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转基因植物及其产品检测-质量控制与标准物质应用


转基因植物及其产品检测 质量保证与标准物质应用
金芜军 中国农业科学院生物技术研究所 2010-05-06, 2010-05-06,杭州

主要内容
一、PCR检测质量保证 PCR检测质量保证 二、核酸检测标准物质 三、标准物质在转基因检测中的应用 四、国内外转基因植物及其产品检测标准物质 五、标准物质的使用 六、标准物质管理


PCR检测质量保证 PCR检测质量保证
基本概念: 基本概念:
? 质量保证(quality assureance,QA) 质量保证( assureance,QA) ? (实验)室内(部)质量控制(internal 实验)室内( 质量控制( control,IQC) quality control,IQC) ? (实验)室间质量评价(external quality 实验)室间质量评价( assessment,EQA) assessment,EQA) ? 准确度(accuracy) 准确度(accuracy) ? 偏差(bias) 偏差(bias) ? 精密度(precision) 精密度(precision)

? 重复性条件(repeatability conditions) 重复性条件( conditions) ? 批(run) run) ? 均值(mean) 均值(mean) ? 标准差(standard deviation,SD或s) 标准差( deviation,SD或 ? 变异系数(coefficient of variation,CV) 变异系数( variation,CV) ? 正态分布(gaussian distribution) 正态分布( distribution)

室内质量控制与室间质量控制
室内质量控制(IQC): 室内质量控制(IQC):
– 人员 – 批内及批间重复性 – 结果可靠性和有效性;即时评价 结果可靠性和有效性;

室间质量控制(EQA): 室间质量控制(EQA):
– 第三方机构:农业部科技发展中心;农业部系 第三方机构:农业部科技发展中心; 统其他质检机构;质检系统;JRC; 统其他质检机构;质检系统;JRC;GIPSA – 准确度;不同实验室结果可比性 准确度; – 操作与方法;回顾性评价 操作与方法;

精密度与准确度
●● ● ● ● ● ● ● ● ●

即准确又精确

准确而不精确
● ● ●

● ● ● ● ● ● ●

精确而不准确

即不准确又不精确

均值、标准差与变异系数
n

均值(X) =

∑X
i =1

i

n
n∑ X i ? (∑ X i ) 2
2 i =1 n n

标准差( SD) =

n(n ? 1)

i =1

CV

SD = × 100 % X

测定值的分布

质量保证:IQC与EQA
采 样 确定检测目的、 确定检测目的、内容 采样准备 采样 分样 样品运输、保存 样品运输、 送样 样品接收、 样品接收、编号 样品检测 检测结果的有效性 仪器设备的有效性 试剂的质检 结果分析判读 报告 管理决策

QA

检 测

IQC EQA

报 告

检测前质量控制
实验室环境与仪器设备管理
实验室环境
溶液配制 PCR反应体系 反应体系 配制I 配制

样品接收

样品前处理

DNA提取纯化 提取纯化

PCR反应体系 反应体系 配制II 配制

PCR

后PCR (电泳分析) 电泳分析)

样品保存

DNA样品保存 样品保存

仪器设备及材料管理
? 仪器设备维护及校准 天平、移液器、定量PCR仪 天平、移液器、定量PCR仪 PCR ? 离心管质检:防污染;定量PCR 离心管质检:防污染;定量PCR ? 吸头,tips:防污染 吸头,tips: ? 日常核查:灰尘、细菌,其他实验材料; 日常核查:灰尘、细菌,其他实验材料; 前次反应产物

日常核查要点
工作项目 水浴、 水浴、干浴设备 生物安全柜 IQC 弱阳性质控 低中高浓度质控(定量) 低中高浓度质控(定量) 阴性质控: 阴性质控:原样品 经历提取过程空管 仅含扩增反应混合液管 实验台面 加样器、 加样器、离心机 实验室各区 □有 □有 □有 □有 □有 □消毒、清洁 消毒、 □紫外照射 □消毒、清洁 消毒、 □单向流动 □紫外照射 核查要点 □温度校准及记录 □先启动运行30 min后再开始工作 先启动运行30 min后再开始工作

