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玉米成熟胚愈伤组织诱导与继代培养的影响因素研究


2009 年第 7 期

玉米成熟胚愈伤组织诱导与继代培养的影响因素研究
赵锦慧1 , 陈   1 ,牛子敬2 龙
( 1. 周口师范学院 生命科学系 ,河南 周口 466000 ; 2. 周口市种子技术服务站 ,河南 周口 466000)

摘要 : 以 28 个不同基因型的玉米成熟胚为试验材料 , 初步研究了培养基种

类 、 基因型 、 消毒时间 、 切胚方式 、 变温处理 、 蔗糖质量浓度 、 酸水解酪蛋白质量浓度 、 ,4 - D 质量浓度等因素对愈伤组织 2 诱导与继代的影响 。结果表明 : 培养基 、 酸水解酪蛋白质量浓度 、 ,4 - D 质量浓度等因素对愈伤组 2 织诱导率的影响不显著 ,但对继代过程中愈伤组织质量影响较大 ; 其余 5 个因素对愈伤组织诱导率 的影响显著 ,并且对继代培养中的愈伤组织质量也有明显影响 。最终选出了 3 个高培养力材料 ,初 步确定了比较适合玉米成熟胚愈伤组织诱导与继代的培养基 。 关键词 : 玉米 ; 成熟胚 ; 愈伤组织 ; 因素 中图分类号 : S513    文献标识码 : A    文章编号 : 1004 - 3268 ( 2009) 07 - 0038 - 05

Factors Influencing Induction and Subcult ure of Calli f ro m Maize Mat ure Embryo
( 1. Depart ment of Life Sciences , Zhouko u Normal U niversity , Zhoukou 466000 ,China ; 2. Zhouko u Seeds Service Station ,Zhoukou 466000 ,China)

   近年来 ,随着生物技术的不断完善和发展 ,禾谷 类作物的组织培养技术作为基础性工作广泛应用于 各种突变体筛选和转基因研究 。玉米作为我国一种 重要的禾谷类粮食作物 , 其组织和细胞培养研究受 到人们的重视并取得了巨大的进步 。在玉米的外植 体培养中 ,对幼胚培养的研究很多 ,并已建立了比较 完善的组织培养体系 ,但对成熟胚的研究报道 [ 1~10 ] 较少 。玉米成熟胚组织培养因为存在诱导率低 、 愈 伤组织质量不稳定等困难 , 所以在成熟胚的利用上 受到很大限制 ,玉米成熟胚愈伤组织培养一旦成功 ,

收稿日期 :2009 - 01 - 04 基金项目 : 周口师范学院青年科研基金项目 (zknuqn200721) 作者简介 : 赵锦慧 (1979 - ) ,女 ,河南周口人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事作物遗传育种研究 。

·38 ·

Abstract : Twenty2eight maize genotypes were selected as experimental materials to study the factors ( culture medium type , genotype , disinfection time , cut pattern of embryo , temperature , sucrose concen2 tration , CH concentration , 2 ,4 - D concentration) affecting the induction and subculture of calli from mature embryo. The result s showed that culture medium , CH concentration and 2 ,4 - D concentration had no significant on callus induction , but had obvious effect s on quality of calli in the course of subcul2 ture ; Other five factors greatly affected the induction and subculture of calli. Three materials with high cultivating ability were selected , and the suitable media were initially established. Key words : Maize ; Mat ure embryo ; Callus ; Factor 1  材料和方法 1. 1   材料

ZHAO J in2hui1 , C H EN Lo ng1 ,N IU Zi2jing2

以玉米组织培养为基础的研究将不再受玉米生长季 节的限制 ,从而加快工作进程 。本试验针对影响玉 米成熟胚愈伤组织诱导和继代培养的一些因素进行 初步研究 ,以期筛选出高培养力材料及确定比较适 合成熟胚培养的培养基 。

供试材料为齐 319 ( 1 ) 、 22 ( 2 ) 、 7 - 2 ( 3 ) 、 郑 昌 3168 ( 4) 、 8722 ( 5 ) 、 - 1 ( 6) 、 C ( 7) 、 22 ×Hi ( A 87 黄 郑

河南农业科学 × ) ( 8 ) 等 8 个自交系和郑 22 ×Hi ⅡA ( 9 ) 、 22 B 郑 × 31 ( 10 ) 、 22 ×黄 C ( 11 ) 、 319 ×Hi ⅡA 综 郑 齐
( 12) 、 319 × - 1 ( 13) 、 319 × 齐 87 齐 A188 ( 14 ) 、 8722

