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Beer Fermentation


南京农业大学学报  2005, 28 ( 1 ) : 61 ~65  
Jou rna l of N an jing A g ricu ltu ra l U n iversity

低含量高级醇啤酒酵母菌株的选育
方维明
1, 2

, 汪志君 , 高庆 , 黄为一

2

/>2

( 1. 南京农业大学生命科学学院 , 江苏 南京 210095; 2. 扬州大学食品科学与工程学院 , 江苏 扬州 225009 )

摘要 : 以酵母高级醇和乳酸代谢理论为基础 , 建立了一套低含量高级醇和高活性的乳酸脱氢酶啤酒酵母菌株选育方法 。 将出发菌株诱变后 , 依次通过乳酸 、麦芽汁 碳酸钙和 TTC上层平板筛选 , 分离获得一株高级醇产量下降 2817%的目标 菌株 。用该菌株接种发酵后 , 啤酒中高级醇含量由原出发菌株的 9814 mg?L - 1下降到 7012 mg?L - 1 , 其发酵性能基本保 持不变 ; 经连续 8 次继代培养后 , 该菌株的高级醇 、双乙酰产量和啤酒发酵度保持不变 , 显示遗传性能稳定 。 关键词 : 啤酒酵母 ; 菌种选育 ; 乳酸脱氢酶 ; 高级醇 中图分类号 : TS26111     文献标识码 : A     文章编号 : 1000 2030 ( 2005 ) 01 0061 05
1, 2 2 2

Sc reening of Saccha rom yce s ce revisiae w ith low p roduc tio n of highe r a lcoho ls
(1. College of L ife Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;

2. College of Food Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China )

Ab s tra c t: Based on the metabolism of higher alcohols and lactic acid, a screening method was developed to obtain S accha rom yces
cerevisiae strains w ith low p roduction of higher alcohols and high activity of lactic acid dehydrogenase. By UV inducing of a w ild

tion of higher alcohols was obtained.
-1

啤酒风味是影响啤酒质量的重要因素 , 高级醇是啤酒的重要风味物质之一 。适宜的高级醇含量及各 种高级醇之间的比例可使酒体丰满圆润 , 口感柔和协调 ; 但高级醇含量过高时 , 不仅会给啤酒带来异杂 味 , 还会使消费者饮后头痛 、头晕 、发坠
[1]

多种措施 , 使优质啤酒中高级醇含量控制在 50 ~90 m g?L

发酵周期延长 ; 增加接种量使酵母制备周期延长 , 限制设备生产能力 ; 严格控氧则大大增加设备及运营 成本 , 这些问题特别在夏天旺季生产中更加突出 。降低啤酒中高级醇含量的首选措施是改良啤酒酵母的 特性 , 然而有关低含量高级醇酵母菌种选育方面的研究仅有一些思路
[ 3, 4 ]

酵母高级醇相关代谢途径为理论基础 , 建立了一套通过诱变及乳酸平板 、麦芽汁 碳酸钙平板 、 TTC 上 层平板显色法筛选分离低含量高级醇啤酒酵母的方法 , 旨在获得低产率高级醇的啤酒酵母菌株 。

with its value from 9814 mg?L

changed. The p roduction of higher alcohols and diacetyl, and fer mentation degree of this induced strain remained stable after eight generation, suggesting its genetic stability . Ke y wo rd s: S accha rom yces cerevisiae; screening; lactic acid dehydrogenase (LDH ) ; higher alcohols

1  材料与方法

   收稿日期 : 2004 07 15

   基金项目 : 江苏省科技攻关项目 (BE2001397) ; 江苏省农业推广项目 (BC2002305) 究 , Tel: 025 84395213。

3    作者简介 : 方维明 ( 1965 ) , 博士研究生 。 通讯作者 Corresponding author: 黄为一 ( 1942 ) , 教授 , 从事微生物发酵和酶工程研

1 11   菌种

strain and followed by petri2dish screening on lactic acid, wort2 CaCO3 and TCC, a S accha rom yces cerevisiae strain with low p roduc2

啤酒酵母 ( S accha rom yces cerevisiae) YZD , 由扬州大学食品科学与工程学院食品科学系保藏 。

FANG W ei2 ing , WANG Zhi2jun , GAO Q ing , HUANG W ei2yi m
of its wild strain to 7012 mg?L
-1

