当前位置:首页 >> 能源/化工 >>

实验六多糖的制备与检测


实验六 多糖的制备与检测

实验申请
实验项目:从植物种子中分离制备多糖(主要为β 葡聚糖) 实验材料:大麦种子 实验器材: (1)万能粉碎机 (3)电子天平 (2)恒温干燥箱 (4)恒温水浴锅

(5)集热式恒温加热磁力搅拌器 (6)离心机 (7)分光光度计(配套比色皿)

试剂:淀粉酶、蛋白酶、无水乙醇,

Na2CO3,HCl(调 pH 用) ,蒽酮试剂, 葡萄糖标准液( 100 μ g/mL ) 。 耗材及辅助器材: (1)温度计 (2)量筒 25ml×1, (3)试管 25ml×8 (4)pH 试纸 (5)烧杯 200ml×5 (6)50ml 容量瓶×5 (7)多种规格移液管
参考文献: [1] 蒋本国,王艳颖,李春斌,刘秋.生物化学实验.大连民族学院.2010.7 [2] 王镜岩,朱圣庚等,生物化学教程,高等教育出版社,2008.6. [3] 谭天伟. 生物分离技术.北京:化学工业出版社.,2007.7 [4] 刘宝全. 生化分离工程实验讲义(内部试用版).大连民族学院生命科学学 院.2011.6

qtw-1

基本实验方案
实验步骤: 1.灭内源酶活:将大麦磨成粉(40 目),85℃烘 30min。 2.除淀粉:按大麦粉:水等于 1∶6 加入水,90℃糊化 30 min,然后降温至 70℃, 调 pH=4.5 加 2ml 淀粉酶处理 2h。 3 去蛋白质:用胰蛋白酶在 37℃下 pH=7.5 处理上述溶液 2h。 (1000ml 去淀 粉液加蛋白酶 0.5m) 4 去酶:在 90℃,水浴 10 min。 5 去纤维素:将上述溶液用 8000min 的离心速度离心 10min,(所得上清液 为含有β -葡聚多糖、氨基酸或寡肽、单糖、低聚糖、水溶性维生素的溶 液。 ) 6 浓缩、除杂:由于多糖属大分子物质,而氨基酸、寡肽、单糖、低聚糖等 属小分子物质,用超滤法除去,同时也可用作浓缩。将清液用截留分子量为 10000 的膜,压力 1.2~1.4 MPa,温度 30℃,浓缩。 7 分离纯化:用饱和硫酸铵溶液将多糖沉淀,然后用无水热乙醇洗涤,再离 心收集,丙酮洗涤,真空干燥,得粗产品β -葡聚糖。 8 蒽酮法检测。(方法见第 5 页) 工艺流程图:

灭内源酶活

除淀粉

去蛋白质

浓缩 除杂

去纤维素

去酶

分离纯化

蒽酮法检测

qtw-2

实验记录
操作步骤: (1)灭内源酶活:将大麦磨成粉 (40 目),85℃烘 1 h。 操作结果及记录:

(2)除淀粉:将沉淀按 1∶6 比 例溶于水,90℃处理,糊化 30 min,然后降温至 60℃,pH 值 4.0~4.5 用糖化酶处理 2h。100g 大麦粉糊化后加入 15ml 糖化 酶.

(3)去蛋白质:用胰蛋白酶在 37 ℃下处理上述溶液 2h。(1000ml 去淀粉液加蛋白酶 0.5m)

(4)去酶:在 90℃,水浴 10 min。

(5) 去纤维素: 将上述溶液用 6000min 的离心速度离心 10min,(所得上清液为含有β 葡聚多糖、氨基酸或寡肽、单 糖、低聚糖、水溶性维生素的 溶液。 )

(6)浓缩、除杂:由于多糖属大分 子物质,而氨基酸、寡肽、单糖、 低聚糖等属小分子物质,用超 滤法除去,同时也可用作浓缩。 将清液用截留分子量为 10000 的膜,压力 1.2~1.4 MPa,温度 30 ℃,浓缩。