染情况以及诱导与继代情况 , 确定最适合的消毒时 间为 5~7min 。
表1  不同 HgCl 2 消毒时间下胚污染率   ( %) 消毒时间 ( min) 1
3 5~7 8~9 12 17~20 4 0 0 0 0

×Hi Ⅱ ( 15) 、 A 8722 × 22 ( 16 ) 、 郑 8722 ×R53 ( 17 ) 、
8722 × 31 ( 18) 、 - 1 × 22 ( 19 ) 、 - 1 ×Hi Ⅱ 综 87 郑 87 A ( 20) 、 - 1 × C ( 21) 、 31 × C ( 22) 、 31 × 87 黄 综 黄 综 Hi Ⅱ ( 23) 、 3 × 7 - 2 ( 24 ) 、 3 × 178 ( 25 ) 、 A 综 昌 综 许 3168 × A188 ( 26) 、 ⅡA × C ( 27 ) 、 7 - 2 × Hi 黄 昌 独 321 ( 28) 等 20 个杂交组合 , 由河南农业大学提供 。

4 18 0 0 0 0

材料 2 15
11 0 0 0 0 7 0 0 0 0

11 13 0 0 0 0

10 9 0 0 0 0

备注 各材料胚部正常 各材料胚部正常 各材料胚轻微变黑 各材料胚发黑较明显 各材料胚严重变黑

表 1 中材料名称分别用序号 ( 1~28) 代表 。 基本培养基 :N 6 、 ( MS 大量元素 + MS 微量 MN 元素 + N 6 有机物) 基本诱导与继代培养基 : N 6 ( MN ) + 30g/ L 蔗 糖 + 2mg/ L 2 ,4 - D + 500 mg/ L 脯氨酸 ( Pro ) + 500 mg/ L 酸 水 解 酪 蛋 白 ( C H ) + 7. 2 g/ L 琼 脂 粉 ,
p H51 8~61 0 。 1. 2   方法 2  结果与分析

2. 2   切胚方式和培养基对成熟胚愈伤组织诱导与

继代的影响 本试验设计了 4 种切胚方式 : Ⅰ 是将成熟胚完 整的取出后放于诱导培养基上 ; Ⅱ 是将胚取出后 ,切 去芽鞘和根鞘后放于诱导培养基上 ; Ⅱ 是将切去牙 鞘和根鞘的胚沿胚轴纵切为两部分 ; Ⅳ 是在 Ⅲ 的基 础上将每部分再横切一次 , 最终分为四部分 。不同 培养基上不同切胚方式各个材料的愈伤组织诱导率 统计结果见表 2 。设变量 X 为诱导率 ,变量 A 为不 同切胚方式 , 变量 B 为不同培养基 , 进行双因素方 差分析 ( 表略) 可知 : 不同切胚方式愈伤组织诱导率 的差异极其显著 ; 不同培养基愈伤组织诱导率差异 不显著 。由表 2 知 ,4 种切胚方式中 , Ⅲ 切胚方式的 平均诱导率最高 , Ⅰ 方式最低 ,表明一定的损伤反而 可以刺激愈伤组织的诱导 ; 相同的切胚方式下不同 材料之间诱导率也不同 , 其中材料 1 ( 齐 319 ) 和 26
( 3168 × A188 ) 的诱导率最高 ,在 Ⅲ 切胚方式下均达

成熟玉米种子 →70 %酒精消毒 30s →0. 1 %氯

化汞消毒 → 无菌蒸馏水冲洗 5 ~ 6 次 → 无菌蒸馏水 中浸泡 36h → 在超净工作台上取成熟胚接种于诱导 培养基上 ,每 15~20d 继代一次 ( 诱导与继代过程采 用暗培养) 。诱导培养 1 周后统计愈伤组织诱导率
( 出愈率 = 出愈胚数/ 接种胚数 × 100 %) , 不同处理

下各个材料均统计 10 皿 , 表中数据为 10 皿的平均 数 。试验 数 据 采 用 计 算 机 统 计 软 件 SPSS ( SPSS
10. 0 fo r window s) 进行分析 。

到 90 %以上 ,表明这 2 个材料比较容易诱导出愈伤 组织 。虽然 N 6 和 MN 2 种培养基对愈伤组织诱导 率的影响没有显著差异 , 但材料 1 和 26 在 MN 培 养基中的诱导率稍高 , 其余 4 个材料在 N 6 培养基 中的诱导率较高 ; 继代过程中观察到材料 6 (87 - 1) 、 7
(黄 C) 、 (87 - 1 × 22) 继代 2 次后均褐变死亡 ,材料 19 郑 1 和 26 在 MN 培养基中继代情况较好 ,而材料 9 (郑 22

2. 1  HgCl 2 消毒时间对成熟胚污染率的影响

本试验采用 0. 1 % 的 HgCl 2 , 设置长短不同的

消毒时间对种子消毒 , 在无菌水中浸泡 36h 后取胚 接种到 N 6 培养基 ,3d 后调查胚污染情况 ( 表 1 ) , 从 表 1 看出 ,消毒时间在 5min 以上时 ,胚无污染现象 , 但 8min 以上时 ,胚周围均有发黑现象 , 消毒时间越 长 ,发黑症状越严重 。 HgCl 2 是一种杀伤力很强的 消毒剂 ,消毒时间过长 , 会对细胞产生毒害作用 , 抑 制细胞生长 。对不同消毒时间下成熟胚的诱导与继 代培养的观察表明 ,消毒时间越长 ,愈伤组织诱导率 越低 , 并且愈伤组织的质量很差 , Ⅱ 型愈伤组织很 少 ,消毒时间超过 17min 后 , 供试 6 个材料除 1 ( 齐
319) 和 15 ( 8722 ×Hi ⅡA ) 有小部分能继代存活外 ,

×HiⅡ ) 在 N6 培养基中继代情况较好 ,表明不同的材 A 料适合的诱导和继代培养基有所不同。
2. 3   变温处理对成熟胚愈伤组织诱导和继代的影响

本试验设计了 2 个处理 。处理 1 : 成熟玉米种 子消毒后 在无 菌水 中浸 泡 并 保 存 在 4 ℃冰 箱 中 ,
36h 后将胚取出接种于诱导培养基上 , 于 34 ℃ 高温

其余 4 个材料继代 2 次均褐变死亡 。因此 , 综合污

中诱导 3d 。处理 2 : 成熟玉米种子消毒后置于常温 ( 25 ℃ 下浸泡 ,36h 后 取 出 ,于 常温下诱 导 3d 。不 ) ·39 ·

2009 年第 7 期
表2  不同切胚方式和培养基下愈伤组织诱导率 培养基 切胚方式 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 材料
6 8. 00 67. 35 72. 55 42. 00 6. 00 52. 94 69. 39 54. 00 1 14. 29 82. 35 92. 00 54. 90 21. 57 93. 88 90. 00 60. 78 7 4. 00 30. 61 27. 45 19. 61 7. 84 22. 45 32. 00 18. 00 9 6. 00 37. 25 42. 86 30. 00 9. 80 31. 37 46. 00 26. 53 19 6. 12 34. 69 46. 00 31. 37 8. 00 30. 61 41. 67 30. 00 26 23. 53 86. 00 90. 20 48. 00 26. 53 88. 24 96. 00 54. 00 ( %)   

平均诱导率
10. 32 56. 38 61. 84 37. 65 13. 29 53. 25 62. 51 40. 55

N6

MN

同材料在 2 个处理下的出愈率见表 3 。对 2 种处理进 行 t 检验表明 ,处理 1 和处理 2 的愈伤组织诱导率差异 极显著 ,在继代过程中观察到经变温处理的各个材料 胚性愈伤组织数量增加。这可能由于变温刺激促进了 成熟胚脱分化和胚性愈伤组织的形成。
表3  不同处理下愈伤组织诱导率 处理
1 2 ( %)   t值 3. 892

材料
21 82. 35 40. 38 27 94 67. 35 22 74 39. 22 23 83. 67 60. 00

  :培养基为 N6 , t 0. 01 = 3. 707 注

2. 4   基因型和蔗糖质量浓度对成熟胚愈伤组织诱导

与继代的影响 本试验采用了 N 6 和 MN 2 种基本培养基 , 设 定了 4 种 蔗 糖 质 量 浓 度 : 10g/ L 、20g/ L 、 30g/ L 、 40g/ L ,不同蔗糖浓度下各材料的诱导率见表 4 。设

