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RAPD技术及在甲壳动物遗传多样性中的应用


河北渔业!2010 年第 7 期( 总第 199 期)

? 专论与综述

doi: 10. 3969/ j. issn. 1004- 6755. 2010. 07. 018

RAPD 技术及在甲壳动物遗传多样性中的应用
周宝洪, 范樟荣, 周海东
( 遂昌县水利局, 浙 江 丽水 323000)

摘 要: 介绍了 RA PD 技术的特点、 原理及在甲壳动物 遗传多样性 研究中的 优点, 并综述 了近几 年 RA P D 技

术在甲壳动物遗传多样性研究中的进展。 关键词: 甲壳动物; RA P D 技术; 遗传多样 性

根据现代遗传学的观点, 物种的遗传性状是 由基因决定的, 外部形态的变异及体内蛋白质分 子的变化其本质是基因中 DNA 碱基序列发生了 改变, 因此, 从 DNA 着手, 物种的遗传和 变异及 与此相关的一系列问题均能得到有效解决。近年 来, 在 DNA 聚 合 酶 链 反 应 技 术 ( P olym erase Chain Reaction, P CR) 基础上发展起来的 随机扩 增多态 性 DNA 技 术 ( Random Amplified Po ly mor phic DNA, RAPD) 具有操作简便, 实 验周期 短, 对 DNA 纯度要求不高, 检测过程中不需要同 位素, 也不需要进行克隆和测序, 并能克服同工 酶电泳位点偏少等特点, 已成功地应用于动物、 植 物遗传多样性的检测、 基因定位、 品系鉴定、 遗传 图谱的构建和系统学研究等诸多领域 研究应用作一介绍。
[ 1]

通过 PCR 产物的检测即可测 出基因组 DNA 在 这些区域的多态性。

2 RAPD 技术应用于甲壳动物遗传多样 性研究中的优点
20 多年来, 同工酶电泳技术几乎是检测水产 动物种质资源唯一有效的方法, 建立在 DN A 水 平上的分子遗传标记是近几年才发展起来的。同 工酶技术考察的是不同基因位点或等位基因编码 的蛋白质或多肽表达的特性, 在很大程度上低估 了甲壳动物整个基因组的遗传变异水平, 与同工 酶电泳相比, RA PD 技术在甲壳动物遗传多样性 中的应用有其独特优势: ( 1) RAP D 技术简单, 容 易掌握, 在短期内可获得大量遗传标记, 克服了同 工酶位点偏少的缺点[ 2] , 利用 RAPD 技术可以同 时揭示从种间至科间以上关 系相对应的遗 传差 异, 如中华绒螯蟹 Er i ocheir sinensi s 和日本绒螯 蟹合浦亚种 E ri ocheir j ap onicus hep uensis 在形 态上极为相似, 没有显著的同工酶带差异, 但是, 利用 RAP D 技术从 DNA 水平上观察到两种绒螯 蟹个体 间 存 在一 定 差 异[ 3] ; ( 2) RAPD 技 术 对 DNA 要求不严格, 高天翔等[ 4] 用冷冻、 酒精固定、 福尔马林固定及煮沸过的材料作 DNA 多样性分 析, 均可得到清晰的酶带; ( 3) RA PD 技术可以在 没有任何分子遗传背景情况下对物种基因组进行 DNA 多态性分析, 这对目前在大量甲壳动物分子 遗传背景还不清楚情况下, 利用 RAPD 这一特性 可以很方便地分析各甲壳动物间的遗传差异; 4) RA PD 技术可选择的引物很多, 既可以对整个基 因组进行全面的分析, 也可以对基因组间微小的 差异进行检测。 37

, 本文就

RA PD 的特点及其 在甲壳动物遗 传多样性中 的

1

RAPD 技术的基本原理
RA PD 技术建立在 PCR 技术基础上, 利用一

系列随机排列的碱基序列作引物, 对基因组 DNA 进行 PCR 扩增, 扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂 糖凝胶电泳分离, 经溴化乙锭( EB) 染色或通过放 射自显影检测扩增产物 DN A 片段的多态性。虽 然 RAPD 所用的引物 DNA 序列各不相同, 但对 于特定引物, 与基因组 DNA 有特定的结合位点, 如果这些结合位点在基因区域分布符合 PCR 扩 增反应条件, 就可扩增出 DNA 片段, 因此, 若基 因组在这些区域发生 DNA 片段插入、 少或碱 缺 基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相 应变化, 而使 P CR 产物增加、 缺少或分子量改变,

河北渔业!2010 年第 7 期( 总第 199 期)

? 专论与综述 思发 [ 12] 用 48 个引物对辽河、 黄河、 长江、 瓯江、 珠 江和南流江的中华绒螯蟹和日本绒螯蟹 6 个群体 进行 RAPD 分析。结果发现: ( 1) 2 个引物具有群 体特异带, 其中 Z2 扩增的 880 bp 片段为珠江蟹 和南流江蟹群体所 特有, 而 700 bp 片段为 长江 蟹、 辽河蟹、 黄河蟹和瓯江蟹所特有, 可作为区分 中华绒螯蟹和日本绒螯蟹的分子遗 传标志, ( 2) Opp17 扩增的 947 bp 片段的出现频率, 在长江、 黄河、 辽河群体显著地从南到北递减, 此遗传渐变 的度量可作为区分三个水系中华绒螯蟹种群的判 断依据。 3. 2 RAPD 技 术在 贝 类遗 传多 样性 研究 中 的 应用 长期以来, 贝类的繁殖与育种工作是根据贝 类的形状、 壳色和珍珠的颜色进行的, 但以上性状 作为育种工作选择还存在很多问题。近年来, 很 多工作者利用 RAP D 技术分析贝类的 遗传多样 性, 保护贝类种质资源, 获得了一定的效果。王爱 [ 13] 民等 利用 RAP D 技术对广东三个地区的马氏 珠母贝( Pi nctada m ar tensii ) 天然群体和人 工养 殖群体进行分析, 群体的遗传变异度表明, 天然群 体的遗传多样性大于养殖群体的遗传多样性。

3 RAPD 技术在甲壳动物遗传多样性研 究中的应用
3. 1 在虾蟹类遗传多样性研究中的应用 近年来, 随着人工繁殖技术的大力推广、 小群 体繁殖、 过量的捕捞及水域环境的污染, 造成虾蟹 类资源严重退化。因此, 研究它们的遗传差异, 对 保护虾蟹类种质资源和保证养殖业的健康发展有 重要意义。 在虾类遗传种质资源保护上, Garv ca [ 5] 利用 RA PD 技术分析 了凡纳对虾 P enaeus p raw n 不 同品系的遗传变异, 并成功筛选了一些特异性标 [ 6] 志; 宋 林 生 用 RAPD 技 术 研 究 了 日 本 对 虾 P enaeus j ap oni cus 野生种群和养殖群体的结构, 确定了野生种群的多态性位点比例和杂合度明显 高于养殖群体; 甘西等[ 7] 分析了 20 世纪 70 年代 从马来西亚引进的 7 对罗氏沼虾 Macr obr achi um r osenber gii 后代的养殖群体( 简称 NY) 和 20 世 纪 90 年代从新加坡引进的天然群 体 F 1 与养殖 群体交配繁殖的后代( 简称 NX) , 发现 NY 群体 变异度明显小于 NX 群体, 推测与 NY 群体长期 在小群体内繁殖, 导致种群退化有关; 宋林生[ 8] 用 RA PD 标记了六种海产虾类, 结果显示六种虾的 亲缘关系与传统的分类结果一致。 在蟹类遗传种质研究中, 邱涛等[ 9 ] 用 RA PD 技术对中华绒螯蟹长江、 辽河、 瓯江种群进行了研 究, 虽然未发现种群特征标记带, 但找到了一个 能扩增中华绒螯蟹性别差异的 RA PD 引物, 随后 [ 10] 高志千等 用 200 个随机引物对长江、 辽河、 瓯 江 3 个种群进行了 RAPD 扩增, 发现长江种群的 遗传变异率最低, 其次为辽河种群和瓯江种群, 并 且发现辽河种群与瓯江种群间的遗传距离小于它 们分别与长江种群的遗传距离, 更为重要的是他 们发现了两个能区别中华绒螯蟹长江种群与另两 个种群的引物; 项美超等 采用 RAPD 技术, 对 分类阶元不同的四种十足目甲壳动物, 克氏原螯 虾 P rocambarus cl ar ki i 、 水华 溪蟹 Si nop ot a 汉 mon l ansi i 、 日本绒螯蟹合浦亚种和中华绒螯蟹, 进行遗传多态性研究, 结果显示随着亲缘关系由 近到远, 物种间的相似率 依次降低, 由 56. 1% 下 降到 22. 3% , 并发现在种间, 日本绒螯蟹 合浦亚 种个体间的平均相似率显著高于中华绒螯蟹个体 间的平均相似率, 异种绒螯蟹个体间的平均相似 率显著低于同种绒螯蟹个体间的平均相似率; 李 38
[ 11]