(7)分离纯化:用饱和硫酸铵溶 液将多糖沉淀,然后用无水热

qtw-3

乙醇洗涤,再离心收集,丙酮洗 涤,真空干燥,得粗产品β -葡聚糖。

(8)蒽酮法检测。

蒽酮比色法: 葡萄糖标准溶液( 100 μ g/mL ) :准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖, 溶于 蒸馏水并定容至 100 mL ,使用时再稀释 10 倍( 100 μ g/mL ) 。 蒽酮试剂:称取 1.0 g 蒽酮,溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释,把 浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000 mL 中,冷却至室温,贮于具塞棕色瓶 内。称取样品粉末( 5 ~ 100 mg ) ,放入大试管中,加入 15 mL 蒸馏水, 在沸水浴中煮沸 20 min ,取出冷却,过滤入 100 mL 容量瓶中,用蒸馏 水冲洗残渣数次,定容至刻度。 2. 标准曲线制作 取 6 支大试管,从 0 ~ 5 分别编号,按表 24-1 加入 各试剂。表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 管号 0 0 1.0 5.0 0 1 0.2 0.8 5.0 20 2 0.4 0.6 5.0 40 3 0.6 0.4 5.0 60 4 0.8 0.2 5.0 80 5 1.0 0 5.0 100

试剂 100 μ g/mL 葡 萄糖溶液(ml) 蒸馏水(ml) 蒽酮试剂(ml) 葡萄糖量(μ g)

将各管快速摇动混匀后,在沸水浴中煮 10 min ,取出冷却,在 620nm 波 长下,用空白调零测定光密度,以光密度为纵坐标,含葡萄糖量( μ g ) 为横坐标绘制标准曲线。 样品测定 取待测样品提取液 1.0mL 加蒽酮试剂 5 mL ,同以上操作显色 测定光密度。重复 3 次。
qtw-4

实验结果与分析
实验记录: 1、实验原料质量:10.085g 2、提取固液比为:1:6 3、最后一次离心所得液体的体积:V=134ml 4、产品 OD 值测定: 实验 pH=6.0 - 6.5

稀释倍数 OD 值

100 0.885

1000 0.120

根据葡萄糖溶液标准曲线:

得到标准曲线方程: y ? 0.249 x ? 0.003
OD 值为 0.885 时, y ? 0.249 x ? 0.003 ? 0.249 ? 0.885 ? 0.003 ? 0.2234 (mg / ml ) OD 值为 0.120 时, y ? 0.249 x ? 0.003 ? 0.249 ? 0.120 ? 0.003 ? 0.0329 (mg / ml )

① 根据稀释 100 被数据计算:

qtw-5

C产品 ? C测 ? 稀释倍数 ? 0.2234 ?100 ? 22.34 mg / ml) (

m(产品 ? 100)? C产品 ? V ? 22.34 ? 134 ? 2993 .56mg

② 根据稀释 1000 被数据计算:
C产品 ? C测 ? 稀释倍数 ? 0.0329 ?1000 ? 32.(mg / ml) 9

m(产品 ? 1000)? C产品 ? V ? 32.9 ? 134 ? 4408 .6mg

m 产品 ?

m(产品 ? 100)? m(产品 ? 1000) 2993 .5 ? 4408 .6 ? ? 3701 .05mg 2 2

所以产品的粗提得率为:
η? m 产品 3701 .05 ?100 % ? ?100 % ? 36.70% m原料 10.085 ?1000

实验结果分析: 1、在本次实验的操作中我们只进行了淀粉水解与酶失活处理, 所以所提取 出的多糖为粗提产品,纯度不高,含有大量的杂质。 2、实验所得产品的粗提率为 36.70%。根据文献记载偏高,也说明了所提 物质中有大量杂质,初步分析为一些为除去的淀粉、纤维素、蛋白质、 水溶性维生素等成分。 3、本次试验中添加的淀粉酶用量为严格按照比例添加, 会导致淀粉清除不 彻底,影响实验结果。 4、本实验中应注意三次离心的目标产物与离心的目的:
次序 第 1 次离心 第 2 次离心 第 3 次离心 目标产物 上清液 沉淀 上清液 目的 除去不溶于水的物质 醇沉的多糖物质 除去不溶于水的杂质