变量 X 为诱导率 , 变量 A 为不同材料 ( 不同基因 型) ,变量 B 为不同蔗糖浓度 ,进行双因素方差分析 ( 结果略) 可知 : 不同材料之间及不同蔗糖质量浓度 之间愈伤组织诱导率差异都极显著 。由表 4 知 , 蔗 糖质量浓度为 10g/ L 时 , 平均诱导率最低 ; 就不同 材料而言 ,最适的蔗糖质量浓度也有所不同 ; 虽然 2 种培养基对出愈率的影响差异不显著 , 但材料在 MN 培养基中的出愈率较高 。继代培养中观察到 , 供试材料在蔗糖质量浓度为 10g/ L 时 ,愈伤组织黏 软 ,大部分褐变 ,在蔗糖质量浓度为 40g/ L 时 , 愈伤 组织大部分褐化 ; 材料 20 ( 87 - 1 ×Hi ⅡA ) 在蔗糖 质量浓度为 30g/ L 时 , 愈伤组织长势良好 , 其余 4 种材料在蔗糖质量浓度为 20g/ L 时长势较好 。由 此认为 ,在成熟胚愈伤组织的诱导与继代过程中 ,蔗 糖质量浓度以 20 ~ 30g/ L 比较适宜 。这与郭丽红 等 [ 2 ] 研究结果基本一致 。
( %)   

表4  不同基因型和蔗糖质量浓度下愈伤组织诱导率 培养基
N6

蔗糖质量浓度 (g/ L)
0 20 30 40

5 16. 33 23. 53 20. 41 26. 00 27. 08 32. 69 38. 78 31. 25

3 22. 00 44. 23 34. 62 44. 90 28. 00 42. 86 39. 58 47. 06

材料 20
64. 81 77. 55 82. 69 83. 33 50. 98 75. 47 82. 98 82. 35

24 46. 00 52. 94 52. 08 55. 10 39. 58 62. 00 70. 21 61. 22

16 37. 25 48. 00 53. 06 46. 00 42. 86 60. 42 57. 45 58. 00

平均诱导率
37. 28 49. 25 48. 57 51. 07 37. 70 54. 69 57. 80 55. 98

MN

10 20 30 40

2. 5   酸水解酪蛋白质量浓度对成熟胚愈伤组织诱

率 ,进行单因素方差分析表明 ( 结果略) ,4 组 C H 质 量浓度之间的诱导率差异不显著 。由表 5 知 , C H 浓度为 50mg/ L 时 , 愈伤组织平均诱导率最低 , 为
200mg/ L 时平均诱导率最高 , 不同材料最适合的 C H 浓度有差异 。继代培养中观察到 : 材料 1 ( 齐 319) 、 ( 齐 319 × - 1 ) 和 12 ( 齐 319 ×Hi ⅡA ) 13 87

导与继代的影响 本试验采用了 MN 基本培养基 ,设定了 4 组 CH 质量浓 度 : 50mg/ L 、 100mg/ L 、 200mg/ L 、 500mg/ L , 不同浓度下各材料的诱导率见表 5 。设变量 G 为 4 组不同的 C H 质量浓度 ,变量 X 为不同浓度下诱导 ·40 ·

河南农业科学 在 C H 浓度为 100mg/ L 的培养基中长势较好 ,在其 余浓度培养基中褐变严重 ,继代 5 次后 ,只有材料 1 能够维持愈伤组织的胚性 , 而材料 13 和 12 的胚性 逐渐丧失 。材料 17 ( 8722 ×R53) 虽然出愈率很高 , 但继代培养中胚性愈伤组织很少 , 第 2 次继代就被 淘汰 ,表明愈伤组织诱导率高低与继代培养中愈伤 组织质量无明显的相关关系 。材料 25 ( 综 3 ×许
178) 和 20 ( 87 - 1 ×Hi Ⅱ ) 在 C H 浓度为 500mg/ A L 的培养基中长势较好 ,但继代 2 ~ 3 次后 , 材料 25 因大部 分 褐 变 死 亡 而 被 淘 汰 。材 料 26 ( 3168 × A188 ) 和 8 ( 郑 22 ×Hi ( A × ) ) 在 C H 浓度为 B 200mg/ L 的培养基中长势较好 。结合诱导率与继

代中的表现并从经济的角度考虑 ,C H 浓度在 100~ 200mg/ L 较合适 。
( %)   

表5  不同酸水解酪蛋白质量浓度下的诱导率
C H 浓度 (mg/ L) 50 100 200 500

材料
1 82. 35 95. 92 92. 00 88. 00 17 74. 00 92. 31 89. 80 90. 38 26 79. 59 90. 00 96. 00 82. 69 25 32. 00 42. 00 36. 73 39. 22 13 62. 75 80. 00 82. 00 79. 59 12 50. 00 72. 00 72. 92 60. 78 20 51. 02 70. 59 75. 00 84. 31 8 40. 00 50. 00 68. 00 50. 98