The p roduction of higher alcohols of beer from this induced strain was reduced by 2817% ,

。生产中常采取低温发酵 、增加接种量 、严格控制供氧等
- 1[ 2 ]

, while the fermentation characteristics remained relatively un2

。但是低温发酵会使双乙酰的还原减慢 ,

13

, 尚未见研究报道 。本研究以

13

南 京 农 业 大 学 学 报 第 ?62?                                             28 卷

麦芽汁培养基 (MM ) : 青岛啤酒 (扬州 ) 有限公司提供麦芽汁 , 稀释至 8 ~10 ° pH 自然 。酵母 P, - 1 完全培养基 ( CM , g ?L ) : 蛋白胨 20, 酵母膏 10, 葡萄糖 20, pH 610。乳酸培养基 ( LM , g ? - 1 L ) : 乳酸 40, 硫酸铵 5, 磷酸二氢钾 1, 氯化钠 011, 硫酸镁 015, 氯化钙 011, 酵母膏 012, pH 610。 - 1 上述培养基加琼脂 20 g?L 成为固体培养基 , 011 M Pa 灭菌 20 m in。麦芽汁 碳酸钙培养基 (MCM ) :
- 1 - 1 在 MM 固体培养基中加入干热灭菌后的碳酸钙 115 g ?L 。 TTC 上层培养基 ( TTC, g ?L ) : TTC - 1 015, 乳酸 5, 琼脂 15, pH 610。发酵培养基 ( FM ) : 12 ° 麦芽汁 (α2 为 161 ~180 mg?L ) , pH P AN

自然 , 0109 M Pa 灭菌 20 m in。 1 13   实验方法 1 13 11   酵母菌悬液的制备   将啤酒酵母接种于 MM 斜面 , 25 ℃ 培养 36 ~48 h 使其活化 , 接一环于 20 - 1 - 1 mL MM 中 , 20 ℃、 120 r?m in 振荡过夜 ; 取 011 mL 接入另一 20 mL MM 中 , 20 ℃、 120 r?m in 振 - 1 荡培养至 600 nm 处吸光值 (A600 ) 约为 017 (以空白培养基作参照 ) 时 , 4 000 r?m in 离心 10 m in 收 集酵母菌体 , 用适量无菌生理盐水洗涤 2 次 , 再悬浮于 10 mL 无菌生理盐水中 , 10 倍系列逐级稀释并 6 - 1 计数 , 取浓度约为 10 mL 备用 。 1 13 12   诱变与筛选   10 mL 酵母菌悬液于 90 mm 无菌培养皿中 , 用 15 W 紫外灯进行诱变处理 , 照 取 射距离 25 cm。采用不同的照射处理时间 , 用平板菌落计数法计算酵母致死率 。 初筛 : 将诱变处理过的酵母细胞均匀涂布在 LM 上 , 置黑暗处 25 ℃ 培养 3 ~5 d。挑选生长菌落较 对照 。试验重复 3 次 , 统计分析采用 t检验法 。 1 14   分析方法 高级醇 、双乙酰含量采用蒸馏分光光度法测定 ; 外观浓度 、酒精度 、外观发酵度 、实际发酵度 [ 5, 6 ] 等采用啤酒分析常规方法测定 ; 乳酸含量采用改良的对羟基联苯法测定 ; 乳酸脱氢酶活性采用紫外 分光光度法测定 。    由图 1 可看出 , 在 0 ~30 s照射时间里 , 酵母致 死率呈直线上升 ; 30 ~ 40 s 时 , 致死率达到 95% ~
99% , 40 s后致死率近似 100% 。因此 , 选择 40 s为

大 、菌层较厚的菌株约 40 ~50 株转接于 MCM 上于 25 ℃ 培养 3 d, 菌落影印到 LM 上 , 25 ℃ 培养 3 d。 菌落长成后加入 TTC 暗培养 2 ~3 h, 挑选出在 MCM 上生长较好 、中央隆起较突出 、溶钙圈较适中 、乳 酸培养基上红色较深的菌株 。 复筛 : 用 FM 200 mL 在 10 ~12 ℃ 培养 5 ~6 d 后复筛初选菌株 。以原始出发株为对照 , 分别测定高 级醇和乳酸含量 , 选择高级醇含量低 、乳酸含量高的菌株 。
1 13 13   发酵性能测定   复筛所得菌株在 500 mL FM 中 10 ~12 ℃ 主发酵 6 d, 8 ℃ 后发酵及低温贮藏