qtw-6

注意:在实验过程中应记录第一次离心后所得上清液的体积,然后取取部 分液体继续进行以下步骤,这样既可以减少离心的工作量,同时又可以避 免多次离心所带来的误差。

实验原理: 1、大麦是我国古老的药食兼用植物。我国大麦资源丰富,但 70%以上的大 麦和大麦麸皮用作饲料,大麦资源利用附加值低。研究表明,大麦具有调血 脂、抗衰老、降血糖等多种药理活性。多糖作为一种重要的生命物质,具有 多种生物活性。本论文以大麦和大麦麸皮为原料,研究大麦多糖和大麦麸皮 多糖的提取、抗氧化活性和体外抑瘤作用,为功能性食品和药品的研究开发 提供依据,为大麦和大麦麸皮的高效利用提供新途径。在大麦胚乳细胞壁 (75% ) 和糊粉层细胞壁(26% )中含有 3% ~5%的β -葡聚糖,有些品系可高达 12%β - 葡聚糖是一种重要的非淀粉多糖,其结构由均一的 D-吡喃葡萄糖 (Glcp)单位通过β -(1→3)和β -(1→4)键连接而成,其中大约包括 58% ~72% 的由β -(1→3)键连接的纤维三糖和 20% ~34%的纤维四糖单位。β -(1→3) 键往往单个存在,β -(1→4)键则可 2 个、3 个连续存在,最大可以达到 14 个葡萄糖单位[3]。这些结构特点,使得β -葡聚糖表现出可溶性、高黏性、凝 胶形成等多种功能特性,因此β -葡聚糖不仅具有降低胆固醇、降血糖、改善 肠道功能等保健作用[4, 5];而且还可以作为增稠剂、凝胶剂等应用于食品工 业中,是一种重要的可溶性膳食纤维。 2、蒽酮法测定可溶性糖原理 :糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛 或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍 生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量 测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖 与己糖含量,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等 (因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应) 所以用蒽酮 , 法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

qtw-7

在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总 量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合 物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞 壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外, 不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半 乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖 类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。糖类与 蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ,故在此波长 下进行比色。

实验材料补充
1、 测定多糖含量的其他方法 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖, 并迅速脱水生成糖醛衍生 物,然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 注意: (1)此法简单、快速、灵敏、重复性好,对每种糖仅制作一条标准曲线,颜色 持久。 (2)制作标准线宜用相应的标准多糖,如用葡萄糖,应以校正系数 0.9 校正 μ g 数。 (3)对杂多糖,分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的 校正系数加以校正计算。 (4)测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在 0.1——0.3 之间。比 如:小于 0.1 之下可以考虑取样品时取 2 克,仍取 0.2ml 样品液,如大于 0.3 可 以减半取 0.1ml 的样品液测定。 2、硫酸苯酚法与硫酸蒽酮法测多糖对比: 2.1.苯酚法测定可溶性糖 植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖 的原理是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙 红色化合物,在 10-100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在 485nm 波长 下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。 苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本 不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定 160min 以上。 2.2.蒽酮法测定可溶性糖 qtw-8

糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛 可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物, 在一定范围内, 颜色的深浅与糖的含量成正比, 故可用于糖的定量。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖,而且可以 测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等,因为反应液中的浓硫酸可以把多 糖水解成单糖而发生反应 X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中 全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用意酮 法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳 水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中 的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与 蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳 糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一 糖类时,则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 630nm,故在此波长下进行比 色。 总结: 硫酸苯酚法不同单糖显色后产生较好吸收峰,稳定性也很好,但不同时间不同操作人 员操作时所测数据有差异,建议在使用硫酸苯酚法测定多糖含量时,需同时用对照品 作对照,并结合标准曲线参数计算多糖含量,避免直接由标准曲线读数,使得不同时 间所测数据产生较大差异。硫酸蒽酮法稳定性较差,线性关系不理想,重现性、稳定 性所测数据差异较大,并且蒽酮试液稳定性也较差,需临时配制,特别是加热后最大 吸收峰偏移较大,建议在进行多糖含量测定时不宜采用此法。 3、多糖相关介绍 多糖(polysacharides,PS),又称多聚糖,是由 10 个以上的单糖通过苷键连 接而成的,具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、 藻类、微生物(细菌和真菌)与动物体内。20 世纪 60 年代以来,人们逐渐发现多糖 具有复杂的、多方面的生物活性和功能:(1)多糖可作为广谱免疫促进剂,具有免疫 调节功能,能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病,甚至能抗 AIDS 病毒。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用,黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和 芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降 血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射,增强免 疫功能等生物学作用, 麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用, 动物黏多糖具有抗凝血、 降血脂等功能。(3)多糖能控制细胞分裂和分化,调节细胞的生长与衰老。如爬山虎 多糖具有抗病毒和抗衰老作用,银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止 咳祛痰、减肥等功能。 另外,多糖作为药物,其毒性极小,因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。 由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关,而多糖的结构又是相当复杂的,所以在 这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。 4、多糖的提取: 4.1 热水浸提法 4.2 微波辅助提取法 4.3 超声辅助法

