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茶微卫星引物的开发


全国茶业科技学术研讨会论文集

茶微卫星引物的开发
王益,左云娟,周世良
(中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室,北京市香山南辛村 20 号,100093)

摘要:采用了从富集的基因组文库分离微卫星的方法,开发出了茶的 16 个微卫星的 位 点 , 其 中 有 12 个 二 核 苷 酸 的 重 复 和 4

个 三 核 苷 酸 的 重 复 : (AC)18 , (AC)28 , (CT)20 , (CT)32 , (GA)18 , (TC)12C(CT)5, (TC)29 , (TC)19 TATCTA (AG)31 AA(AG) 7 G (GA)5 , (TC)5C(CT)7 T(TC)29 , (TG)7 , (TG)17 A(GA)17 , (AAG)7 , (CAC)5 ,, (CAC)6 , (GGT)7 。 (TC)12 , 关键词:茶,微卫星

Development of Microsatellite Markers from Tea (Camellia sinensis)
YI WANG, YUNJUAN ZUO and SHILIANG ZHOU
State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Nanxincun No. 20, Xiangshan, Beijing 100093, China

Abstract:Sixteen microsatellite loci, 12 dinucleotide repeats and 4 trinucleotide repeats, were isolated from enriched genomic DNA library derived from tea (Camellia sinensis): (AC)18 , (AC)28, (AG)31 AA(AG) 7 G (GA)5 , (CT)20, (CT)32 ,(GA)18 , (TC)12 C(CT)5 , (TC)29, (TC)19 TATCTA(TC)12 , (TC)5 C(CT)7T(TC)29, (TG)7 , (TG)17A(GA)17 , (AAG)7 , (CAC)5 , (CAC)6 , (GGT)7. Keywords: tea, microsatellite, Camellia sinensis

茶,作为一种不含酒精的饮料在世界上非常受欢迎。根据世界粮农组织 2004 年的统计,世界茶叶产量约 336 万吨,其中中国茶叶产量约 86 万吨,世界排名第 一;同年,世界茶叶出口量 161 万吨,约 32.7 亿美元,其中中国出口 28.2 万吨, 约 4.53 亿美元 (FAOSTATS, www.fao.org)。茶叶主要是来自茶 Camellia sinensis 的 两个变种 C. sinensis var. sinensis 茶和 C. sinensis var. assamica 普洱茶。研究表明, 普洱茶可能是 Camellia 属亲缘关系较近几个种的混和型。在中国茶已经有 4000 多 年的栽培历史了。据报道到 2005 年底,中国已经有 227 个茶的改良品种( Chen et al.2007),但是依然期待培育出高产、高质、抗病虫害的品种。已经有不少分子标 记的方法, RAPD random amplified polymorphic DNA) AFLP amplified fragment 如 ( 、 ( length polymorphism)等 (Paul et al. 1997; Kaundun et al. 2000; Balasaravanan et al. 2003) 应用在茶的遗传多样性的研究中。微卫星( mocrosatellite ),也称简单重复 序列( Simple Sequence Repeat, SSR),是一类由 2-6 个核苷酸为重复单元组成的

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简单重复序列。 微卫星首先在人类遗传的研究中被发现。 1982 年, Hamada 等 (1982) 在人的心肌肌动蛋白 (Ha-25)的内含子中发现了一个重复 25 次的 AT 序列。 Weber 等 (1989)对人类基因数据库中的微卫星进行了系统的研究,发现其重复次数的高度 变异性。之后 SSR 作为一种非常有效的遗传标记被广泛的应用在许多领域。 1996 年, Powell 等对 SSR 的优点做了很好的综述,如共显性、多态性相对丰富、基因 组覆盖较多等。微卫星标记是根据 SSR 序列两翼的特定序列设计引物,用来扩增 重复序列本身。微卫星引物的开发可以从公共核酸序列数据库中查询,但是针对初 次研究的物种 , 往往需要先建立含有微卫星的基因组文库,然后进行费时费力的特 异性引物设计。 Freeman 等( 2004)用构建微卫星文库的方法分离出了 15 个茶的 SSR 位点。对于茶这样重要的经济作物我们需要有更多的微卫星引物来研究它。本 研究新开发出茶更多的微卫星引物。 1 材料与方法 微卫星富集文库的构建是根据 Glenn & Schable (2005)的方法做了适当的改进。 1.1 材料: 实验材料采自浙江省杭州市植物园栽培的 Camellia sinensis。 1.2 基因组 DNA 提取 基因组 DNA 提取采用 CTAB 法( Doyle & Doyle, 1987),用 Wizard DNA Clean-Up System (Promega catalog #A7280)进行纯化。 1.3 消化基因组 DNA 选 取 限 制 性 内 切 酶 Rsa I(Biolabs, New England) 将 基 因 组 DAN 切 成 大 小 300-1000bp 的片断。下述混和体系 37℃过夜:
Reagent 10×T4 ligase buffer(NEB) 100×BSA O.5?m NaCl 10000u/?l Rsa I 2000u/?l Xmn I 200ng/?l DNA Total Amount(?l) 2.5 0.25 0.25 1.0 1.0 20.0 25

