多功能复混肥适宜用量与肥效的研究
闫治斌 1, 秦嘉海 2, 王爱勤 3, 彪 2, 吕 赵芸晨 2, 肖占文 2, 裴晖平 4, 顾万东 5 ( 1. 甘肃敦煌种业玉门市种子公司, 甘肃 酒泉 735000; 河西学院农学系, 2. 甘肃 张掖 734000; 3. 中国科学院兰州化学物理研究所; 北京德农种业张掖分公司; 中国种子集团有限公司张掖分公司) 4. 5.
摘 要:在甘肃河西内陆灌区的制种玉米田内, 通过田间试验, 系统研究了制种玉米多功能复混肥的适宜用量及肥效, 结果

表明: 随着多功能复混肥施用量的增加, 制种玉米经济性状和产量在增加, 但增产量、 边际产量、 边际利润、 肥料投资效率则 随着施用量的增加而递减。多功能复混肥施用量与制种玉米产量间的肥料效应回归方程是: = 373.01 + 2.089x y 0.00518x2。 多功能复混肥适宜用量为 80.02 kg, 制种玉米的理论亩产量为 573.28 kg, 与田间试验处理 5 的结果基本吻合。 在 磷纯养分投入量相等的条件下, 不同种类肥料的肥效是: 多功能复混肥>尿素 + 磷二铵。 氮、 关键词:制种; 玉米; 多功能; 复混肥; 经济性状; 产量; 效益

甘肃河西内陆灌区拥有得天独厚的自然条件和区 位优势,吸引 了中 国 种 业 、辽 宁 东 亚 、北 京 德 农 、奥 瑞 金、敦煌等 90 多家国内外种业集团,建立了玉米制种 生 产 基 地 150 万 亩 [1],种 子 产 业 已 发 展 为 河 西 内 陆 灌 区农民增收 , 农业增效的重要支柱产业之一。 目前存在 的问题是:制种玉米连作年限长,土壤养分比例失衡, 缺素的生理性病害经常发生;有机肥投入量不足,化肥 超量施用,土壤板结,贮水功能削弱;市场上流通的专
基金项目: 甘肃科技支甘项目(1011JKCF180 ) 作者简介:闫治斌 (1954-) ,男,甘肃酒泉人,高级农艺师。 研究方 向:植物营养与施肥。 E-mail :qinjiahai123@163.com 。 通讯作者:秦嘉海(1954- ),男,甘肃张掖人。 教授,研究方向:植 物营养及施肥。 E-mail :qinjiahai123@163.con 。

用肥有效成分比例不符合本区土壤养分现状和玉米对 养分的吸收比例,且不具备保水、改土功效;导致制种 玉米品质和产量下降,部分种业集团流向新疆、内蒙和 宁夏,影响了本区制种玉米产业的可持续发展。 因此, 研究和开发集营养、保水、保肥、改土为一体的制种玉 米多功能复混肥成为复混肥研发的关键所在。 本文针 对制种玉米生产上存在的上述问题, 采用作物营养平 衡施肥理论和改土培肥理论, 将土壤结构改良剂聚乙 稀 醇 [2 ~ 9] 与 农 业 有 机 固 体 废 弃 物 糠 醛 渣 [10 ~ 12]、矿 质 元 素、保水剂、生物菌肥按比例组合配制成制种玉米多功 能复混肥,利用糠醛渣腐殖质的功能团吸附土壤养分, 保水剂吸附土壤水分, 聚乙烯醇与土壤颗粒粘合形成 团粒结构,生物菌肥分解难溶性养分,将有机废弃物的

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收稿日期: 2010- 08- 16
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