qtw-9

4.4 索氏提取法 4.5 醇提法 4.6 其它方法 多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱 条件下,易使多糖发生糖苷键的断裂,部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少,因 而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。 多糖的分析鉴定 5、多糖鉴定 5.1 含量的测定 测定方法:硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、纸色谱法、 离子交换色谱法、yaphe 法、薄层色谱法、酶法、原子吸收法、HPLC 法、凝胶电泳 法、 亲和电泳法、 连续流动分析法检测法、 次亚碘酸盐定量法、 蒽酮-硫酸法 (总糖) 、 DNS 法( 还原法)、磷钼比色法、邻钾苯胺比色法等. 每种方法只对某些多糖的测 量效果好. 比色法、分光光度法、离子交换色谱法、酶法和电泳法等可同时用于多糖 的定性定量分析. 5.2 纯度鉴定 多糖是高分子化合物,其纯品微观上是不均一的,通常所说的多糖纯品实质上是 一定分子量范围的均一组分. 多糖纯度鉴定的常用方法:超离心、高压电泳、凝胶层 析、HLPC 法等. 现在应用较多的是 HLPC 法,旋光度测定也是纯度测定的一种方法. 5.3 分子量的测定 多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作. 常用方法:渗透压法、蒸气 压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电 泳法、HPLC 法、超离心分析法、分子筛色谱法、GPC 法[47]、MALDI-TOF-MS 法. 5.4 结构测定 5.4.1 多糖一级结构测定多糖的一级结构分析,主要是分析组成多糖的单糖类 型、数目、连接方式及苷建 构型. 常用化学法和仪器分析法. 多糖组分与分子比例测定法:部分酸解法、完全酶 解法、色谱法;吡喃、呋喃环形式结构的分析:红外光谱;连接次序:选择性光谱法、 糖苷键顺序水解、核磁共振;α -β -异头异构体:糖苷酶水解、核磁共振;羟基被 取代情况:甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、Smith 降解法和测硫酸基法(terho 法)、核磁共振、质谱法;糖链、肽链连接方式:单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、 肼解反应;多糖结构的分析方法很多,迄今没有一种方法可以单独完成多糖结构的分 析. 仪器分析与化学方法相结合是常用的多糖结构测定方法. 5.4.2 多糖高级结构测定目前研究多糖的二级结构常用的手段是 NMR 技术,如 2D-NMR,C 谱,通用的方法是将现代 NMR 技术与理论计算相结合通过一定的理论计 算筛选构象,主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算. 圆二 色谱法(CD)也可用于糖的构象分析,张丽萍等应用 CD 谱测定了金顶侧耳多锗的水 溶液构象. 近年来,以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所 未有的深度和广度,多糖作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势必推动对多 糖的认识向深层次发展. 6、多糖的应用展望 qtw-10

我国对多糖的研究起步较晚,但近年来的工作取得了较大的进展,愈来愈多的多 糖被发现. 并证实它们具有复杂、广泛的生物活性和功能. 随着对多糖生物活性的深 入研究, 多糖的生物活性机理, 功效因子会更加明确, 它的应用领域也将会更加拓宽. 然而, 由于多糖本身结构比较复杂, 种类繁多, 其结构测定和分离纯化有很大的难度; 有些多糖在天然植物中的含量低且不易分离及多糖的药理作用与诸多因素有关,给多 糖的研究和应用带来许多的挑战,这需要相关行业的人士共同应对.