平均诱导率
58. 96 74. 10 76. 56 72. 00

2. 6   ,4 - D 质量浓度对愈伤组织诱导与继代的影 2

2 ,4 - D 浓度为 4mg/ L 时 , 诱导率较高 ; 材料 20 ( 87 - 1 ×Hi ⅡA ) 、 ( 齐 319 ×A188 ) 和 28 ( 昌 7 - 2 × 14 独 321) 在 2 ,4 - D 浓度为 2mg/ L 时 , 诱导率较高 ;

响 本试验采用了 MN 基本培养基 ,设定了 5 组 2 , 4 - D 质量浓度 : 1mg/ L 、 2mg/ L 、 3mg/ L 、 4mg/ L 、 6mg/ L ,不同浓度下各材料的诱导率见表 6 。 设变量 G 为 5 组不同的 2 ,4 - D 质量浓度 , 变量 X 为不同 浓度下诱导率 , 进行单因素方差分析 ( 结果略 ) , 5 组 2 ,4 - D 质量浓度之间的诱导率差异不显著 。 由 表 6 知 , 2 ,4 - D 浓度为 2mg/ L 时平均诱导率最 高 ,但不同材料最适合的 2 ,4 - D 浓度有差别 ,材料 26 ( 3168 × A188) 、 ( 87 - 1 × C) 和 2 ( 郑 22 ) 在 21 黄

材料 18 ( 8722 × 31) 和 7 ( 黄 C) 在 2 ,4 - D 浓度为 综 3mg/ L 时 ,诱导率较高 。继代培养中发现 : 材料 28 、 7 和 2 三个材料继代 2 次后 ,大部分褐变死亡 ,材料
18 继代 3 次后也大部分褐变死亡 , 其余的材料继代

情况较好 ,2 ,4 - D 浓度为 1mg/ L 和 6mg/ L 时 , 8 个材料的诱导率都较低 , 而且继代情况也很差 。可 以认为 ,诱导和继代中最适合的 2 ,4 - D 浓度为 2 ~ 4mg/ L 。
( %)   

表6  不同 2 ,4 - D 质量浓度下的诱导率
2 ,4 - D 浓度 (mg/ L) 1 2 3 4 6

材料
26 75. 00 82. 98 86. 00 92. 16 78. 43 21 48. 00 74. 00 81. 25 81. 63 58. 00 20 70. 59 78. 85 58. 00 46. 94 40. 38 14 62. 00 72. 55 68. 00 58. 00 46. 94 18 34. 00 46. 94 50. 00 41. 18 24. 00 28 28. 00 45. 10 42. 00 30. 61 18. 00 7 2. 00 4. 08 7. 84 4. 00 6. 12 2 60. 00 75. 51 78. 43 92. 00 65. 31

平均诱导率
47. 45 60. 00 58. 94 55. 81 42. 15

3  小结 N 6 和 MN 2 种基本培养基 、 酸水解酪蛋白质量

浓度 、 ,4 - D 质量浓度等因素对愈伤组织诱导率的 2 影响不显著 ,但对继代过程中愈伤组织质量影响较 大 ; 基因型 、 消毒时间 、 切胚方式 、 变温处理 、 蔗糖质 量浓度等因素对愈伤组织诱导率的影响显著 , 并且 对继代培养中的愈伤组织质量也有明显影响 。

不同材料的培养力存在很大差异 , 本试验筛选 出的高培养力材料是 : 齐 319 、 3168 × A188 、 - 1 × 87 Hi Ⅱ 。初步确定的成熟胚愈伤组织诱导与继代比 A 较适合的培养基是 : MN + 2 ~ 4mg/ L 2 , 4 - D + 500mg/ L 脯氨酸 + 100~200mg/ L 酸水解酪蛋白 + 20~30g/ L 蔗糖 + 7. 2g/ L 琼脂粉 。 本试验只研究了单一因素在愈伤组织诱导与继 代中的影响 ,在选用的 28 个材料中 , 部分材料诱导 ·41 ·

2009 年第 7 期

率比较理想 ,但继代培养质量很差 ,所以如何在继代 培养中综合调控各个影响因素是今后有待解决的问 题 。此外 ,成熟种子的贮藏时间和贮藏条件对愈伤 组织诱导与继代的影响也有待研究 。
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再分化研究 [J ] . 河南农业科学 ,2006 (2) :33 - 361 循环经济 [J ] . 农村牧区机械化 ,2007 (3) :26 - 271


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