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获得安全转基因水稻的几种可能途径


分子植物育种, 2007 年, 5 卷, 4 期, 528-533 页 第 第 第 Molecular Plant Breeding, 2007, Vol.5, No.4, 528-533

专题介绍 Review

获得安全转基因水稻的几种可能途径
祁永斌 叶胜海 陆艳婷
* 通讯作者, xmzhang@mail.hz

.zj.cn

张小明 *

浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所, 杭州, 310021

随着转基因技术的不断发展, 转基因水稻食用安全和环境污染问题日益引起人们的关注。本文从 转基因水稻的安全性考虑概述了标记基因和目的基因的选择和应用, 共转化法、 位点专一性重组法、 转座子 介导重组法和双右边界 T-DNA 载体法等从转基因植株中剔除标记基因的原理和具体操作过程,荧光标记 基因、 磷酸甘露糖异构酶基因、 阿拉伯糖脱氢酶基因等作为正向选择生物安全标记基因的应用情况, 以及 AtSTP3、 Rubisco、 等特异表达启动子在安全性方面的最新研究。并对实现转基因水稻规模化生产的可能 Wx 途径进行了讨论。 关键词 转基因水稻, 安全性问题, 标记基因, 启动子
摘 要

Possible Approaches for Obtaining Safe Transgenic Rice
Qi Yongbin Ye Shenghai Lu Yanting Zhang Xiaoming*
The Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Science, Hangzhou, 310021 * Corresponding author, xmzhang@mail.hz.zj.cn

Abstr act With the rapid development of transgenic technology, the problems concerning environmental pollu- tion and food safety for the transgenic rice have been attracted more and more attentions from the public around the world recently. The ways and the mechanisms, which including co-transformation, site-specific recombination, recombination system mediated by transposon and the double right-border binary vectors for eliminating selectable marker genes, the screening principles and the utilization of bio-safety marker gene involving fluorescent protein gene, pmi gene and atlD gene as positive selectable marker gene, and the specific expression promoters, including AtSTP3 promoter, Rubisco promoter and Wx promoter in the procedures of rice transformation, were summarized from the angles of solving the safety problem of transgenic rice. The possibility for the large scale production of the transgenic rice was also discussed in this paper. Keywor ds Transgenic rice, Safety problem, Marker gene, Promoter 水稻是最重要的农作物之一,全世界有三分之 一以上的人口以稻米为主粮。 在我国, 水稻的生产面 积约占农作物种植总面积的 40%,水稻生产在国民 经济中占有非常重要的地位。由于自然环境的不断 变化和经济发展的需要,常规育种技术很难解决的 一些生产实际问题, 如虫害、 病害和逆境胁迫等, 需 要寻求现代生物技术来解决。转基因技术因可在基 因水平上改造植物的遗传物质,定向改变植物的遗 传性状, 打破导入外源基因在物种间的生殖隔离, 实 现了基因资源的优势互补。 因此, 转基因技术是实现 水稻品种改良的一项重要手段。 自 1988 年 Zhang 等转化水稻原生质体获得转 基因再生植株以来, 水稻转基因技术不断发展。1993 年, Chan 等又通过农杆菌介导的方法获得了转基因 水稻, 水稻转基因技术变得更加成熟完善。由于农杆 菌介导的转化方法再生效率高, 成本低, 目的基因具 有在转基因后代中以单拷贝和低拷贝为主的特点, 在水稻转基因研究中已经成为主要的转化方式。目 前, 已经获得了抗虫(Cheng et al., 1998)、 抗除草剂 (Rathore et al., 1993)、 抗病(Nishizawa et al., 1999)、 高

基金项目: 本研究由浙江省科技攻关项目(011102471, 2005C22016)和浙江省自然科学基金(Z305650)资助。

获得安全转基因水稻的几种可能途径 529 Possible Approaches for Obtaining Safe Transgenic Rice

光效(Jiao et al., 2005)、 抗旱(Rohila et al., 2002)和改 良米质(Liu et al., 2005)等改良多种性状的转基因水 稻。但是, 转基因技术本身也带来了许多新的问题, 尤其是对食用安全和环境污染方面的影响更是引起 了科学家的广泛关注,这也成为转基因水稻迟迟不 能商业化生产的主要原因。

