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中华鳖线粒体遗传变异的细胞色素b序列分析


广东农业科学

2011 年第 2 期

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中华鳖线粒体遗传变异的细胞色素 b 序列分析
余帆洋,章 群,唐优良 周佳怡
(暨南大学水生生物研究所,广东 广州 510632 ) 摘 要: 测定 并分析 了 长 江 水 系 14 尾 中 华 鳖 (Pelodiscus sinensis) 的 线 粒

体 细 胞 色 素 b 基 因 1 140 bp 序 列 ,结 合 GenBank 中 下 载 的 3 个序 列,发 现了 243 个变 异 位 点 ,61 个 简 约 信 息 位 点 ;A+T 含 量 (60.6%) 明 显 高 于 G+C 含 量 (39.4%) ;17 个 中 华 鳖 序 列 中 共 存 在 10 个 单 倍 型,单倍型多样性 (Hd) 为 0.882 ,核苷酸多态性 (Pi) 为 0.01002 。 在分子系统树上,17 个样本共 形成 3 个谱 系,其中 长江 中下 游出 现遗传 距离 为 0.023 的 2 个谱系,谱系 A 由 7 个单倍型(共 14 尾)组成,谱系 C 由 2 个单倍型(共 2 尾)组成。 韩国 1 尾单独为谱系 B ,与 A 、C 谱系之间 的遗传距离分别为 0.030 、0.031 。 推测 3 个谱系间分化时间约为 5 百万年,建议分别加以保护。 长江中下游不同地理来源的个体混杂分布, 没有形成明显的地理聚群,不同群体间的遗传变异大于群体内的遗传变异。 中性检测 Tajima ’s D 和 Fu ’s Fs 均为显著负值,核苷酸不对称 分布分析呈多峰型,表明中华鳖未经历过种群扩张。 关键词: 中华鳖;细胞色素 b ;遗传变异 中图分类号:Q173 文献标识码:A
文章编号:1004-874X (2011 )02-0005-03

Preliminary study on genetic variation of mitochondrial DNA cytochrome b gene of Pelodiscus sinensis
YU Fan-yang ,ZHANG Qun, TANG You-liang ,ZHOU Jia-yi
(Institute of hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China )

Abstract: Sequences of Complete mitochondrial DNA Cytochrome b gene of Pelodiscus sinensis in Yangtze River were sequenced and analyzed in present study. Combined with homologous sequences downloaded from GenBank, 243 variable sites and 61 parsimony-informatic sites were found in the 1 140 bp sequences, and A+T content (60.6%) were more higher than G+C content (39.4%). Totally there existed 10 haplotypes of 17 samples in Yangtze River, and haplotype diversity (Hd) was 0.882, nucleotide polymorphism (Pi) was 0.01002. In the Neighbor-joining tree 3 lineages were recovered, of which genetic distance between linage A composed of 7 haplotypes from 14 individuals and linage C contained 2 haplotyes from 2 individuals found in the Yangtze River were 0.023, and Lineage C represented by single turtle were from South Korea. and the genetic distance to the two lineages in Yangtze River were 0.030 and 0.031 respectively. The divergence among the three lineages was dated back to about 5 MY. The 3 Evolutionarily Significant Units (ESUs) recognized in present study should be protected respectively.Individuals from different locality in the Yangtze River were interwined without obvious genealogical nor geographic clusters, and genetic variation among different groups is greater than those within populations. The negative and highly significant values in the Fu ’S Fs tests and Tajima ’s D tests of the whole population and multiple peaks appeared in the mismatch distributions indicated that Pelodiscus sinensis have not experienced a population expansion. Key words: Pelodiscus sinensis; Cytochrome b ;Genetic variation