试剂质量
核酸提取试剂:尽量简化步骤, 核酸提取试剂:尽量简化步骤,降低试剂污染概率 PCR扩增试剂 PCR扩增试剂
—引物、探针:纯度,“错误序列”;特异性 引物、探针:纯度, 错误序列” 缓冲液、dNTP:KCl/NaCl; —缓冲液、dNTP:KCl/NaCl;Mg2+; dNTP平衡且在20-200μ 平衡且在20 dNTP平衡且在20-200μmol/L Taq酶 比活性20 — Taq酶:比活性20 U/pmol

试剂贮存:PCR, 提取试剂, 试剂贮存:PCR,-20 ℃;提取试剂,2-8 ℃ 试剂质检
– 内外包装 – 性能 – 抗干扰

操作程序
? 检测过程涉及多个环节:采样、样品保存、制备、 检测过程涉及多个环节:采样、样品保存、制备、 试剂配制、核酸提取、PCR扩增 产物检测、 扩增、 试剂配制、核酸提取、PCR扩增、产物检测、结果 分析、 分析、报告 ? 每一环节都会产生变异 ? 过程引起的变异,每一步骤变异总和: 过程引起的变异,每一步骤变异总和:

( SD) =

SD + SD + SD
2 2 a b

+ ... c
2

主要污染源
样品本身 实验室其他实验材料 上次检测残留物 环境

主要防污染措施
严格分区、 严格分区、单向流动 化学清洁:10%次氯酸钠 70%乙醇 次氯酸钠; 化学清洁:10%次氯酸钠;70%乙醇 扩增产物修饰: 扩增产物修饰:不能干扰正常扩增检测
? 扩增前修饰:紫外照射,环丁嘧啶二聚体、嘧啶6,4-二 扩增前修饰:紫外照射,环丁嘧啶二聚体、嘧啶6 聚体等;尿嘧啶- 糖基化酶(UNG),前次扩增用dUTP ),前次扩增用dUTP代 聚体等;尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG),前次扩增用dUTP代 dTTP,后次反应前UNG UNG处理反应管 替dTTP,后次反应前UNG处理反应管 ? 扩增后修饰:使扩增产物不能作为下次扩增的模板 扩增后修饰:

质控数据评价
阳性质控样品失控(假阴性)原因: 阳性质控样品失控(假阴性)原因:
– 随机误差 – 仪器 – 试剂

预防措施: 预防措施:
– 核酸纯化 – 重复与平行的设置 – 样品稀释 – 使用内质控(internal control,IC) 使用内质控( control,IC)

假阴性原因 阳性质控样品测定结果偏低或为阴性 分析流程 结果偏低
测试样品中 无强阳性 系统误差 离心管 含抑制 物 更换离 心管 Taq酶 Taq酶 活性 低 更换 Taq酶 Taq酶 核酸提 取效率 低 更换提 取试剂 结果正常 所有样品重新检测 质控样品及3 质控样品及3-5 份已知阳性 质控样品正常且阳 性样品有些值增加 质控及已知阳性 样品仍异常 测试样品中 有强阳性 核酸 提取 失败 核酸提 取抑制 物残留 随机误差 核酸提 取试剂 混入

阴性 测试样品 全为阴性 Taq酶 Taq酶 失活

测试样品 中有阳性 PCR仪 PCR仪 孔间温 度差异 已知DNA 已知DNA 同孔扩增

验 证 措 施

更换 试剂

结果仍低 PCR仪孔温度校 PCR仪孔温度校 准后再检测 按系统误差 途径分析

阴性质控样品失控原因与预防
? 原因:污染 原因: ? 措施:防污染 措施:
工作项目 实验台面 加样器、 加样器、离心机 实验室各区 □消毒、清洁 消毒、 □紫外照射 □消毒、清洁 消毒、 □单向流动 □紫外照射 核查要点