2.1 剔除选择标记基因 为了解决转基因水稻中标记基因的安全性问 题, 剔除转基因水稻中的选择标记基因, 目前已经研 究了共转化法、 位点专一性重组法、 转座子介导的遗 传重组法, 双右边界 T-DNA 载体法等方法, 并且已 经获得无选择标记基因的转基因水稻植株。 2.1.1 共转化法 Komari 等(1996)将含有目的基因的 T-DNA 区 段和含有选择标记基因的 T-DNA 区段, 构建到同一 个质粒载体上构成超级双元质粒载体,并用农杆菌 介导的转基因方法将这两条 T-DNA 随机转化到水 稻细胞内,分化成苗后通过后代分离及分子鉴定获 得了无选择标记基因的转基因水稻植株。Ramesh 等 (2004) 也用超级双元质粒载体 pSB111 转化籼稻品 种, 获得了无选择标记基因的抗虫转基因水稻。沈革 志等(2003)将含有目的基因质粒的菌株和含有选择 标记基因的菌株混和,并用农杆菌混合菌液同时转 化水稻愈伤获得共转化转基因植株,从共转化植株 后代中分离出只含有目的基因的转基因株系。作者 也用农杆菌混合液共转化法, Rubisco 特异表达启 将 动子引导的 cry1A(b)基因导入浙江省推广的浙粳 22 等水稻品种, 并获得了转 Bt 抗虫水稻。因此, 共转化 是一种操作简单而效率较高的剔除选择标记基因的 方法。 2.1.2 位点专一性重组

1 转基因水稻带来的主要安全性问题
1.1 选择标记基因安全性问题 为了将转基因细胞和非转基因细胞分开,在构 建质粒载体时,人们常常把一类对抗生素类或除草 剂类具有抗性的基因作为选择标记基因引入 T-DNA, 与目的基因一同转化到植物细胞。 在组织培 养过程中, 培养基中加入抗生素或除草剂后, 转化细 胞可以正常生长而非转化细胞在抗生素或者除草剂 的作用下死亡, 从而获得阳性转化细胞, 进而分化、 再生获得转基因植株。但是, 这类基因在转基因植株 中的存在, 也给环境和食用安全带来潜在的威胁。例 如:具有除草剂抗性的转基因水稻花粉是否会飘落 到杂草或近缘野生稻上,使这些杂草和野生稻具有 除草剂抗性, 经过多次转移后可能成为 “超级杂草” , 从而破坏整个生态系统?抗生素类选择标记基因自 身及其表达的产物会不会对人类产生不良影响或者 过敏性反应?这些问题的存在也使人们对转基因水 稻的安全性产生了更多的担忧。 1.2 目的基因安全性问题

(1)目前, 在水稻转基因中利用位点专一性重组 的成功报道主要是大肠杆菌噬菌体 P1 Cre/Lox P 重 为了解决水稻生产中虫害的问题,科学家从苏 云金杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆出了 Bt 基因, 组系统(Gao et al., 2006)。Cre/Lox P 是系统利用 Cre 将选择标记基因置于两个 Lox P 该基因可以编码一种蛋白,在昆虫体内经过蛋白酶 重组酶的重组特性, 目的基因置于 Lox P 位点之外, 通过 Cre 的分解后成为毒性分子,而毒性分子与昆虫肠道的 位点之间, 使两个 Lox P 位点之间的 DNA 区 上皮细胞作用, 使细胞膜产生一些孔道, 从而导致细 蛋白的识别重组, 胞渗透平衡被破坏而破裂, 最终导致昆虫死亡。通过 段与水稻基因组之间发生置换,从而剔除选择标记 获得只含有目的基因的转基因水稻。Cre/Lox P 转基因的方法,将 Bt 基因转化到水稻基因组中, 转 基因, 基因水稻对水稻鳞翅目害虫具有专一抗性(Shu et al., 是水稻转基因中比较常用且重组效率较高的位点专 2000)。虽然转 Bt 基因水稻对于螟虫具有很好的抗 一性重组系统。 (2) FLP-FRT 重组系统是另一个已经应用于水 性, 但是 Bt 基因编码的蛋白对非靶标生物或人类有 无毒害作用?此外, 随着昆虫对转 Bt 基因水稻的不 稻转基因的位点专一性重组系统,它来自酵母的质 断取食, 并经过多代繁殖和进化后是否会对 Bt 蛋白 粒。与 Cre/Lox P 重组原理基本相似,也是利用 FLP 可以识别 FRT 位点并进行重组。 产生抗性?这些问题的存在使人们更加关注转基因 基因编码的重组酶, Radhakrishnan 和 Srivastava (2005)将新霉素磷酸转 水稻的安全性问题。 移酶(npt)基因与 nos 终止子构建到 2 个 FRT 位点之 2 解决转基因水稻安全性问题的方法 间, 在其上游连接一个 ubi 启动子, 而在其下游连接