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属爬行纲(Reptilia)龟鳖目 (Testudinata)鳖科(Trionychidae)鳖属,俗名鳖、甲鱼、元鱼、王 八、团鱼、脚鱼、水鱼等,广泛分布于除宁夏、新疆、青海和西 藏外的我国大部分地区, 尤以长江流域和华南地区产量较 高;在日本、朝鲜、越南等地也有分布[1]。 中华鳖肉味鲜美,营 养丰富,蛋白质含量高,是一种经济价值和药用价值很高的 水生动物,也是我国重要的出口创汇水产品。 目前,全国各 地广泛开展人工养殖,然而相互引种、不注重培育品种等因 素严重危害了中华鳖的种质资源。 近年来,由于过度捕捞和 环境污染,野生中华鳖数量急剧下降。 龟鳖类动物是一支古 老和特化的爬行动物[2],在脊椎动物的系统演化中有承前启 后的重要地位,关于它们的系统进化一直存在很多争论。 在 生物学理论研究方面,其研究较多地集中在形态、区系分类、 生态和繁殖、发育等方面,其他学科的研究还较少[3-4]。 遗传多 样性是生物进化和适应环境变异的物质基础, 有助于我们 了解物种的进化历史和种群恢复潜力。 研究中华鳖的遗传 变异,加强种质资源的管理保护与开发利用,从而制定有针
收稿日期:2010-09-13 基金 项目 :国家 自 然科 学基 金 (41071034) ;留学 归 国 人 员 科 研 启 动基金 (2005) ;暨南大学科研培育与创新基金(21609710 ) 作者简介:余帆洋(1986-),男,在读硕士生,E-mail:yufy600@163.

对性的保护措施和开发利用策略,已刻不容缓。 线粒体 DNA (mitochondrial DNA,mtDNA) 具有结构稳 定、进化速度快和母系遗传等特征,是研究动物遗传变异的 理想分子标记[5],其中线粒体细胞色素 b 基因(cytochrome b, Cytb)进化速度适中,能较好地检测种内或种间的遗传分化[6]。 目前国内外采用不同分子标记对龟鳖类遗传变异的研究已 开展了部分工作 [7-11],陈合格等 [12]对中华鳖、砂鳖和山瑞鳖 3 种鳖线粒体 DNA 细胞色素 b 基因序列进行了比较分析;张 永正等[13]利用线粒体细胞色素 b 基因序列对中华鳖 5 个不 同地理种群(太湖群体、日本群体、江西群体、台湾群体和乌 鳖群体)的种群遗传结构进行了研究;刘至治等[14]利用 RAPD 分析了中华鳖 5 群体遗传变异情况;张海琪等[15]对中华鳖太 湖养殖种群和日本引进种群共 38 个个体的线粒体 DNA 细 胞色素 b 基因中间部分序列进行了测定。但目前尚未有分析 中国长江中下游中华鳖种群遗传结构和种群历史动态的报 道。 本研究测定了近年来采自长江中下游的 14 尾中华鳖 Cytb 基因序列,并对其遗传变异、种群动态等进行探讨,以 期为中华鳖种质资源的管理和保护提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供 试 样 本 为 2008 年 10~11 月 采 集 的 中 华 鳖 ,95% 乙 醇保存待用,分别为湖北梁子湖 6 只、安徽池州 4 只、江西

com
通 讯 作 者 :章群(1968- ),男,博士,副教授, E-mail:tqzhang@jnu.

edu.cn

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彭泽太泊湖 2 只、江苏苏州光福镇 1 只,采样地点见图 1 。