诱变处理时间 。 2 12   目标菌株的初筛 将诱变后的菌株在以乳酸为惟一碳源的 LM 上进 行初筛 。由图 2 可见 , 在 LM 上菌落大小不等 , 其中 少数菌落较大 。由于菌落大的菌株利用乳酸原料的关 键酶活性较高 , 即菌株具有较高的乳酸脱氢酶活性的

可能性较大 , 而乳酸脱氢酶是酵母高级醇及双乙酰代谢的关键酶 , 为此本研究挑选菌落较大的菌株 。 将挑选的菌株在 MCM 上进行培养 , 由图 3 可见 , 诱变菌株在 MCM 上生长的菌落大小及溶钙圈也 有差异 。菌落小的菌株溶钙圈小 , 生长活力低 ; 菌落大小和溶钙圈均为适中的菌株 , 生长活力居中 , 发

1 12   培养基

2 11   诱变处理时间的确定

18 ~25 d, 测定高级醇和双乙酰含量 , 同时检测外观浓度 、α2 基氮 、乳酸等指标 , 以出发菌株做平行 氨
[5]

2  结果与分析

图 1  不同处理时间对致死率的影响

F ig1 1  Effe c t o f induc tio n ti e o n fa ta lity ra te m   

第 1 期              方维明等 : 低含量高级醇啤酒酵母菌株的选育

?6 3 ?

酵平稳 , 产酸性能也较为适中 。 在乳酸培养基上加 TTC 进行显色 , 由图 4 可见 , 诱变菌株红色深浅不同 。由于酵母产酒精能力越 强 , 显现的红色越深 , 因此对照图 3 挑选出 25 株红色相对较深的菌株进行复筛
[7]



  2  诱变处理后酵母在乳酸平板 图 上的生长情况   
F ig1 2   G row th o f S 1 ce re vis ia e tre a 2 te d by UV o n LM p la te
pH 0105 level The same as follows . .
-1

  3  图 突变株在 MCM 平板上的生长 情况
F ig1 3   G row th o f m u ta n ts o n MCM p la te
菌种 Strains
Y0402 4142 Y0403 4140 Y0404 4133

图 4  TTC 显色后照片
F ig1 4  Co l r re a c tio n o n TTC p la te o
CK Y0705 4139 Y1105 4134 Y1110 4139 13412 c 4516 c Y1105 8816 b 7515 b 6019 ab 01112 b 13315 c 4716 b Y1110 6714 d 7518 b 6111 a 01093 c 4515 c CK 9214 a 7618 a 6114 a 01099 c 4135

经初筛得到的菌株 (除 Y0404 外 ) 发酵 5 d 后 , 发酵液中高级醇含量比对照都有不同程度下降 , 幅 度为 018% ~1312% ; 而乳酸含量均有提高 , 幅度为 1013% ~2118% (表 1 ) 。本研究选择高级醇含量 低而乳酸含量高的菌株 ( Y0401, Y0402, Y0403, Y0705, Y1105, Y1110 ) 进行下一步筛选 。
表 1  复筛中菌株高级醇和乳酸的含量
高级醇含量 /mg?L - 1 H igher alcohols 乳酸含量 /μg?mL - 1 Lactic acid

将复筛挑选出的菌株进行啤酒发酵试验 。结果表明 , Y1110 菌株的高级醇含量低于其余菌株和 CK, 而实际发酵度与对照接近 (表 2 ) , 为此选择 Y1110 菌株为目标菌株 。
表 2  筛选菌株的啤酒发酵试验结果
Ta b le 2  The te s t o f s tra in s in be e r fe rm e n ta tio n
菌种 Strains

高级醇含量 /mg?L - 1 H igher alcohols 双乙酰含量 /mg?L
D iacetyl

外观发酵度 / % Apparent fermentation degree 实际发酵度 / % Real fermentation degree

由表 3 可知 , 菌株 Y1110 在发酵过程中 , 与对照相比高级醇含量显著降低 ( P < 0105 ) ; 由外观浓 度可见 , 对照菌株开始利用糖类较快 , 到后期两者基本一致 ; 而对 α2 基氮的利用 , 两者基本一致 。 氨 说明对照菌株发酵开始生长较为旺盛 , 因而高级醇 、双乙酰产量较高 ; 后期 Y1110 菌株活性较强 , 其