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一个没有启动子的 gus 基因, 通过 gus 染色和分子鉴 定,最终获得经过遗传重组的 gus 阳性转基因水稻 植株。 因此, FLP-FRT 系统也是一个有用的位点专一 性重组系统。 此外, 还有 R/RS 重组系统(Ebinuma et al., 2005) 等, 但目前还未见其在水稻转基因研究中的成功报道。 2.1.3 转座子介导的重组 利用玉米 Ac/Ds 转座子系统中 Ds 元件在 Ac 转 座元件的作用下,可以从染色体的一个位点转移到 选 另一个位点的特点,将目的基因构建到 Ds 元件, 择标记基因构建到 Ds 元件的外侧,通过 Ac 转座元 件的作用使 Ds 元件发生转移, 进而从转基因后代中 筛选出只含有目的基因而无选择标记基因的转基因 水稻植株。金维正等(2003)将目的基因构建到 Ds 元 件, 与选择标记基因构建到同一 T-DNA 中, 并转化 水稻; 同时将含有 Ac 元件的 T-DNA 转化到水稻中, 转基因再生植株通过杂交获得含有 Ac 和 Ds 共同转 化的植株。在 Ac 转座元件的作用下, 元件可以发 Ds 挥其跳跃性。因此, 从转基因植株自交后代中分离出

为正向选择系统。主要区别在于其本身无毒性作用, 因此,以生物安全标记基因代替抗生素类标记基因 已经成为转基因研究的主要方向之一。 2.2.1 荧光标记基因 20 世纪 60 年代, Shimomura 等首次从多管水目 属(Aequorea Victoria)中分离纯化出一种荧光物质, 并 将其定性为蛋白质, 称之为绿色荧光蛋白(green fluo- rescent proteins, GFPs), 在一定波长的光子激发下, 会 发出强烈的荧光。其荧光的发生无需底物和辅助因 子, 表达产物对细胞无毒害作用, 不影响细胞的正常 生长和功能(赵华等, 2003)。 Vain 等(1998)利用基因枪 法将 GFP 基因导入水稻基因组中,同时与抗生素类 选择标记作了比较,认为 GFP 标记不仅缩短了选择 时间, 减少了工作量和分子检测步骤, 而且还可以根 据荧光发射的强度区分转基因纯合体和杂合体。 包括黄色荧 此外, 还有一些 GFP 基因的突变体, 光蛋白基因(YFP), 青色荧光蛋白基因(CFP)和红色荧 光蛋白基因(RFP)等(Bajaj and Mohanty, 2005), 但在