假阳性结果分析流程
阴性质控样品测定为阳性 同时检测样品的情况 测试样品亦全为阳性 扩增产物 污染 试剂 污染 测试样品中有阳性也有阴性 扩增产物 轻度污染 5-8份水样 品检测 有阳性则确认 有实验室污染 措施 改善 操作 无阳性说明样 品间交叉污染 样品间交 叉污染

验证 3-5空管 室内静止 5-8份水 样品检测 措施 暂停日常检测, 暂停日常检测,实 验室清洁、 验室清洁、通风 更换 试剂 试剂直接 扩增检测

验证

室间质量评价
EQA方案,样品设计与准备: EQA方案,样品设计与准备:5-8份组合 方案 报告格式: 报告格式:统一 报告内容:清楚、简洁 报告内容:清楚、 方法:统一方法; 方法:统一方法;与日常检测方法一致 总结:方法、试剂、 总结:方法、试剂、仪器 评价:特异性、灵敏度、 评价:特异性、灵敏度、符合率 EQA报告: EQA报告:及时 报告

核酸检测标准物质
? 应用历史 ? 主要应用范围 ? 转基因植物及其产品检测标准物质概况: 转基因植物及其产品检测标准物质概况:
– IRMM – AOCS – 农业部 – 出入境系统

标准物质
? 具有一种或多种足够均匀和很好地确定了特性,用以校准 具有一种或多种足够均匀和很好地确定了特性, 测量装置、 测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质 ? 用最接近真值的接受参照值,作为统一量值的计量标准 用最接近真值的接受参照值, ? 可保存、传递信息和量值 可保存、 ? 本身是一种物质或材料;而不是一种器具或装置 本身是一种物质或材料; ? 是计量标准的一种形式,要通过检定并正式批准,具有确 是计量标准的一种形式,要通过检定并正式批准, 定的检定数据和证书, 定的检定数据和证书,具有一定的法律地位 ? 必须在规定条件下具有高稳定的物理、化学或计量学特性 必须在规定条件下具有高稳定的物理、 ? 标准物质的保证值: 标准物质的保证值:

A ±U

与标准物质相关的一些概念
? 标准物质(reference material,RM) 标准物质( material,RM) ? 有证标准物质(certified reference material, 有证标准物质( material, CRM ) ? 测量标准(measurement standard) 测量标准( standard)
– 一级测量标准或一级标准(primary measurement 一级测量标准或一级标准( standard或 standard或primary standard ) – 二级测量标准或二级标准( secondary measurement 二级测量标准或二级标准( standard或 standard或secondary standard ) – 工作测量标准或工作标准( working measurement 工作测量标准或工作标准( standard或 standard或working standard )

? 国际标准(international standard) 国际标准( standard)

? 国际约定校准物质(international conventional 国际约定校准物质( material) calibration material) ? 溯源性或计量学溯源性( traceability或 溯源性或计量学溯源性( traceability或 traceability) metrological traceability) ? 测量程序(measurement procedure) 测量程序( procedure) ? 测量方法(method of measurement) measurement) 测量方法( ? 国际约定参考测量程序( international 国际约定参考测量程序( conventional reference procedure) procedure) ? 国际测量标准或国际标准( international 国际测量标准或国际标准( standard或 measurement standard或 international standard )

? 测量不确定度(uncertainty of measurement ) 测量不确定度( ? 国际单位(international units,IU) 国际单位( units,IU) ? 决定性方法(definitive method) 决定性方法( method) ? 参考方法(reference method) 参考方法( method) ? 质控品(controls) 质控品(controls) ? 稳定性(stability) 稳定性(stability) ? 均匀性(homogeneity) 均匀性(homogeneity) ? 基质效应(matrix effect)≠互通性(commutability) 基质效应( effect) 互通性(commutability) ? 国际单位制(International System of Units, SI) 国际单位制(International

核酸检测用标准物质的溯源关系
? 转基因检测中的“核酸”不能直接用物理或化学 转基因检测中的“核酸” 方法测定, 方法测定,所以没有传统意义的一级参考测量程 序和一级标准物质 ? 核酸检测可以有:国际标准物质、国家或地区标 核酸检测可以有:国际标准物质、 准物质、 准物质、实验室内部的工作制剂 ? 病毒检测:临床检验标准物质——英国国家生物 病毒检测:临床检验标准物质—— ——英国国家生物 学标准物质和质控物研究所, 学标准物质和质控物研究所,NIBSC ? 转基因检测国际标准物质? 转基因检测国际标准物质?

量值溯源
? 溯源到国际基准(SI):做不到 溯源到国际基准(SI):做不到 ): ? 溯源到方法:标准方法;先有标准方法还 溯源到方法:标准方法; 是先有标准物质 ? 溯源到人工标准:合成核酸? 溯源到人工标准:合成核酸?

核酸检测一级参考测量程序的替 代方法
为了在不同实验室间的统一测量程序, 为了在不同实验室间的统一测量程序,可以 为核酸检测建立所谓“参考测量系统” 为核酸检测建立所谓“参考测量系统”,包括三 方面内容: 方面内容: 参考方法 参考物质 参考实验室

核酸检测标准物质种类
基质 质粒 基因组DNA 基因组DNA 合成核酸序列

标准物质在转基因检测中的应用
检验校准标准或测量工作标准 方法评价:符合度、 方法评价:符合度、不确定度 检测校正:统计学意义的质量控制; 检测校正:统计学意义的质量控制;检测结果的 回溯; 回溯; 质量评价和质量控制 能力测试 质控结果: 质控结果:不可能进行重复测定 仲裁: 仲裁:不同实验室检测结果不一致

PCR检测标准化
试剂方法的标准化 工作程序的标准化

标准物质(校准品) 标准物质(校准品)

具有可比性的可靠结果

传统理化检测与转基因检测中标 准物质的使用
采样, 采样,处理 保存 样品制备 采样, 采样,处理 冷却,保存; ℃ 冷却,保存;4℃或-20℃ ℃ DNA提取纯化 提取纯化

检测鉴定 或 定量检测 求值 评价

定性参考物质 定量参考物质

标 准 物 质

定性PCR 定性 或 定量PCR 定量 检测结果与标准物质或其 他参照物比较 结果判定

核酸检测中的量值传递
(质粒或合成DNA标准物质)
? 以一种材料的特性值来校准另一材料统一特性 的值 ? 取决于适合的标准物质及其在检测程序中的可 代替性
– 标准物质的特征值与被测量一致 – 具有足够大特性值,可以稀释成方法工作范围的不 具有足够大特性值, 同浓度 – 对特定检测目的的可代替性/适合性已得到证明 对特定检测目的的可代替性/ – 稳定性和均匀性经过验证

方法评价
要点: 要点:
? 特异性 ? 灵敏度 ? 符合度

注意事项: 注意事项:
? 统计学方法 ? 全面:方法、试剂、实验室水平 全面:方法、试剂、 ? 严重误差产生的原因 ? 其他方面:检测的干扰因素 其他方面:

偏离的估算
偏离的估算是方法评价的重要指标, 偏离的估算是方法评价的重要指标,标准物质可为 方法偏离估算提供必要信息: 方法偏离估算提供必要信息:
– 认定值,不确定值在限制范围内 认定值, – 经认定的由方法引起的不确定值

对标准物质的要求
– 标准物质类别(基质)在方法测定范围内 标准物质类别(基质) – 标准物质浓度在方法工作范围内 – 不同浓度标准物质,最好能涵盖方法的所有测量范围 不同浓度标准物质,

