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过氧化物酶活性的测定


过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法) 实验 29 过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中, 其活性与植物的代谢强度及抗寒、 抗病能力有一 定关系,故常加以测定。 一、原理 过氧化氢酶(catalase)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧, 在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据 H2O

2 的消耗量或 O2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液,经酶促反 应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的 H2O2 的量。 二、材料、仪器设备及试剂 材料、 (一)材料:小麦叶片 (二)仪器设备:1. 研钵;2. 三角瓶;3. 酸式滴定管;4. 恒温水浴;5. 容量瓶。 (三)试剂:1. 10%H2SO4;2. 0.2 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液;3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称: 取 KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000ml,再用 0.1mol/L 草酸溶液标定; 4. 0.1mol/L H2O2 市售 30%H2O2 大约等于 17.6mol/L,取 30%H2O2 溶液 5.68ml,稀释至 1000ml, 用标准 0.1mol/L KMnO4 溶液(在酸性条件下)进行标定;5. 0.1mol/L 草酸:称取优级纯 H2C2O4.2H2O 12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至 1000ml。 三、实验步骤 (一)酶液提取:取小麦叶片 2.5g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至 25ml 容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转至容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm 离心 15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 (二)取 50ml 三角瓶 4 个(两个测定,另两个为对照) ,测定瓶加入酶液 2.5ml,对照加煮 死酶液 2.5ml,再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2,同时计时,于 30℃恒温水浴中保温 10min,立即加 入 10%H2SO42.5ml。 用 0.1mol/L KMnO4 标准溶液滴定,至出现粉红色(在 30min 内不消失)为终点。 四、结果计算 结果计算 酶活性用每 g 鲜重样品 1min 内分解 H2O2 的 mg 数表示: 过氧化氢酶活性(H2O2mg/g/min)=(A-B)×VT/(W×VS×1.7×t) 式中:A 对照 KMnO4 滴定 ml 数;B 酶反应后 KMnO4 滴定 ml 数;VT 提取酶液总量(ml) ; VS 反应时所用酶液量(ml) ;W 样品鲜重(g) 反应时间(min) ;t ; 1.71ml0.1mol/L KMnO4 相当于 1.7mgH2O2。


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