水稻转基因研究中的报道并不多。 只含有目的基因而无选择标记基因的转基因植株, 2.2.2 磷酸甘露糖异构酶(pmi)基因 但该方法的效率目前还偏低。 甘露 pmi 基因作为正向选择标记的主要原理是: 2.1.4 双右边界 T-DNA 载体法 6- 糖在己糖激酶的作用下转化为 6- 磷酸甘露糖, 磷 双右边界 T-DNA 载体法(Lu et al., 2001)就是在 T-DNA 的右边界再引入一个右边界, 将选择标记基 因构建到两个右边界之间,目的基因构建到右边界 和左边界之间,通过转基因将目的基因和选择标记 基因同时转化到水稻基因组中。由于转化载体中 T-DNA 存在两个右边界和一个左边界, 因此, 转化 一种是目的基因 过程中 T-DNA 可以形成 3 种类型。 和选择标记基因同时存在,另一种是只含有选择标 记基因, 还有一种为只含有目的基因。因此, 可以从 转基因植株的后代中选出只含有目的基因的转基因 植株。目前, 双右边界 T-DNA 载体法也是剔除选择 标记基因的一种方法,但其相关报道 (夏志辉等, 2006)并不多。 2.2 以生物安全标记基因代替抗生素类标记基因 生物安全标记基因作为选择标记的转化系统与 传统的选择标记转化系统有所不同,它不是将非转 化细胞杀死, 而是在特定的选择条件下, 可以人为的 分出转化细胞和非转化细胞或者使转化细胞处于一 种有利的代谢途径下, 从而筛选出转化细胞, 传统的 转化系统被称为负向选择系统,而这种转化系统称 酸甘露糖不仅不能被细胞进一步代谢利用, 而且当其 累积到一定浓度时就会抑制磷酸葡萄糖异构酶的活 性, 从而阻碍了糖酵解途径。 因此, 植物细胞在以甘露 糖为碳源的培养基上不能正常生长, 而在磷酸甘露糖 异构酶(pmi)基因的催化下 6- 磷酸甘露糖可转化为 6- 磷酸果糖, 磷酸果糖可经糖酵解途径被细胞利 6- 用。Lucca 和 Potrykus (2001)首次利用 pmi 基因作为 选择标记基因, 通过农杆菌介导法获得了转基因水稻 植株,转基因植株经分子鉴定表明其转化效率高达 41%。 2.2.3 阿拉伯糖脱氢酶(atlD)基因 由于大多数植物不能直接代谢糖醇类物质, 包 而大肠杆菌阿拉伯糖操纵子可以 括 D- 阿拉伯糖醇, 将阿拉伯糖醇作为碳源利用。AtlD 基因编码的 D- 阿拉伯糖醇脱氢酶可以将阿拉怕糖醇转化为木糖 醇, 而木糖醇则是磷酸戊糖途径的一个中间产物。因 此,转化了 atlD 基因的植物能够在以阿拉伯糖醇为 碳源的培养基上正常生长,而非转化细胞不能正常 生长。LaFayette 等(2005)利用农杆菌介导法将 atlD 基因导入水稻,其选择效率与潮霉素选择效率基本

获得安全转基因水稻的几种可能途径 531 Possible Approaches for Obtaining Safe Transgenic Rice

一致, 转基因后代呈孟德尔式分离。 除以上几种正向选择标记基因已经在水稻遗传 转化中得到成功应用外,还有其它一些生物安全标 记基因也正在进行着广泛的研究。如: 木糖磷酸酶基 因(xylA) (Haldrup et al., 1998), 谷氨酸 -1- 半醛转氨 酶基因(hemL) (Gough et al., 2001), 核糖醇操纵子(rtl) D- (Erikson et al., 2004), 型氨基酸氧化酶基因(dao1) (LaFayette and Parrott, 2001)等, 虽然在水稻转基因工 作中还未见报道,但是其作为正向选择标记基因在 其它植物的遗传转化中已经得到成功利用。 2.3 以特异型表达启动子代替组成型表达启动子 目前, 水稻转基因工作中, 一般都是利用水稻肌 动蛋白基因 Actin1 启动子,花椰菜花叶病毒基因 CaMV35S 启动子,玉米泛素基因 Ubi 启动子等组成 型表达启动子来引导目的基因的表达。这些启动子 调控下的外源基因在转基因水稻的所有组织和各个 发育阶段都有所表达, 包括稻米, 因此, 这也给转基 因水稻在食用安全方面带来隐忧。 由于组织特异型表达启动子调控下的外源基 因, 只在转基因水稻的特定组织和器官中表达, 或者 在特定条件下诱导表达, 因此, 利用这种组织特异型 启动子, 由其引导编码毒性蛋白的目的基因, 使目的 基因只在茎、 叶等营养器官中表达, 而不在花粉、 种 子等生殖器官中表达, 进而增加食用和环境安全性; 或者将改良品质的基因在组织特异型启动子的引导 下, 使其只在种子中表达, 从而更有效的改良水稻品 质,同时又减少组成型启动子在营养器官中表达所 造成的损耗和对环境安全的潜在威胁。因此, 利用组 织特异表达启动子代替组成型表达启动子,解决转 基因水稻的安全性问题已经成为水稻转基因研究中 的另一个热点。 2.3.1 AtSTP3 启动子 AtSTP3是拟南芥单糖运输家族成员之一,在拟 南芥绿色组织中特异表达。卢碧霞等 (2006) 将 At- STP3 启动子与 GUS 报告基因构建成融合表达载体 并转化水稻, GUS 基因经过定量和定性分析后表明 其在转基因水稻叶片中特异表达,而在根和种子等 器官中表达极弱, AtSTP3 启动子表现出明显的组织 特异性。 2.3.2 Rubisco 启动子 1,5- 二磷酸核酮糖羧化 / 加氧酶(Rubisco)存在 于所有高等植物和自养细菌中,是所有生物进行光