板书说明
实验六:多糖的制备与检测(β -葡聚糖)
一、 影响制备结果的因素: 1、 底物(固液比 1:6) 2、 酶的 buffer 3、 酶的温度 pH 值 6.0-6.5 离子强度 辅助因子 4、 酶的用量(0.06g 酶/10g 粉) 5、 酶解时间 二、 离心注意事项 1、 适用 2、 标记 3、 平衡(<0.01g) 四、总糖 DNS ①大麦磨粉 ②按固液比加水调匀 ③加淀粉酶水解 4、 放置 ④加热除酶 三、所用试剂 1、2%CaCl2 缓冲溶液 pH=6.5 2、蒽酮试剂:H2N 0.1234g H2N C=S ⑤离心,取水解液-除去不溶杂质(记 录上清液总体积 V) ⑥取部分离心,去沉淀-醇沉多糖 ⑦加水,溶解沉淀 ⑧离心取上清液-除去产物中不溶于 水的杂质。 ⑨取产品溶液稀释,加蒽酮比色(记 录 OD 值) ⑩根据比色所得 OD 值查对应的葡萄 糖-蒽酮标准曲线。 得到总糖浓度 (C) , 计算。

qtw-11


相关文章:
粗多糖检测方法
多糖检测方法_环境科学/食品科学_工程科技_专业资料。保健食品检验与评价技术...6. 准确度与精密度 在不同食品中进行不同浓度的加标回收试验,回收率为 87....
设计性实验-多糖的定性与定量
第二部分 多糖组分的检测---TLC 分析法 1 材料...1.3 水解多糖样品的制备 多糖样品液加入12mol/L的...6页 免费 生物化学实验操作手册 77页 1下载券©...
茶多糖的制备工艺及质量控制
多糖的制备工艺与质量检测多糖的制备工艺及质量...2 第一章 1.1 材料绿茶 实验材料 产地浙江杭州 ...3.6.6冻干冻干后得纯化的黄褐色茶多糖样品。 3.6.7...
粗多糖的检验方法 Microsoft Word 文档
多糖的检验方法 1、方法原理 粗多糖在硫酸的作用...3.32、供试液的配制 精密称取粗多糖粉末 0.2000...同时作试样空白实验。 5.4 分析结果表述 试样中...
细菌脂多糖的制备与纯化
制备出鸡白痢细菌的脂多糖(Lipopolysaccharides 检测出...(PCP) 6 第 1 章 文献综述 组成的混合溶剂从...7 第 2 章 实验材料与方法 第 2 章 实验材料与...
植物多糖提取分离检测
植物多糖提取、分离及检测 实验目的 学习并掌握植物...的聚合糖高分子 碳水化合物,可用通式(c6h10o5)n...(2)糖腈乙酸酯衍生物的制备 称取 10mg 单糖样品...
多糖方案
2014.6 月 倪嘉辉 一、 实验目的:学会提取多糖,...(请写明具体配制方法及使用的量): 羊栖菜、无水...各管用硫酸苯酚检测多糖。合并多糖高 峰部分,浓缩后...
枸杞多糖检测作业指导书
6页 2.00元 枸杞多糖检测方法研究 37页 免费 枸杞...5.仪器和设备 5.1 实验用样品粉碎机 5.2 电子...7.2 试样的测定 7.2.1 样品溶液的制备 精密称...
灵芝多糖检测方法
灵芝多糖检测方法_药学_医药卫生_专业资料。灵芝多糖检测方法 1、 蒽酮-硫酸法 ...【标准曲线的制备】分布精密吸取对照品溶液 0.2ml、0.4ml、0.6ml、 0.8...
粗多糖检测方法(蒽酮比色法)
2 试剂 实验用水为双粗多糖检测方法(蒽酮比色法): 1 主要仪器 (1)离心机(...(0.1mg/ml)0、0.1、0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0ml 于 10ml 具塞...
更多相关标签: