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淀粉酶产生菌的筛选


实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定
指导老师:辛树权 生命科学学院 08 级生物技术(三)班 豆豆 同组人:xx xxx

摘要:自然界是微生物的大本营,实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。 摘要
壤样本,拿到实验室中,进行淀粉产生菌的筛选。

我们从学校的花坛中采集一些土

利用土壤制成菌

液,将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化,再用

淀粉培养基培养, 最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。 再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。

关键词: 关键词 淀粉酶;分离;纯化;透明圈;酶活力;摇瓶;分光光度计 一、实验目的: 实验目的 1、学习从土壤中分离微生物的方法; 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理: 实验原理

土壤中含有大量的微生物,将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上,在适 宜的环境中培养几天,细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖,形成 菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养,因为只有能够产生淀 粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动,才能够生 存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液,淀粉被 分解掉的部分不显现蓝色,出现透明圈,可以通过透明圈的大小来初步判断菌 种产淀粉的能力。

淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称,主要包括 α- 淀粉酶和 β-淀粉酶等,α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4 糖苷 键,形成麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖,是淀粉的粘 度下降,因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在 660nm 处有较大的吸收峰,可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用,淀粉 长链被切断,生成小分子的糊精,使其对碘的蓝色反应逐渐消失,因此可以根 据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。

三、实验器材及试剂: 实验器材及试剂: 1.、材料:长春师范学院家属楼前小菜园 2 培养基: (1)分离培养基:牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、 NaCl 5g、 溶于 1000mL 蒸馏水中, 再加入 15g 琼脂粉, 调至 7.2, pH 121℃ 灭菌 15min,待冷却至 50℃左右时,于超净工作台倒平板) (2)筛选培养基:淀粉培养基(可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢 二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000 毫升,调整 pH 值到 7.2~7.4。) (3)摇瓶培养:淀粉培养液。 3、试剂: 碘液、 2%可溶性淀粉、 pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、 标准糊精溶液、 0.5mol/L 乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材: 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。

四、实验步骤: 实验步骤 1、淀粉产生菌的筛选: (1)采集土样,并用无菌水稀释成菌悬液; (2)配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基,倒平板备用; (3)将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白胨平板上,于 37 摄氏度培养箱中培养一天; (4)挑取整个菌落,将其移入淀粉培养基中,继续放在 37 摄氏度培养 箱中培养两天; (5)将碘液滴在平板上,观察透明圈的大小。 2、酶活力测定: (1)选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养,将菌溶于 5ml 无菌生理 盐水中,吸取此培养液加入淀粉培养液中,30 摄氏度摇瓶培养 72h。 (2)酶液稀释: 取发酵液进行 4000r/min 离心 5min,取上清液,用缓冲液适当稀释。 (3)标准曲线制作: 准备七支试管,按照下表配置混合液。使用分光光度计策规定各管 溶液在 660nm 下的 OD 值。然后以淀粉浓度为横坐标,吸光度为纵坐标, 做标准曲线。 (4)酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管的要求配置混合

液,测得吸光度后,在标准曲线上查出相应的淀粉浓度,求出被酶消耗 的淀粉量。

管号 淀粉稀释液/ml 缓冲液/ml

1 2(0%) 1

2

3

4

5

6

7(样品) 2(2.0%) 1

2(0.2%) 2(0.5%) 2(1.0%) 1 1 1

2(1.5%) 2(2.0%) 1 1

40 摄氏度水浴保温 5min 蒸馏水/ml 粗酶液/ml 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1

40 摄氏度水浴保温 30min,然后放入沸水浴 5min 稀碘液/ml 1 1 1 1 1 1 1

(5)酶活力测定: 酶活力以每毫升粗酶液在 40 摄氏度, pH6.0 的条件下每小时所分解的淀 粉毫克数来衡量。 五、实验结果: 实验结果: 1 淀粉产生菌的筛选:

淀 粉 产生 菌 透明圈

培养基中含有淀粉,淀粉产生菌具 有产生淀粉酶的能力,淀粉酶能将 培养基中的淀粉分解掉。当在培养 基上滴加稀碘液时,含有淀粉的部 分被染为蓝色,而被淀粉酶消耗掉 淀粉的部分则表现为不着色的透 明圈。根据透明圈的大小可粗估出 不同淀粉产生菌的产淀粉酶能力 大小,透明圈越大则产淀粉酶能力 越强。

淀粉产生菌透明圈的检验图 2、酶活力测定: (1)实验原始数据: 管号 1 0 2 0.235 3 0.584 4 1.107 5 1.375 6 1.788 7 1.540

OD

660

(2)标准曲线:
淀粉含量标准曲线图 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 淀粉含量mg 40 50 OD值 系列1 线性 (系列1)

y = 0.047x R2 = 0.9779

(3)计算: 样品的 OD660=1.540 查标准曲线可得:淀粉含量=1.540/0.047=32.766mg

初始淀粉含量=2g/100ml×2ml=0.04g=40mg 被消耗的淀粉含量=40mg-32.766mg=7.234mg 酶活力=7.234mg/(1ml×0.5h)=14.468 mg/(ml·h) 六、实验结果分析: 实验结果分析 平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响,例如菌种特性、接种量 大小、培养时间、酶的稳定性、温度范围、平板厚度等。绘制的淀粉含 量标准曲线也会受实验室环境影响及误差而造成不准确,酶活力的表示 方法也有多种,仅是一个相对的数值。 七、参考文献: 参考文献: [1]吴根福、杨志坚.发酵工程实验指导.北京:高等教育出版社,2006. [2] 王弋博,李博,李三相,张海林,金文晶. 异淀粉酶产生菌的分离纯 化及生长特性. 青海师范大学学报,2003. [3]王丽丽,仪宏,田庄,李志军. A2 淀粉酶产生菌的平板筛选法的研 究与改进. 河北轻化工学院学报,1998. [4]李艳.发酵工程原理与技术.北京:高等教育出版社,2007. [5]吴燕萍、金其荣、李迅.微生物法生产普鲁兰酶的研究[J ].生物技 术,1998,8(6):14-17. [6]唐蕾.耐热性普鲁兰酶进展[J ].天津微生物,1983. [7]袁勤生.应用酶学[M].上海:华东理工大学出版社,1994. [8]江均平.热稳定的曲霉植酸酶.微生物学报.1996,36(6):476~ 478. [9]郭杰炎,蔡武城编著.微生物酶.北京: 科学出版社, 1986. 75~ 77. [10]邬显章.酶的生产技术.吉林:吉林科技出版社,1988. 360~ 365.


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