合作用的关键酶。Rubisco 由 rbcL 大亚基和小亚基 rbcS 组成, rbcL 由叶绿体基因组编码, rbcS 由核基因 组编码。 刘巧泉等(2005)利用该酶在绿色组织及光合 作用中高效表达的特性, 将其引导的 GUS 融合基因 转化水稻, GUS 报告基因在转基因水稻植株叶片和 叶鞘内的叶肉细胞中高效特异表达, 而在茎、 根和种 子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的 组织与细胞特异性。 2.3.3 Wx 启动子 Liu 等(2003)将一个控制水稻直链淀粉含量基因 的反义(anti-waxy)基因, 与组织特异表达启动子 Wx 构建到同一个质粒载体,使其在水稻胚乳中特异表 达, 从而降低水稻直链淀粉含量, 改良水稻品质。结 果表明: 转基因水稻显著降低了直链淀粉含量, 并证 实反义基因在转基因水稻胚乳中特异表达。

3 展望
自从转基因水稻诞生以来,转基因技术由于其 突破了生物间的生殖隔离,利用了生物界基因之间 的优势互补, 使其在改良抗性, 品质等各个方面起到 了很好的作用, 解决了常规育种很难解决的问题。因 此, 转基因技术是将来改良水稻品种, 实现农业可持 续发展和解决人类粮食问题的一个重要手段。 虽然人们目前对转基因水稻还存在一定的担忧 和顾虑, 但是, 随着生物技术的不断发展, 利用选择 效率更高、 更简单、 更直观的生物安全标记基因代替 抗生素类或抗除草剂类标记基因,或者利用其它分 离手段剔除选择标记基因,从而彻底消除选择标记 基因所带来的安全性问题,是今后水稻转基因技术 研究和发展的重要方向,也是转基因水稻从实验室 走向大田生产的必要前提。 此外,利用高效的组织特异型表达启动子代替 组成型表达启动子, 改良水稻的抗性或品质, 使一些 表达毒性蛋白的目的基因尽量在水稻的营养器官表 达, 而不在生殖器官表达, 从而增加转基因水稻的食 用安全性和环境安全性,降低组成型启动子表达所 造成的能量损失,以及对环境和水稻本身带来的不 良影响,也是水稻转基因工作今后将要解决的一个 重点问题。 因此,随着选择标记基因的剔除或生物安全选 择标记基因的利用,以及高效的特异表达启动子的 发展,转基因水稻的食用安全性和环境安全性将得 到根本的解决。我们相信转基因水稻以其特有的优

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分子植物育种 Molecular Plant Breeding Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N., and Kumashiro T., 1996, Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transforma- tion of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection mark- ers, Plant J., 10(1): 165-174 LaFayette P.R., and Parrott W.A., 2001, A non-antibiotic marker for amplification of plant transformation vectors in E.coli, Plant Cell Rep., 20(4): 338-342 LaFayette P.R., Kane P.M., Phan B.H., and Parrott W.A., 2005, Arabitol dehydrogenase as a selectable marker for rice, Plant Cell Rep., 24: 596-602 Liu Q.Q., Wang Z.Y., Chen X.H., Cai X.L., Tang S.Z., Yu H.X., Zhang J.L., Hong M.M., and Gu M.H., 2003, Stable inheri- tance of the antisense waxy gene in transgenic rice with re- duced amylose level and improved quality, Transgenic Res., 12(1): 71-82 Liu Q.Q., Yu H.X., Chen X.H., Cai X.L., Tang S.Z., Wang Z.Y., and Gu M.H., 2005, Field performance of transgenic indica hybrid rice with improved cooking and eating quality by down-regulation of Wx gene expression, Mol. Breed., 16(3): 199-208 Liu Q.Q., Yu H.X., Zhang W.J., Wang H.M., and Gu M.H., 2005, Specific expression of the foreign gene regulated by the rice rbcS promoter in transgenic rice, Zhiwu Shengli Yu Fenzi Shengwuxue Xuebao (Journal of Plant Physiology and Molecular Biology), 31(3): 247-253 (刘巧泉, 于恒秀, 张文 娟, 王红梅, 顾铭洪, 2005, 水稻 rbcS 启动子控制的外源 基因在转基因水稻中的特异表达, 植物生理与分子生物 学学报, 31(3): 247-253) Lu B.X., Ma S.C., Zhang G.S., Xia M., and Xin L., 2006, Specif- ic expression of exogenous genes regulated by AtSTP3 pro- moter of Arabidopsis thaliana, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Boreali-occidentalia Sinica), 26(6): 1087-1092 (卢 碧霞, 马守才, 张改生, 夏勉, 辛莉, 2006, AtSTP3 启动子 控制的外源基因在转基因水稻中的特异表达研究, 西北 植物学报, 2006, 26(6): 1087-1092) Lu H.J., Zhou X.H., Gong Z.X., and Upadhyaya N.M., 2001, Generation of selectable marker-free transgenic rice using double right-border (DRB) binary vectors, Aust. J. Plant Physiol., 28: 241-248 Lucca P., Ye X.D., and Potrykus I., 2001, Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selec- tive agent, Mol. Breed., 7: 43-49 Nishizawa Y., Nishio Z., Nakazono K., Soma M., Nakajima E., Ugaki M., and Hibi T., 1999, Enhanced resistance to blast (Magnaporthe grisea) in transgenic Japonica rice by constitu- tive expression of rice chitinase, Theor. Appl. Genet., 99 (3-4): 383-390 Radhakrishnan P., and Srivastava V., 2005, Utility of the GR6 glutamate-1-semialdehyde

势, 使水稻品种不断得到优化和改良, 并将更快地适 应社会发展的需求,消除人们对转基因水稻安全性 的顾虑, 在生产上发挥其应有的作用。

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2007 年 “全国微生物农药应用基础研究学术讨论会” 九月在青岛召开
为交流 973 和 863 计划等课题研究进展, 推动我国微生物农药研究的自主创新和开发进程, 中国生物 工程学会农业生物工程专业委员会与青岛农业大学联合举办微生物农药应用基础研究学术讨论会。 时间: 2007 年 9 月 14-17 日 地点: 青岛农业大学 (原山东莱阳农学院, 距青岛流亭机场车行 15 分钟) 日程安排: 9 月 14 日 报到 9 月 15 日 开幕式, 大会报告 拟邀请科技部 973、 计划、 863 国家自然基金委等管理部门领导, 相关研究领域知名院士、 专家光临指导, 并进行大会报告和学术交流。 9 月 16 日 分组学术交流 9 月 17 日 青岛市参观考察 9 月 18 日 离会 本次会议的参会人员以现 973、 项目承担人员为主, 863 欢迎其他同行和青年学子提交研究报告。 但限于 接待能力, 会议采取分配代表名额的办法邀请参加。 本文摘录自 《天海德农业资源与作物科学网》 http://www.hitar.org/meeting/ :


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