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干旱胁迫对小麦的生理生化化指标的影响


干旱胁迫对小麦的生理生化化指标的影响
摘 要:研究干旱(干旱 5 天)胁迫对小麦生理生化指标脯氨酸(Pro)、丙二醛 (MDA)、 过氧化氢(H2O2)、 多酚氧化酶(PPO)、 过氧化物酶(POD)、 谷胱甘肽(GSH)、 可溶性糖(WSS)的含量的影响。结果表明干旱对这些生理生化指标的含量都有影 响,经干旱胁迫后 Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS 的

含量显著升高,且 Pro 和 PPO 的含量升高的幅度极显著。只有 POD 的含量经干旱胁迫后呈下降趋 势。从总体上看,经胁迫后的小麦抗逆性强于正常生长的小麦。 关键词: 关键词: 小麦、干旱、Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、POD 植物体生存在自然环境中, 由于自然环境是个变数, 其水热条件随时都变化, 对植物多少会产生一些影响。凡是对植物产生伤害的环境都被称为逆境,也称胁 迫。干旱也属于逆境,水分在植物的生命活动中占主导地位,大多数植物遭受干 旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。植物的生长主要是叶的生长, 但 Hsico 等(1987 年)指出,叶的扩展生长对缺水最为敏感, 轻微的胁迫就会使其受 到明显限制。扩展生长不论是细胞分裂分化或体积扩大,都同时依赖于水的吸收、 溶质的积累和胞壁的松驰。任何能直接或间接影响三者之一的因素均能影响生 长。当植物受到逆境胁迫时,会采取一定的措施来抵抗不良环境,比如生理生化 指标 Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、POD 等发生变化。 小麦是世界上仅次于玉米的第二大粮食作物, 也是我国北方主要的粮食作物 之一。世界上约有 70%的小麦播种面积分布在干 旱、半干旱农业区。其在生长 过程中,经常会受到干旱的影响,在世界范围内,由于水分所造成的减产,可能 要超过其他因素所导致的产量损失 总和。 干旱胁迫下小麦的生理生化特性差异 , 被认为是小麦抗旱性差异的内在原因。 本次实验是研究吸胀 12 小时萌发一周后, 这可以为抗旱研究作出一点贡 干旱处理 5 天的小麦其生理生化指标含量的变化, 献。 1 材料和方法 供应材料。 1.1 供应材料。 小麦种子;主要试剂:0.1% HgCl2 ,TTC,3%磺基水杨酸(SSA) ,冰乙酸, 茚三酮, PBS(pH=7.8) , 0.6%TBA 用 0.6% TCA 配制) PBS (pH=6.8, ( , 内含 1mMHA), 0.1%Ti(SO4)2 [用 20%(v/v) H2SO4 配制] ,PBS, (pH=5.8,内含 0.1mmol/ LEDTA, , 1%PVP) POD 反应混合液(10 mmol/L 愈创木酚,5 mmol/L H2O2,用 PBS 溶解) , PPO 反应混合液 20 mmol/L 邻苯二酚, PBS 溶解) ( 用 5%三氯乙酸, (pH=7.7) , PBS 4 mM DTNB (用 0.1M pH=6.8PBS 现配)。主要仪器:分光光度仪,离心机,试管, 微量加样器,研钵等。 材料处理。 1.2 材料处理。 经发芽率测定,小麦的发芽率是 100%。 小麦→ 用 0.1% HgCl2 消毒 10 min 后 → 用蒸馏水漂洗干净 → 用蒸馏水于 26℃下吸涨 12 h → 播于垫有 6 层湿润滤纸的带盖白磁盘(24cm×16cm)中 → 于 26℃下暗萌发 60 h →计算发芽率 → 选取长势一致的玉米幼苗做干旱、 高温、 盐渍或低温下处理(去除较矮或较高的玉米幼苗) 。

实验方法。 1.3 实验方法。 的提取步骤和结果 步骤和结果。 1.31 Pro 的提取步骤和结果。分别取 0.1 g 实验组(为干旱处理 5 天)和对 照组(不做干旱处理)的胚芽鞘置于研钵中,加入 3 mL 3%磺基水杨酸(SSA) 和少许石英砂充分研磨,再用 2 mL 3% SSA 洗研钵,置于离心机中,在 5000 rpm 下离心 10 min ,取上清液,定容至 5 mL。测定:取上清液各 2 mL ,分别加入 2 mL 冰乙酸和 2 mL 茚三酮试剂再煮沸 15 min,冷却后,5000 rpm 离心 10 min , 分别测定 A520 。