   : 与对照相比 , 不同小写字母表示差异显著 ( P < 0105) 。 Compared with control, the different small letters show significant difference at 注

2 13   目标菌株的复筛 2 14   目标菌株的终筛

2 15   目标菌株与原出发菌株发酵性能及乳酸脱氢酶 (LDH ) 活性的比较

Ta b le 1  The co n te n t o f h ighe r a lco ho ls a nd la c tic a c id o f s tra in s in re 2sc re e n ing
Y0401 4139 Y0703 4138 13118 cd 4614 bc Y0401 8312 c 7616 a 6016 b 01190 a 13015 d 4217 d Y0402 8114 c 7511 bc 6016 b 14210 b 01173 a 4414 cd 15611 a Y0403 9116 a 7613 a 6113 a 5212 a 01160 a 12816 de Y0705 8816 b 7419 c 6015 b 4818 b 01141 ab

13411 c 11616 f

4912 b

南 京 农 业 大 学 学 报 第 ?64?                                             28 卷

开始积累的高级醇较少 , 后期还原能力也较好 , 双乙酰降低 。与对照相比 , Y1110 菌株乳酸脱氢酶活性 在发酵开始后上升较快 , 特别在发酵第 3、第 4 两天差异显著 ( P < 0105 ) , 因而形成的乳酸含量也较 多 , 两菌株间差异显著 。乳酸和高级醇的胞内合成都需要还原性辅酶 ( NADH ) , 对同一原料的竞争导 致酵母中高级醇的合成下降 。
表 3  目标菌株 Y1110 与出发菌株 ( C K) 发酵性能比较
外观浓度 / % Apparent content
CK 9192 7158 6152 5143 4123 3155 2169 10120 6157 5116 4123 2179

Ta b le 3  The com p a riso n o f Y1110 s tra in a nd C K in be e r fe r e n ta tio n m
双乙酰 /mg?L - 1
D iacetyl CK

发酵时间 / d
Tim e 1 2 3 4 5 6

高级醇 /mg?L - 1
H igher alcohols CK

α2 基氮 /mg?L - 1 氨 α2 AN
CK Y1110 14918 13514 11317 10514 9613 8511 7816 14617 12319 10918 10012 8417 7719 7417

LDH /U ?g - 1 FW

乳酸 /mg?L - 1
Lactic acid CK -

Y1110
3 3

Y1110 0139 1123 1104 0109

Y1110

CK -

Y1110 1910 2412 1616 813 016

Y1110 7919

30

将 Y1110 和对照菌株同时进行啤酒酿造试 Ta b le 4  Com p a riso n o f be e r qua lity be tw e e n Y1110 a nd C K 啤酒指标 Beer quality CK Y1110 验 。表 4 结果显示 , 诱变菌株发酵得到的啤酒高 pH 4155 4161 级醇显著降低 ( P < 0105 ) , 双乙酰也有所降低 。 α2 基氮 /mg?L - 1 α2 7618 7813 氨 AN 而发酵度 、酒精度等其他指标及风味 、口感基本 01102 01095 双乙酰 /mg?L - 1 D iacetyl 不变 。 -1 3 将菌株 Y1110 在 MM 斜面上连续接种培养 8 代后 , 进行发酵性能测定 。表 5 结果显示 , 传代 前 、后菌株的主要酿造性能基本上没有变化 , 无 显著差异 ; 而两者与对照均有显著差异 ( P < 0105 ) 。因此 , 所获得的菌株 Y1110 遗传稳定性 较好 。
高级醇 /mg?L - 1
H igher alcohols 6816 b 7015 b 9513 a Y1110 传代前 Before germ ination Y1110 传 8 代后 After 8 germ ination CK

分析表明两者之间存在一定的因果关系 。啤酒酵母细胞中高级醇有两条形成途径 : 合成途径和分解 途径 。合成途径是在葡萄糖经 EM P、 TCA 等合成氨基酸的途径中 , 中间体 α2 酸经进一步还原得到相 酮 应的高级醇 ; 分解途径是由氨基酸脱氨分解产生高级醇 。大部分低碳链高级醇是通过合成代谢途径产生 的 , 高级醇中 75%的异戊醇 、异丁醇和活性戊醇是由糖形成的 。乳酸脱氢酶是酵母细胞内催化丙酮酸 向乳酸转化的酶 , 反应是可逆的 , 需要丙酮酸和还原性辅酶 。在高级醇的糖源合成途径中 , 也需要经过 丙酮酸进一步合成高级酮酸 , 由还原性辅酶得到高级醇 。有些物质对酵母的呼吸及 NADH 氧化酶活性