1.4 接头连接酶切产物 ( 1)接头制备: 接 头 序 列 采 用 ( Hamilton et al. , 1999 ) Super SNX 24-Forward : 5’GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC, Super SNX 24 +4p-Reverse : 5’pGATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA。 按照下述反应体系在 PCR 仪 95℃

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中反应 5min,缓慢冷却至室温:
Reagent 100?m SuperSNX24-F 100?m SuperSNX24-R O.5M NaCl ddH2O Total Amount(?l) 1.4 1.4 1.4 2.8 7.0

( 2)连接反应: 将下述反应体系加入到酶切产物中,室温过夜:
Reagent 20?m dsSuperSNX linkers NEB 10×T4 ligase buffer 2000u/?l T4 ligase ddH 2 O Total Amount(?l) 7.0 1.0 1.5 0.5 10

( 3)接头连接产物的 PCR,反应体系:
Reagent 10×PCR buffer 100?m SuperSNX24-F 2mM dNTP 2mM MgCl 2 ddH 2 O Taq DNA Polymerase Linker ligated DNA fragments Amount(?l) 2.5 0.13 1.875 2 16.3 0.2 2

反应程序:
Step 1 2 3 4 5 6 Temperature 72℃ 95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 15℃ Time Using 2min 2min 20s 20s 1.5min 10min 3 24cycles ← #

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1.5 含微卫星 DNA 片断的富集 ( 1)试剂的配制:
Reagent 2×Hyb Solution Wash Solution1 Wash Solution2 Amount 20 ml 20 ml 40 ml 20×SSC 12× 2× 1× 12 ml 2 ml 2 ml 5%SDS 0.2% 0.1% 0.1% 0.8ml 0.4ml 0.8ml ddH 2 O 7.2ml 17.6ml 37.2ml

备注: 20×SSC :175.5g NaCl,88g NaCitrate(柠檬酸钠), 加蒸馏水至 1L; 1×Hyb Solution: 1ml 2×Hyb Solution,1ml ddH 2 O.

( 2)杂交: 生 物 素 标 记 的 探 针 (AG)12, (AT)12, (ACG)12, (ACT)12, (CCA)8, (AACT)8, (AAGT)8 和 (AGAT)8,捕获含有微卫星的 DNA 片断。
Reagent ddH 2 O 2×Hyb solution 100?m biotinylated oligoprobes Linker ligated DNA Total Amount(?l) 14.5 25 0.5 10 50

杂交 PCR 反应程序:
Step 1 2 3 4 5 Temperature 95℃ 70℃ 50℃ 50℃ 15℃ Time Using 5min 5s 10min 5s 10min 4 20 -0.5 2 99 -0.2℃ ← # Touchdown

( 3)磁珠制备及洗脱: 选用的磁珠为: M-280 Streptavidin-coated Dynabeads (Dynal, Biotech)。先轻轻 振荡使磁珠混匀 ,取 50?l 于 1.5ml 离心管,加入 250?lTE,混匀,用磁力架 (MPC) 捕获,弃上清。重复一次。加入 50?l1×Hyb solution,混匀,MPC 捕获磁珠。弃上 清, 重复一次。 然后将 DNA&探针的杂交体系加入到磁珠中,混匀。 室温下 150rpm 振荡 1h 左右。 洗脱的具体流程可以参考 M-280 Streptavidin-coated Dynabeads 操作指南进行。 洗脱完毕得到的 DNA 加入 20?lTLE 溶解。

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1.6 富集产物 PCR 扩增 反应体系
Reagent 10×PCR buffer 1000?g/ml BSA 2mM dNTP 2mM MgCl 2 ddH 2 O Taq 10?m SuperSNX24-F 富集 DNA Total Amount(?l) 2.5 0.625 1.875 2 14.5 0.2 1.3 2 25

反应程序
step 1 2 3 4 5 6 temperature 95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 72℃ 15℃ time 2min 20s 20s 1.5min 30min 10min ← #

2

29cycles

1.7 二次富集 重复步骤 1.5-1.6。 1.8 克隆及测序 ( 1)克隆: 二次富集 DNA 的 PCR 产物纯化后用 pGEM-T easy 载体和 Escherichia coli DH5α 感受态细胞克隆 (Promega)。 ( 2)菌液 PCR 以及检测: 反应体系
Reagent 10×PCR buffer 2mM dNTP 25mM MgCl 2 ddH 2 O 5u/?l Taq DNA Polymerase 10?m SuperSNX24-F 菌液 Total Amount(?l) 1 0.75 0.8 6.33 0.1 0.52 0.5 10

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反应程序
step 1 2 3 4 5 6 temperature 95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 72℃ 15℃ time 2min 20s 20s 1.5min 30min 10min ← #

2

29cycles

点样 2?l,以 1.2%的琼脂糖胶电泳检测。 ( 3)测序: 根据电泳检测的结果,选取每隔 10bp 左右分子量间隔的阳性克隆用通用引物 Sp6 或者 T7 测序, MegaBACE-1000 (GE Healthcare)。 反应体系
Reagent ddH 2 O ET 5?M SP6 or T7 DNA Total Amount(?l) 5 2 1 2 10

反应程序
step 1 2 3 4 5 Temperature 95℃ 95℃ 52℃ 60℃ 15℃ time 2min 15s 15s 1.5min 10min ← #

2

34cycles

1.9 引物设计及验证 ( 1)引物设计 利用软件 Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft International)设计引物,设计时 PCR 产物的长度控制在 50-350bp 之间。 ( 2)引物验证 设计得到的引物合成之后初步检测是否可以 PCR 扩增出目的片断。 2 结果与讨论 挑选了 211 个阳性克隆中的 69 个测序,42 个序列中有微卫星。22 个微卫星的 位 点 是 唯 一 的 , 16 个 位 点 可 以 用 来 设 计 微 卫 星 的 引 物 : (AC)18 , (AC)28 ,
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(AG)31AA(AG) 7 G (GA)5, (CT)20, (CT)32, (GA)18, (TC)12C(CT)5, (TC)29, (TC)19 TATCTA(TC)12,(TC)5C(CT)7T(TC)29,(TG) 7 ,(TG) 17 A(GA) 17 ,(AAG) 7 ,(CAC) 5 , , (CAC)6, (GGT)7。 本研究中最常见的微卫星单元是 AG/TC,出现的概率是 50%。AC/TG 重复单 元出现的概率是 18.75%。三核苷酸出现的概率是 20%。这与 Freeman 等( 2004) 在茶微卫星开发中相应重复单元出现的概率不太一致。他们的研究表明 AG/TC 出 现的概率是 13.33%,而 AC/TG 出现的概率是 53.33%。研究开发得到的微卫星引 物仅有 TeaSSR01 和 CamsinM1 (Freeman et al. 2004)的重复单元和数目相同,以由 于两个微卫星两翼的序列不同因而属于不同的 SSR 位点。同时分离得到了 4 个三 核苷酸的位点。 重复单元是植物中出现最多的, AT 接下来是 AG 和 AC 重复 Powell ( et al. 1996,Katti et al. 2001)。但是本研究中没有检测到有 AT 的重复单元。很有可 能的原因是由于 AT 重复单元存在回文结构,我们很难从富集文库里分离到它们。 新开发出的微卫星引物将会为我们用 SSR 研究茶时提供更多的选择。 致谢: 实验过程中得到了同实验室张金梅女士的帮助。 本研究得到了国家自然科学基 金 (No.30121003 和 No. 30370154)的资助。
参考文献:
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Balasaravanan T, Pius PK, Kumar RR, Muraleedharan N and Shasany AK (2003) Genetic diversity among south Indian tea germplasm (Camellia sinensis, C. assamica and C. assamica spp. lasiocalyx) using AFLP markers. Plant Scince, 165, 365-372.

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Chen L, Zhou Z and Yang Y (2007) Genetic improvement and breeding of tea plant (Camellia sinensis) in China from individual selection to hybridization and molecular breeding. Euphytica, 154, 239-248. Doyle JJ and Doyle JL (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of leaf tissue. Phytochemistry Bulletin, 19, 11-15. Freeman S, West J, James C, Lea V and Mayes S (2004) Isolation and characterization of highly polymorphic microsatellites in tea (Camellia sinensis). Molecular Ecology Notes, 4, 324-326. Glenn TC and Schable NA (2005) Isolation Microsatellite DNA loci. Methods in Enzymology, 395, 202-222. Hamilton MB, Pincus EL, Di Fiore A and Fleishcer RC (1999) Universal linker and ligation procedures for construction of genomic libraries enriched for microsatellites. BioTechniques, 27, 500-507. Hamada H, Petrino MG and Kakunaga T (1982) A Novel Repeated Element with Z-DNA-Forming Potential is Widely Found in Evolutionarily Diverse Eukaryotic Genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79, 6461-6464.

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Katti MV, Ranjekar PK, and Gupta SV (2001) Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences. Molecular Biology and Evolution, 18, 1161-1167. Kaundun SS, Zhyvoloup A, Park YG (2000) Evaluation of the genetic diversity among elite tea (Camellia sinensis var. sinensis) accessions using RAPD markers. Euphytica, 115, 7–16. Paul S, Wachira FN, Powell W and Waugh R (1997) Diversity and genetic differentiation among populations of Indian and Kenyan tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) revealed by AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, 94, 255-263.

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Powell W, Machray GC and Provan J (1996) Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in

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Plant Science, 1, 215-222.
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Weber JL and May PE (1989) Abundant class of Human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics, 44, 388-396

作者简介:王益,男,25 岁,研究实习员,主要从事系统发育和叶绿体基因组进化方 面的研究。 基金项目:国家自然科学基金:No.30121003、No.30370154。

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