Pro content =

A520 V总 × V显 × ε × L ×W V用

(mmol.g-1FW)

表一 Pro 正常组和实验组 A520 的 Pro content

正常(对照组) Pro content 9.95(?mol.g FW)
-1

干旱胁迫(实验组) 97.69(?mol.g FW) 由图表可知,正常组
-1

的 Pro 汉两为 9.95(?mol.g FW),而干旱胁迫组的 Pro 含量为 97.69(?mol.g FW),后 者是前者的 9.8 倍。由此可见正常情况下脯氨酸的含量较小,一旦受到干旱胁迫,其含 量就会大幅度增加。 1.32 丙二醛(MDA)提取。分别取 0.1 g 实验组和对照组(与 1.32 做相同处理) 丙二醛(MDA)提取。

-1

-1

置于研钵中,加入 3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少许石英砂充分研磨,再用 2 mL PBS 洗研钵,置与离心机中,在 5000 rpm 下离心 10 min ,取上清液,定容至 5 mL。 测定:分别取上清液各 2 mL ,加入 0.6%TBA(用 0.6% TCA 配制) 2 mL,煮沸 12 min,冷却后,5000 rpm 离心 10 min ,分别测定 OD450 和 OD532。

WSS、 表二 正常组和实验组 A450、A532 下的 WSS、MDA 浓度
正常(对照组) 干旱胁迫(实验组)

可溶性糖(WSS) 丙二醛(MDA)

3.36 mmol/L 0.23823umol/L

16.80 mmol/L 1.04755umol/L

由图表可知,可溶性糖和丙二醛的浓度都是实验组大于对照组,实验组,即受干

旱胁迫组的可溶性糖的浓度是正常组的 5 倍,丙二醛浓度是正常组的 4.4 倍。可 知,干旱胁迫会使小麦麦芽鞘的可溶性糖和丙二醛的含量增加。 1.33 提取。 分别取 0.1g 实验组和对照组, 加入 3 mL 50 mM PBS (pH=6.8, 1.33 H2O2 提取。 内含 1mM HA)和少许石英砂充分研磨, 2 mL PBS 洗研钵, 用 5000 rpm 离心 10 min , 上清液定容至 5 mL。 测定: 分别取上清液各 3 mL →加入 0.1%Ti(SO4)2 [用 20%(v/v) H2SO4 配制] 1 mL, 摇匀→。5000 rpm 离心 10 min ,OD410。

H2O2 content =

A410 V总 × V显 × (?mol.g-1FW) ε × L ×W V用

表三 正常组和实验组 OD410 下的 H2O2 浓度
正常(对照组) 干旱胁迫(实验组) -1

H2O2 content

38.81(?mol.g

FW)

139.29(?mol.g

-1

FW)

由以上图表数据可得,干旱胁迫可使小麦胚芽鞘的 H2O2 含量升高,干旱组是正常 组的 3.5 倍。 1.34 抗氧化酶的提取。 1.34 抗氧化酶的提取。分别取 0.1 g 实验组和对照组(同 1.32 做相同处理) 置于研钵中,加入 3 mL 50 mM PBS (pH=6.8,内含 1mM HA)和少许石英砂,充分 研磨,再用 2 mL PBS 洗研钵,置于离心机中,在 5000 rpm 下离心 10 min ,取 上清液,定容至 5 mL。测定:POD 测定;取 POD 反应混合液(10 mmol/L 愈创 木酚,5 mmol/L H2O2,用 PBS 溶解)3.00 ml,加入酶液(提取液)100 ml(空白 调零用 PBS 取代) ,立即记时,摇匀,读出反应 3 min 时的 A470 。PPO 测定:取 PPO 反应混合液( 20 mmol/L 邻苯二酚,用 PBS 溶解)2.8 ml,加入酶液(提取 液) 0.2 ml (空白调零用 PBS 取代) 立即记时, , 摇匀, 读出反应 2 min 时的 A410 。
POD activities =

A470 V总 ×V显× ε ×W ×t V用

(?mol.g-1FWmin-1) ?