标准物质作为工作标准
? 最广泛的用途,工作曲线 最广泛的用途, ? 不同实验室使用相同标准物质,保证结果可比性 不同实验室使用相同标准物质,

方法研究中的标准曲线: 方法研究中的标准曲线: ? 自制内部参考物质制作标准曲线 ? 选择几个点,标准物质作外部参考物质 选择几个点,

评价检测结果的可靠性
? 平均值的置信区间(U) 平均值的置信区间( 公式: 公式: U = X ± tS / n ? 用标准物质的U来判断结果的可靠性 用标准物质的U
– 标准物质与样品平行测定 – 如果标准物质的分析结果与标准物质证书上的A±U 如果标准物质的分析结果与标准物质证书上的A 一致, 一致,表示样品检测结果可靠

公式: 公式: X ? A ≤

(tS / n ) +U

2

2

检验仪器的可靠性
(精密度、准确度)
? 确定仪器处于正常运转状态 ? 用测定实际样品的操作方法和程序测定标准物质 ? 测定结果与标准物质保证值一致,表明仪器正常 测定结果与标准物质保证值一致, 运转
X ? A ≤
2

( tS /

n)

+

U

2

? 尽量使用纯标准物质:质粒标准分子、基因组 尽量使用纯标准物质:质粒标准分子、 DNA、合成DNA DNA序列 DNA、合成DNA序列

国内外转基因植物及其产品检测 标准物质
? IRMM ? AOCS ? 出入境检验检疫局 ? 重大专项

标准物质的使用: 标准物质的使用:选用原则
对特定检测目的的适用性,包括对基质效应、 1、对特定检测目的的适用性,包括对基质效应、量 值间隔、不确定度的要求: 值间隔、不确定度的要求:
? 被测量值 ? 测量区间(浓度) 测量区间(浓度) ? 基质匹配性及可能的干扰因素 ? 样品量大小 ? 均匀性和稳定性 ? 测量不确定度

2、证书的有效性及不确定度的值 标准物质及其生产者的以往记录,包括: 3、标准物质及其生产者的以往记录,包括:
是否进行实验室间比对(定值) 是否进行实验室间比对(定值) 是否使用不同检测方法进行了检验 是否有其他实验室应用的成功经验

4、标准物质证书及研制报告内容 5、标准物质的研制与定值程序是否符合相关 标准

根据用途选择标准物质
方法建立与评价 方法建立的步骤: 方法建立的步骤:
– 方法研究 – 方法实施 – 方法验证 – 方法性能监测

使用标准物质确定方法的不确定度、 使用标准物质确定方法的不确定度、特异性 和灵敏度

方法校正(定量方法)
? 一般仅纯物质标准物质可用于测量阶段的校准 ? 质粒分子或基因组DNA可用于校正 质粒分子或基因组DNA可用于校正 DNA ? 标准物质作为内部控制,用于确定检测过程中样 标准物质作为内部控制, 品的损耗、污染、 品的损耗、污染、干扰及其对应的不确定值 ? 当待测样品与标准物质特性高度相似时,可用基 当待测样品与标准物质特性高度相似时, 体标准物质进行方法校正 ? 同一来源的标准物质一次仅能用于一种目的;不 同一来源的标准物质一次仅能用于一种目的; 能使用同一来源的标准物质同时进行方法校正和 检测程序评估

质量保证与质量控制
? 实验室长期质量控制: 实验室长期质量控制: ? 评价方法或检测人员的性能(检测 评价方法或检测人员的性能( 水平)、变化 水平)、变化 )、 ? 对标准物质的要求:均匀性、稳定 对标准物质的要求:均匀性、 性、特性值

能力测试
? 均匀性:保证分发到各实验室的样品相同 均匀性: ? 稳定性:在运输、保存、检测过程中的稳 稳定性:在运输、保存、 定性;能力测试持续的时间 定性;

实验室间比对
? 稳定性:实验室间比对必然涉及样品的分 稳定性: 发传递 ? 标准物质的均匀性:保证不同实验室间的 标准物质的均匀性: 结果仅由方法的重现性

身份确认与质控结果
? 特性值 ? 标准物质的准确度应比被测样品预期达到 的准确度高3 10倍 的准确度高3-10倍
– 如欧盟要求对1%转基因含量的期望分析结果准确度在 如欧盟要求对1%转基因含量的期望分析结果准确度在 1% 50%以内 则所选用的标准物质的准确度应在±5%以内, ±50%以内,则所选用的标准物质的准确度应在±5%17%之间 ±17%之间

标准物质使用注意事项
一般要求: 一般要求:
在合格期内, 在合格期内,有合格证书 经过分析测试,证明性能符合要求 经过分析测试, 使用新的批号时, 使用新的批号时,必须进行对比测试 分析测试的数据,必须进行归档, 分析测试的数据,必须进行归档,便于检查

定量检测
标准物质测定值与认定值的比较: 标准物质测定值与认定值的比较: 计算标准物质认定值的标准不确定度( 计算标准物质认定值的标准不确定度(UCRM) 估算结果的测量不确定度( ),可用重现性的 估算结果的测量不确定度(Um),可用重现性的 标准差代替 计算二者联合不确定度

uc =

u m + uCRM
2 2

确认2*U 确认2*UC是否大于认定值与测量值的差 是,则结果可接受

实验室内部参照物
商品化供应标准物质无法满足实验室需要, 商品化供应标准物质无法满足实验室需要,建立内 部参考物质非常必要。注意事项: 部参考物质非常必要。注意事项:
– 选择合适的原料 – 均匀性测试 – 制备与分装(均匀性、污染控制、稳定性) 制备与分装(均匀性、污染控制、稳定性) – 稳定性测试 – 特征值研究 – 不确定度计算 – 文件归档及质量保证 – 保存及稳定性监测

标准物质管理
一、标准物质来源
? 标准品作为计量物质应由权威法定机构提供,列入标准物 标准品作为计量物质应由权威法定机构提供, 质目录 ? 建议:对进口转基因植物可要求其提供有证标准物质 建议:

二、标准物质保管
? 应有专人负责标准物质管理 ? 标准物质到货后,管理员应检查验收并及时填写接收及使 标准物质到货后, 用记录,记录内容包括:编号、品名、批号、来源、 用记录,记录内容包括:编号、品名、批号、来源、数量 购进日期、领用数量、领用日期、领用人、结余、 、购进日期、领用数量、领用日期、领用人、结余、备注

标准物质存储、 三、标准物质存储、领用
? 基体标准物质-70 ℃长期保存或按产品说明书指定条件保 基体标准物质存 ? 质粒标准分子-70 ℃或按产品说明书保存 质粒标准分子? 管理员应每周登记冰箱温度,如遇停电情况应于次日记录 管理员应每周登记冰箱温度, 温度, 温度,并评估可能影响 ? 检验人员若需使用标准物质,应向管理员提出,管理员按 检验人员若需使用标准物质,应向管理员提出, 先进先出原则发放标准物质并在对应标准物质接收及使用 记录上的领用数量、领用日期、领用人、 记录上的领用数量、领用日期、领用人、结余项进行记录

四、标准物质的销毁及使用记录
? 标准物质(使用完毕)或过期后都应及时销毁,并记录 标准物质(使用完毕)或过期后都应及时销毁,

五、定期对标准物质进行检查
? 建立标准物质检查表,内容包括:检查日期、抽样品名、 建立标准物质检查表,内容包括:检查日期、抽样品名、 批号、登记数量、实际数量、有无品质证书、存储条件、 批号、登记数量、实际数量、有无品质证书、存储条件、 是否有冰箱温度记录、管理员签名、 是否有冰箱温度记录、管理员签名、检查员签名 ? 定期检查每季度至少检查1次 定期检查每季度至少检查1

谢谢大家!


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