4

展望
综上所述, RAPD 技术已经迅速渗透到甲壳

动物学研究中, 可以预见, 随着甲壳动物遗传多样 性研究 的深 入, RAP D 技术 将与 其 他技 术相 结 合, 在甲壳动物种质资源保护方面做出重要作用。 参考文献:
[ 1] 王桂荣. RA PD 技术及在昆虫学研究中的应 用[ J] . 昆虫知识, 1999, 36( 3) : 184- 188 [ 2] 杨丽萍, 高运东, 侯明海, 等. RA PD 技术及其应用[ J] . 山东畜 牧畜医, 2000( 1) : 26- 28 [ 3] 石拓, 孔杰, 刘萍, 等. 中国对 虾遗传多 样性的 R A PD 分 析朝鲜半岛西海岸群体的 D N A 多态性[ J] . 海洋与湖沼, 1999, 30 ( 6) : 609- 615 [ 4] 高天翔, 张秀梅, 曾晓起, 等. 固定标本的 D N A 提取 及 PCR 扩 增[ J] . 青岛海洋大学学报, 2000, 30( 2) : 245- 248 [ 5] G arcia D K , bengie J A H. Th e U se of RA PD M arker s on Penaeu s Praw n Br eedin g Program [ J ] . A quault ure, 1994, 130: 137- 144 [ 6] Song L S, X iang J H. St udy of Populat ion G enet ic St ructu re in Penaeus Japonicu s w it h RA PD M arkers[ J] . O ceanologia et Limn ol ogia Sinica, 1999, 30 ( 3) : 261- 266

( 下转第 61 页)

河北渔业!2010 年第 7 期( 总第 199 期) 续表
品名 梭 鱼 银 鲳 黄 鳝 鲂 鱼 0. 15 0. 2 雌 0. 2~ 0. 3 0. 2 雌 0. 2 雄 0. 5 野生 0. 5 甲 鱼 0. 5 活 日本 对虾 牙鲆 海红蟹 金鲳鱼 12cm 300 头/ kg 0. 6 活 0. 7 养殖 大 0. 2~ 0. 3 活 规格 0. 5 死 0. 4 价格 16. 5 24 15 70 12 42 37. 5 18 15 100 梭 子 蟹 50 150 80 120 90 45 180 40 44 42 44 80 120 64 70 11. 5 180 市 场 品名 带 鱼 死 0. 15~ 0. 3 0. 6 活 规格 价格 20 12 24 52 76 36 56 67. 5 34 32 32 0. 2 0. 3~ 0. 5 活 10cm 0. 01~ 0. 02 13cm 11cm 死 0. 6 0. 5~ 1 44 53 40 40 33 30 46 16 36 64 50 57. 5 24 24 50 市

? 水产商情



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14~ 28 石家庄市方北由由水鲜城

基围虾 0. 03~ 0. 04

( 上接第 38 页)
[ 7] 甘西, 邓风娇, 陈晓汉, 等. 罗式沼虾遗传多样性的 R A PD 研究 [ J] . 武汉大学学报( 自然科学版) , 2000, 46 ( 2) : 215- 218 [ 8] 宋林生, 相建海, 周岭华, 等. 六种海产虾类基因组 D N A 多 态性的 RA PD 标记研 究[ J] . 海洋与 湖沼, 1999, 30 ( 1 ) : 63 - 67 [ 9] 邱涛, 陆仁后, 项超美, 等. R A PD 方法对 中华绒螯 蟹长江、 辽河、 江三 群体的 遗传多 样性分 析[ J ] . 淡水 渔业, 1997, 瓯 27 ( 5) : 2- 6 [ 10] 高志千, 周开亚. 中华绒螯 蟹遗传变 异的 R A PD 分 析[ J ] . 生 物多样性, 1998, 6( 3) : 186- 190 [ 11] 项美超, 陆仁后, 谢浩, 等. 四种十足 母甲壳动 物遗传差 异的 R APD 分析[ J] . 水生生物学报, 1998, 22( 3) : 251- 254 [ 12] 李思发. 中国大陆沿海六 水系绒螯 蟹( 中华 绒螯蟹和 日本绒 螯蟹) 群体亲缘关系: R A PD 指纹标记[ J] . 水产学报, 1999, 23( 4) : 325- 330 [ 13] 王 爱 民, 邓 风 娇, 张 锡 元, 等. 马 式 珠 母 贝 遗 传 多 样 性 的 R APD 分析[ J] . 武汉大学学报( 自 然科学版) , 2000, 46 ( 4) : 467- 470

RAPD Technology and its Application on DNA Polymerphism in Crustacea
Zho u Baohong, F an Zhang rong, Zhou H aidong
( Su ichang W ater Con servancy bu reau, Lishu i 323000 Zh ejiang)

Abstract: T he charact erist ic and t heo ry of RAP D t echno logy w as int roduced in the paper, and it s merit and applicat ion dev elo pm ent on DNA poly merphism in crust acea also be rev iew ed. Key words: Crust acea; RAPD T echnolo gy; DNA po lymerphism ( 收稿日期: 2010- 0461
25)


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