图 1 长江流域水系简图及采样地点分布

分支上数字为 Bootstrap 值 图 2 基于中华鳖 cytb 基因序列构建的 NJ 树

1.2 试验方法 1.2.1 DNA 提取、PCR 扩增与测序 DNA 提 取 、PCR 扩 增条件参见陈艺燕等 [16];PCR 和测序引物为 CytbF: CCHR TGATTYGAAAAACCACCGTTGT CytbR: TGGTTTACAAG ACCAATGC 。 PCR 产物检测合格后送至北京六合华大基
因科技有限公司测序。 1.2.2 数据处理 于 Genbank 下载 3 条中华鳖序列, 登录 号 分 别 为 AY962573 (韩 国 ),AY583692 (湖 南 ),AY259553 (上海)。 将测定的序列经人工校对后,使用 ClustalX1.83 进 行序列比对。 通过用 MEGA4.0 软件计算碱基组成、变异位 点、简约信息位点、转换/颠换值。 采用 Kimura 2-parameter 模型计算遗传距离,并用 Dnasp5 软件分析单倍型数, 核苷 酸多态性(π)和单倍型多样性(H)。 用 MEGA4.0 软件构建邻 接 (Neighbor-Joining,NJ) 树,以自展检测(bootstrap)1 000 次 计算各分支的支持率。 以 Arlequin 3.11 软件计算 Tajima’ s D 和 Fu’s FS 值,并进行核苷酸不对称分布分析[17]。

地理来源的个体混杂分布,没有形成明显的地理结构。

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结论与讨论

3.1 中华鳖的遗传分化
李思发等 [21] 对我国华东地 区 中 华 鳖 3 个 地 方 群 体 的 线 粒 体 DNA(mtDNA) 的 细 胞 色 素 b 基 因 进 行 了 分 析 , 发 现基因型多样性和核苷酸序列多样性指数分别为 0.6879±0.0978 、0.0266±0.0978 。这与本研究得出的单倍型 多样性 (Hd) 为 0.882 ,核苷酸多态性 (Pi) 为 0.01002 结 论 一 致。 本研究通过对中华鳖线粒体遗传变异的细胞色素 b 序 列分析, 表明长江流域的中华鳖不同地理群体没有明显的 遗传分化, 其原因一方面可能是长江中下游地区不存在可 以阻止中华鳖种群之间基因交流的天然地理屏障; 另一方 面, 大规模的人工养殖及相互引种人为地加大不同地区之 间频繁的基因交流。然而,虽无明显的地理结构,中华鳖群体 却形成 3 个明显的谱系,其中长江中下游 2 个,韩国个体独 成 1 支。 长江中下游群体分为 2 个分支,这种谱系分支现象 在其他动物如各种鱼类的线粒体遗传变异研究中也很常 见,如王伟伟等[22]对我国斑鳜 6 个群体 mtDNA Cyt b 序列的 遗传变异研究发现,长江水系斑鳜群体也是分为 2 个分支。 韩国个体与长江中下游一个分支的亲缘关系相比长江中下 游两分支之间的亲缘关系更为接近, 可能是由于古长江并 非贯通而是有隔离的分为若干江段; 自新第三纪开始至早 更新世早期,因青藏高原隆升、西太平洋边缘海张裂和中国 东部持续沉降,长江才逐步贯连东去入海;而且中、下游贯通 时间通常被认为发生在上游水系贯穿三峡之前[23-25],当海平 面下降时,长江下游中华鳖群体同韩国群体可能会有交流。 根据 20 世纪 90 年代人们在 DNA 序列水平对龟鳖目 的 一 些 系 统 学 研 究 [26-30],由 于 龟 鳖 类 世 代 长 且 代 谢 率 低 , 其线粒体 DNA 的进化速率较其他高等脊椎动物每百万年 进化 2% 的进化速率约慢 2~14 倍,平均慢 8 倍 [31]。 因此,我 们可以大致用 0.25% 每百万年作为中 华 鳖 核 苷 酸 分 歧 速 率。 根据 MEGA 软件中的分子钟测定,我们推测长江中下 游的 3 个分支分化时间约为 500 万年,这一时间段处于地 质历史时期晚更新世末期。导致 3 个分支产生分化的原因 可能是晚更新世冰期气候的剧变, 导致了中华 鳖群体隔 离;冰期后重新扩散,形成现在的遗传格局。中性检测也说 明各中华鳖群体未经历过种群数量的急剧变化,因此冰期 的隔离与冰后期的二次接触也可能是现在中华鳖遗传多 样性较高的主要原因。