PPO activities =

A410 V总 × 0.01×W × t V用
正常(对照组)
-1

(U.g-1FW)

干旱胁迫(实验组)

POD(?mol.g FWmin ) ?
-1

24.27

14.21

PPO (U.g-1FW)

150

1950

上表中,过氧化物酶(POD)的含量正常组的是24.27(?mol.g-1FWmin-1) ,而实验组的
是14.21(?mol.g-1FWmin-1) , 后者是前者的0.59倍, 是所有测的数据中唯一正常组大于实验 组 的 。 多 酚 氧 化 酶 (PPO) 的 含 量 正 常 组 的 是 150 (U.g-1FW) , 而 实 验 组 的 是 1950(U.g-1FW),后者是前者的13倍,可知干旱胁迫会使小麦胚芽鞘的多酚氧化酶含量剧

增。 1.35 的提取。 1.35 GSH 的提取。分别取 0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘(同 1.32 做相同处 理)置于研钵中,加入 3 mL 5%三氯乙酸(TCA)和少许石英砂,充分研磨,用 2 mL 5% TCA 洗研钵置于离心机中,在 5000 rpm 下离心 10 min ,取上清液定容至 5 mL。测定:上清液各 1 mL , 分别加入 1 mL0.1M PBS (pH=7.7) 和 0.5 mL 4 mM DTNB (用 0.1M pH6.8PBS 现配,空白用此 PBS 代替),25 ℃5 min,分别测定 A412 。

A412 V总 × V显 × GSH content = ε × L ×W V用
正常(对照组)

(?mol.g-1FW)

干旱胁迫(实验组) -1

GSH content

1.22(?mol.g

FW)

3.86(?mol.g

-1

FW)

由图表可知,实验组GSH3.86(?mol.g

-1

FW)是正常组1.22(?mol.g-1FW)

的3.16倍,干旱胁迫会使胚芽鞘积累谷胱甘肽(GSH)。 2 讨论 本次试验我们的结果是, 干旱胁迫小麦胚芽鞘中的脯氨酸(Pro)含量比正常小 麦的多几倍,即干旱下小麦积累了脯氨酸(Pro)。已有很多试验证明了,干旱胁迫 会使脯氨酸含量增加。脯氨酸(Pro) 是水溶性最大的氨基酸,具有很强的水合 Pro) Pro 能力,其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合,亲水端可与 水分子结合,蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水,从而防止渗透胁迫条件下蛋白 质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用,而且即使在含水量 很低的细胞内,脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水,以维持正常的生命活动。正 常情况下,植物体内脯氨酸含量并不高,但遭受干旱等胁迫时体内的脯氨酸含量 明显增加。已有人证明了Pro的分解代谢开始于它的氧化分解,执行此功能的酶 称为Pro脱氢酶(PDH), 它以FAD为辅因子将Pro降解为P5C, 后者在P5C还原酶(P5CR) 的作用下又重新合成谷氨酸,完成Pro代谢的循环过程。所以,在Pro的降解过程 中,PDH是Pro降解的关键酶。在逆境胁迫过程中,PDH的活性往往受到不同程度 的限制,从而削弱了Pro的降解过程,因此越来越多的脯氨酸被积累。 两种抗氧化酶, 多酚氧化酶和过氧化物酶在干旱胁迫中表现出不同的变化情

况,多酚氧化酶的含量较正常组呈上升趋势,而过氧化物酶则呈下降趋势。过氧 化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化 酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶
体中,从而对细胞起保护作用。干旱锻炼提高小麦幼苗抗旱性的抗氧化机理研究中已 经指出,连续干旱锻炼的小麦幼苗体内的 POD 活性下降,羟自由基清除能力及总抗氧化力 降低,总体上表现为抗氧化系统受到抑制。高等植物组织发生褐变主要是 PPO 作用的结果, PPO 催化多酚氧化为醌,醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应,结果产生黑色素沉淀。 PPO 在植物中以潜伏 PPO 形式存在,与叶绿体膜紧密结合 潜伏形式的 通常在成熟、衰老 或胁迫条件下,由于膜受伤害而活化,并导致 PPO 活性增加。所以综上所述逆境胁迫下多