   : 表示 Y1110 菌株与 CK比较差异显著 ( t检验 , P < 0105) 。 Compare with CK, 注

2 1 6  Y1110 与对照菌株啤酒质量比较 2 17   筛选菌株的稳定性试验

3    讨 论

3

本研究中 , 目标菌株高级醇的产率低于对照 , 而主发酵期乳酸脱氢酶活性和乳酸产率均高于对照 ,
[ 8, 9 ]

101130

39151 46154 56148 62173 86154 88106

24144 54154 67140

32181 3 42198 3 66179 3 70120 3

Ta b le 5  Com p a riso n o f fe rm e n ta tio n s ta b ility be t e e n Y1110 a nd C K w
双乙酰 /mg?L - 1
D iacetyl 01091 01094 01103

0146 1104 1156 1163 1186 1144 0110

0173 3 0184 3 1125 3
3 3

表 5  菌株啤酒发酵稳定性比较

9102 3 7158 3
3

表 4  Y1110 与对照菌株的啤酒质量指标比较

高级醇 /mg?L

H igher alcohols

酒精度 / % A lcohols content 实际浓度 / % Real content

外观浓度 / % Apparent content

外观发酵度 / % Apparent fermentation degree 实际发酵度 / % Real fermentation degree

3

P < 0105.

2110 2815 1711 1615 911 015

The same as follows .

Apparent fermentation degree 7517 7514 7519

3012 3
3

外观发酵度 / %

8018 8710 9411 8517 8516 8118

9814 7618 6116

3167 2178 4152

10814 3 13617 3 10313 3 7014 7612 6112 9811 3 8610 3 3161 2166 4146

第 1 期              方维明等 : 低含量高级醇啤酒酵母菌株的选育
[ 10 ]

?6 5 ?

有抑制作用 , 如二硫氰基甲烷 , 可能会影响高级醇的形成 。在啤酒发酵的主酵期 , 酵母生长旺盛 , 对糖的利用快 , 细胞内丙酮酸和还原性辅酶充足 , 促使高级酮酸形成并进一步被还原成为高级醇 ; 目标 菌株乳酸脱氢酶活性显著增加 , 丙酮酸向乳酸转变 , 使乳酸积累增加 , 消耗丙酮酸和还原性辅酶 , 造成 高级醇的合成量下降 , 这与本研究中表 3 的结果一致 。主酵期后乳酸脱氢酶活性恢复到与对照相同 , 由 于反应的可逆性 , 乳酸的含量也随后恢复到与对照相同 ; 但高级醇的合成反应是不可逆的 , 而且主要在 主酵期形成 , 继续保持比对照低的水平 。因此选育乳酸脱氢酶增加的菌株 , 来获得低含量高级醇啤酒酵 母的方法从理论上是可行的 。 在目标菌株的筛选中 , 可靠灵敏的筛选系统是该方法的关键 。本研究第一步采用以乳酸为惟一碳源 的培养基筛选 , 可获得乳酸脱氢酶活性较高的菌株 ; 其次 , 采用麦芽汁 碳酸钙平板筛选 , 通过溶钙圈 的大小反映菌株的产酸性能 , 以保持啤酒风味不变 ; 再用 TTC 检验菌株的发酵性能 , 受氢体 TTC 被醇 脱氢酶还原后呈红色 , 反映酵母菌株产酒精能力的大小 , 可使菌株的发酵能力保持不变 。由此系统获得 的目标菌株 Y1110, 其高级醇比对照 YZD 降低近 2817% , 而其他发酵性能基本不变 。 本研究以酵母的代谢理论为基础 , 结合高级醇代谢和乳酸代谢 , 建立了一套高级醇含量低的目标菌 株的育种方法 。该方法简单 , 可操作性强 , 因果关联性显著 , 对啤酒酵母的选育具有理论指导意义和实 际应用价值 。
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Involvement of nitrogen metabolis in the triggering of ethanol fer m mentation in aerobic chemostat cultures of S accha rom y2 Food Chem istry, 2002,

责任编辑 : 夏爱红


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