2 结果与分析
2.1 序列特征和遗传多样性
研究结果表明,本研究测定的 14 尾中华鳖 Cytb 基因 序列比对长度为 1 140 bp ,发现变异位点 243 个,简约信 息 位 点 61 个 。 碱 基 T 、C 、A 、G 的 含 量 分 别 为 27.4% 、 28.6% 、33.2% 、10.8% ;A+T 含 量 (60.6%) 明 显 高 于 G+C 含 量 (39.4%) ,符合脊椎动物线粒体 DNA 的特点 [18]。 密码子第 1 位 核 苷 酸 中 A 使 用 率 高 (31.7% ),G 的 使 用 率 低 (18.1% );第 2 位核苷酸密码子中 T 的使用率高 (41.3%) ,G 的使用率低 (12.4%) ;密码子第 3 位 C 和 A 的使用率高 ( 分 别为 32.8% 和 41.5%) ,而 G 使用率则仅为 2.1% ,表现出明 显的反 G 偏倚,比鱼类、哺乳动物 [19]等 cytb 基因中 G 含量 更低。 转换数为 29 ,颠换数为 8 ,转换 / 颠换为 3.6>2 ,表明 Cytb 基 因 的 进 化 尚 未 达 到 饱 和 , 适 合 进 行 系 统 发 育 分 析 [20]。 在所测定的 14 个样品的序列与 Genbank 下载的 3 条中华鳖的序列中, 共发现 10 个单倍型, 单倍型多样性 (Hd)为 0.882 ,核苷酸多态性 (Pi)为 0.01002 。 2.2 遗传分化和系统发育 以 砂 鳖 (Trionyx axenaria) 为 外 类 群 ,构 建 邻 接 (NJ )树 见图 2 。 从图 2 可以看出,17 个中华鳖个体共形成 3 个明 显不同的谱系,其中长江中下游共形成 2 个谱系分支(谱 系 A 、谱 系 C ),其遗传距离为 0.023 ;谱系 A 由 7 个 单 倍 型 (共 14 尾 )组 成 ;谱 系 C 由 2 个 单 倍 型 (共 2 尾 )组 成 。 韩国 1 尾单独为谱系 B ,与长江中下游 2 谱系分支之间的 遗传距离分别为 0.030 、0.031 。 从谱系 A 中可以看出,不同

7
3.2 中华鳖的种群动态 将 长 江 中 下 游 14 尾 中 华 鳖 作 为 一 个 整 体 , 利 用 Tajima ’s D 和 Fu’sFs 中 性 检 验 以 及 核 苷 酸 不 对 称 分 布 (mismatch dis-tribution) 分析种群历史动态。 Tajima ’s D= -1.18820 和 Fu’s Fs=-1.003 (P=0.000) 均为负值且显著偏
离中性,表明中华鳖未曾经历过快速扩张。 核苷酸不配对 分布呈多峰型 ( 图 3) ,与群体扩张模型下的预期分 布 有 差 异,同样说明中华鳖种群未经历过种群扩张。
0.3 0.2 0.1 0 Exp Obs
数值

0

5

10

15

20

图3

不配对分布 中华鳖 Cytb 基因序列核苷酸不配对分布

3.3 中华鳖的管理和保护
要开展对物种的保护, 前提是确定进化显著单位 (Evolutionarily Significant Units ,ESUs) 和 管 理 单 位 (Management Units ,MUs) 。 在邻接树中,中华鳖聚类为 3 个 单系分支,表明存在 3 个进化显 著 单 位 ,因 而 需 要 对 此 3 个谱系分别加以保护。由于本研究所涉及的地理群体和研 究样品较少, 而中华鳖的遗传分化情况可能较为复杂,上 述研究结果并不排除在其他未取样地区存在不同谱系的 可能性,因此需要进一步扩大采样范围,并结合核基因等 多种分子标记来分析研究中华鳖的遗传变异,从而为中华 鳖物种的保护和开发利用提供更科学的依据。
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