酚氧化酶的含量增加,而过氧化物酶则减少。 干旱, 小麦胚芽鞘中的可溶性糖(WSS)和脯氨酸(MDA)的含量都增加。 同样, 在《几种环境胁迫对小麦生理生化影响》一文中已经研究发现,干旱胁迫会使小 麦中WSS和MDA含量增加。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害,往往发生膜脂 过氧化作用,丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物,从膜上产生的位 置释放出后,与蛋白质、核酸起反应修饰其特征;使纤维素分子间的桥键松驰, 或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害,其含量的 多少代表膜损害程度。本次试验研究数据说明,干旱使小麦细胞膜系统受到一定 的损害。 H2O2在本次试验中的结果是,干旱组的含量更高些。过氧化氢酶大量分布 于动植物细胞内,属于活性氧清除剂,对H2O2和羟自由基有清除能力,是一种 细胞保护酶。大部分研究干旱胁迫对植物幼苗保护酶活性影响已经证明,在干旱 胁迫中植物体中的过氧化氢酶活性前期升高,但到后期呈下降趋势。这间接证明 干旱会是植物体积累过氧化氢。H2O2 过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物,其 H 积累对细胞具有氧化破坏作用,在实验中,可根据其值的变化,来了解组织的破 坏程度。因此,过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。
GSH 的 N 端肽链由谷氨酸的 γ 羧基和半胱氨酸的氨基构成, 这种特殊结构使得它在细 (Xiang 胞内稳定。 (徐大勇等,2001) ,只能被某些特定的存在于质膜外侧的 γ -GTP 清除。 等 2001) ,GSH 在细胞中分布并不均匀,如植物细胞 30%分布于细胞质(May 等,1998) , Bloch 等研究了 GSH 得生物合成,并证实了细胞内的 GSH 是由 γ 谷氨酸合成酶与 GSH 合 成酶在 ATP 存在下催化 L-谷氨酸、L-精氨酸和甘氨酸的反应合成的。GSH 作为生物体内最 主要的非蛋白巯基和含量最丰富的低分子量多肽,在植物抗逆中直接参与许多多功能活动, 例如(1)参与细胞内许多化合物、药物及激素代谢; (2)通过“ γ 谷氨酸循环”储存和运 输半胱氨酸,是半胱氨酸的储存库; (3)参与 DNA、RNA 和蛋白质等大分子的生物合成; (4)氧化还原的缓冲池; (5)是硫还原和运输形式之一,维持细胞内硫醇和二氧化硫的平 衡; (6)对内外源性毒物的解毒作用; (7)与其相关酶共同保护细胞质内的蛋白质、脂质等 结构成分不被氧化,清除自由基,在抗氧化胁迫中起重要作用; (8)可能是逆境条件下的信 号物质之一。例如当细胞内生成少量 H2O2 时,GSH 在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下,把 H2O2 还原成 H2O,其自身被氧化为 GSSG,GSSG 由存在于肝脏和红细胞中的谷胱甘肽还 原酶催作用下,接受 H 还原成 GSH,使体内自由基的清除反应能够持续进行。所以在干旱 胁迫中由于细胞被破坏并产生有毒物质 H2O2 等, 细胞机体就会合成大量的 GSH 保护

自身。

参考文献 [1]詹海仙 ,畅志坚 ,魏爱丽 ,张晓军,李 欣 干旱胁迫对小麦生理指标的影 响 (1.山西省农业科学院作物科学研究所,山西太原030032;2太原师范学院生 物系,山西太原030031) [2]王敏、张从宇、马同富、维传 植物生长调节剂对干旱胁迫下玉米幼苗生长的 影响(安徽技术师范学院,凤阳233100;阜阳市农业科学研究所) [3]王自霞, 周小梅,范玲娟 几种环境胁迫对小麦生理生化特性的影响(山西大 学生命科学与技术学院, 山西太原030006) [4]吴 林 李亚东 郝 瑞 刘洪章 文连奎 水分逆境对沙棘叶片脯氨酸、过氧化 酶、过氧化氢酶等的影响(吉林农业大学园艺系长春130118) [5]麦维军,王颖,张明永等 谷胱甘肽在植物抗逆中的作用(1.中国科学院华南 植物园2.中国科学院研究生院.北京200039) [6]李师翁、 薛林贵、 冯虎元、 徐世键、 安黎哲 植物中的H202信号及其功能 (1’ 兰州交通大学化学与生物工程学院,兰州 730070;2’兰州大学生命科学学院, 兰州 730000) [7]雷东锋 冯 怡 蒋大宗 植物中多酚氧化酶的特征 (西安交通大学生命科学与 技术学院,西安710049) [8]周青、黄晓华 逆境胁迫下作物积累脯氨酸的生理生态学意义 (安徽师范大 学生态研究室,芜湖24lOOO)


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