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Trizol-A+试剂法提取百合总RNA


江苏农业科学2009年第2期

一35一

%zol—A+试剂法提取百合总RNA
张君堂L2,陶承光2,王志刚2,李雨2,张惠华2,李丹2.
(1.沈阳农业大学园艺学院,辽宁沈阳llOl6l;2.辽宁省农业科学院花卉研究所.辽宁沈阳110161)

摘要:本研究采用Trizol—A+试剂法,以东方百合

品种蛐仰e为试材,比较了不同试剂用量和百合不同器官总
RNA提取的效果。结果表明,0.8 ml的试剂用量比较适宜,而叶片和花药中提取到的总RNA在电泳时条带完整,亮 度较高,适于进一步的分子生物学研究。

关键词:百合;RNA;%甜一A+法;试剂用量;器官
中图分类号:S酪2.2+9 文献标志码:A 文章编号:1002一1302(2009 J02—0035—02
1.3

高质量、高纯度RNA的制备是cDNA克隆及其后续研究 的重要环节之一。目前提取植物总RNA最常用的有异硫氰 酸法¨1、SDS法【2 J、CTAB法旧。1和Tri∞l法怕1。Trizol是以异 硫氰酸胍和酚配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,

RNA提取方法 (1)取百合新鲜叶片或其他部位材料在液氮中迅速充分

研磨,研磨不超过l min。研钵、研锤和离心管预冷,用离心管 盖取l管盖研磨粉末(O.07 g左右),迅速加O.8“Trizol— A+试剂(设O.6、O.8、l 完全分离。 (2)4℃下12
000 ml

%蒯一A+是在%zol基础上发展出来的一种新型试剂,其特 点是裂解能力强、灵敏度高。本研究探讨了利用%∞l—A+
提取百合总RNA时的合适试剂用量以及不同百合器官总 RNA的提取效果,为百合总RNA提取及后续分子生物学研 究提供参考。 l材料与方法 1.1材料

3个用量处理,以后采用优化后的

体积);匀浆样品在15—30℃放置5幽,使核酸蛋白复合物
r/ⅡIin离心10 min,去除样品组织中较

多的蛋白、多糖、植物结节等,取上清液(叶片O.6ⅡIl,鳞片
0.5Ⅲ1)。

(3)每管加O.2 IIll氯仿,盖好盖.手动颠倒混匀2 Inin(或 剧烈振荡混匀15 s),室温放置3 (4)4℃下12
000 IIlin。

供试材料为东方百合品种So如n他。
1.2主要试验仪器与试剂
1.2.1

r/min离心10一15 Tnin。样品分为3

层:黄色有机相、中间层、上层无色水相,RNA主要在水相中, 把水相(约O.2一O.15 IIll)转移到新管中,加入等体积异丙 醇,混匀,宅温放置20—30
min。

主要试验仪器

Eppendorf 5804R低温离心机;Mim?

p0幢超纯水仪;MiniRun GE—100电泳仪等。 1.2.2试剂异丙醇、乙醇、氯仿购自国药集团化学试剂公

(5)4℃下12 000 r/mh离心10ⅡIin.去上清。离心前沉 淀经常是看不见的.离心后管侧和管底形成胶状沉淀。 (6)加入l
llll

司;啊∞l—A+为天根生化科技(北京)有限公司产品;琼脂糖
为GENE TECH公司产品;Gold 产品。

view荧光染料为S0蛐io公司

75%乙醇(RNa∞一he ddH:0配制)洗涤
ml

沉淀。每用lⅡll“洲一A+至少用l
(7)4℃下5
000

75%乙醇洗涤。

r/min离心3 IIIin。倒出液体。注意不要

收稿日期:2009一Ol—07

倒出沉淀,剩余少量液体短暂离心。然后用枪头吸出.注意不 要吸取沉淀。 (8)室温晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后很难溶 解,大约晾2—3 rIlin即可),根据试验需要,加50—100—

基金项目:国家“863”计划(编号:2006^Al∞109)。 作者简介:张君堂(198l一).男,硕士研究生,主要从事百合病毒检测 体系优化的研究。E—mail:出锄gy80)ro∞708@126.cⅢ。 通讯作者:王志刚,男,硕士.助理研究员。E一啦订:w觚轳yalI@163. c响。 (上接第34页) [8]李景荣,孙建宏,张海峰,等.禽类IFN一.y mRNA表达量检测方
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万   方数据

一36一

江苏农业科学2009年第2期

(9)1.2%琼脂糖,100 V,电泳20 min,检验RNA纯度。 2结果与分析

3结论与讨论 本研究表明,用Tri加l—A+法可以提取到百合各器官的

2.1.不同用量Trizol—A+试剂的提取效果

RNA,而且具有使用试剂少、操作简单、整个试验流程短等特

。如图l所示,以so‰nne叶片为试材.分别加入0.6、
O.8、1.0ⅡllTrizol—A+试剂提取到的百合RNA电泳条带都比 较清晰。但在0.6“TrizoI—A+试剂处理中,第一次离心后 上清液体积较少,吸取时容易吸到沉淀;而O.8“和1.0
Inl

点。利用嘶∞l—A+试剂提取百合总RNA比较适宜的用量
是0.8 IIll;以百合叶片和花药为材料的总RNA获取量较大, 子房次之,其他器官的总RNA获取量较少;用1.2%琼脂糖 凝胶电泳检测提取出的不同组织RNA的完整性,结果28s、 18S和5s 3条带都清晰可见。 由于在植物组织中普遍存在次生代谢物质,提取总RNA 时必须考虑如何有效去除那些容易产生干扰的物质,获得高 质量的RNA,同时还要兼顾试验的效率。百合特别是东方百 合组织中富含大量多糖类物质,而多糖理化性质与RNA相 似,提取过程中往往与RNA形成难溶的共沉淀一1,在除去多 糖的同时RNA也会被裹挟带走¨j,造成RNA产量减少,或者 多糖溶解后形成黏稠的溶液污染RNA样品,无法用于进一步

处理都可以比较容易地吸取到足量的上清液,基于节省药剂 的原则,O.8 mI的Trizol—A+试剂用量比较适宜。

的分子生物学研究。在%zol—A+法中,是用氯仿、乙醇去除
多糖,但经电泳观察。点样孔仍然有明显的杂质,说明多糖可 能仍未被很好地去除,这是这种方法须要进一步改进的地方。 此外,在特定的研究中,须要从不同器官中提取总RNA,而本 研究中从已开放的花瓣、幼嫩花蕾的花瓣、花丝和花柱当中提 取的总RNA电泳条带较弱,说明获取到的总RNA量较少,而 且几次重复试验都得到相同的结果。这一方面说明这些器官
圈l 不同用量Triz01.A‘试剂对百合总RNA的提取效果

中的RNA量可能较少,另一方面也说明针对这些器官须要发 展更有效的提取方法。

2.2不同器官的提取效果

从电泳结果(图2)来看。采用w∞l—A+提取到了咻
bonne的叶片、已开放的花瓣、幼嫩花蕾的花瓣、花丝、花柱、 子房、花药总RNA,28S、18S、和5S 3种RNA的电泳条带清 晰,而且有部分小RNA的条带。其中以叶片、子房和花药的 RNA条带亮度较高.说明提取量较大,其他几种器官总RNA 的电泳条带较暗,说明提取量较小。

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万   方数据

Trizol-A+试剂法提取百合总RNA
作者: 作者单位: 张君堂, 陶承光, 王志刚, 李雨, 张惠华, 李丹 张君堂(沈阳农业大学园艺学院,辽宁沈阳,110161;辽宁省农业科学院花卉研究所,辽宁沈阳 ,110161), 陶承光,王志刚,李雨,张惠华,李丹(辽宁省农业科学院花卉研究所,辽宁沈阳 ,110161) 江苏农业科学 JIANGSU AGRICULTURAL SCIENCES 2009(2)

刊名: 英文刊名: 年,卷(期):

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