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微生物的培养和利用


课题1 微生物的实验室培养

培养基的成分及无菌操作技术

1.培养基 (1)培养基概念 营养物质 的不同需求,配制出 按照微生物对 供其 生长繁殖 的营养基质。

(2)培养基种类

包括 固体

培养基和液体

培养基等。

(3)培养基的化学成分 一般都含有 水 、

碳源 、 氮源 和无机盐 四类营养成分。还 需要满足微生物生长对 pH 、 特殊营养物质 及 氧气等的要求。

2.无菌技术
(1) 无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开,主要包括以下 四个方面 ①对实验操作的 灭菌 空间 、操作者的 衣着和手 ,进行清洁和 和 ; 等进行

消毒 ②将用于微生物培养的器皿、



接种用具

培养基

③为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在 附近进行; 酒精灯火焰 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与 接触。 周围的物品 相

(2)消毒和灭菌 ①消毒:消毒是指使用 较为温和的物理或化学 对人体有害 表面或内部一部分 化学药剂 消毒法。 方法仅杀死物体

不包括 的微生物,

(包括;

不包括)芽孢和孢子,常用的方法有煮沸 消毒法、 巴氏 消毒法、

②灭菌:灭菌是指使用 强烈的理化因素 杀死物体内外 所有的 微生物 , 包括 (包括,不包括)芽孢和孢子,常用的方法有 灼烧 灭

菌、

干热 ___灭菌和

高压蒸汽灭菌。

?[思维激活1] 用酒精擦拭实验者手臂属消毒还是 灭菌? 70%与 95%的酒精,哪一种效果更好?为 什么? ?提示 酒精擦拭属化学消毒,酒精消毒时,70% 的酒精杀菌效果最好。原因是:浓度过高,使菌 体表面蛋白质凝固成一层保护膜,乙醇分子不能 渗入其中;浓度过低,杀菌力减弱。

?1.碳源、氮源及生长因子的来源与功能归纳
营养要素 无机碳源 碳源 来源 CO2、NaHCO3、 CaCO3等含碳无机物 功能

糖类、脂质、蛋白质、 有机碳源 有机酸、石油、花生粉 饼等

①构成细胞物质和一 些代谢产物; ②有机碳既是碳源又 是能源

无机氮:NH3、铵盐、 无机氮源 硝酸盐、N2等 氮源 牛肉膏、蛋白胨、 有机氮源 核酸、尿素、氨基酸

将无机氮合成含氨的 代谢产物 合成蛋白质、核酸及 含氮的代谢产物 ①酶和核酸的组成成 分;②参与代谢过程 中的酶促反应

生长因子

维生素、氨基酸、碱基

?2.培养基类型划分
划分 标准 培养基种类 液体培养基 特 点 用 途

不加凝固剂

工业生产 观察微生物的运动、分 类鉴定 微生物分离、鉴定、活 菌计数、保藏菌种

物理 半固体培养基 加凝固剂,如 性质 琼脂 固体培养基

天然培养基
化学 成分 合成培养基

含化学成分不明 确的天然物质 培养基成分明确( 用化学成分已知 的化学物质配成)

工业生产

分类、鉴定

培养基中加入某种化 学物质,以抑制不需 选择培 要的微生物的生长, 养基 促进所需要的微生物 的生长 用 途

培养、分离出特定微生物(如 培养酵母菌和霉菌,可在培 养基中加入青霉素;培养金 黄色葡萄球菌,可在培养基 中加入高浓度食盐)

鉴别不同种类的微生物,如 根据微生物的代谢特 可用伊红-美蓝培养基鉴别 鉴别培 点,在培养基中加入 饮用水或乳制品中是否有大 养基 某种指示剂或化学药 肠杆菌(若有,菌落呈现黑 品 色,并带有金属光泽)

?3.无菌技术 ?(1)消毒和灭菌的区别
条件 较为温和 消毒 的物理或 化学方法 强烈的理 化因素 结果 仅杀死物体表面或内 常用的方法 煮沸消毒法、巴氏 消毒法、紫外线或 化学药物消毒法 灼烧灭菌、干热灭 菌、高压蒸汽灭菌

部一部分对人体有害
的微生物(不包括芽孢 和孢子) 杀死物体内外所有的 微生物,包括芽孢和

灭菌

孢子

?(2)无菌技术主要操作要求 ?①实验前应对操作空间、操作人员消毒,对所用 器具和培养基灭菌。 ?②实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作, 另外要避免已灭菌处理材料再次污染。

?特别提示 (1) 微生物最常用的碳源是糖类,尤 其是葡萄糖;最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。 ?(2)对异养微生物来说,含C、H、O、N的有机物 既是碳源,又是氮源、能源。 ?(3) 大凡对生长因子不能合成或合成能力有限的 微生物,其培养基中均需额外添加生长因子,而 许多微生物能自行合成生长因子,其培养基中不 需再添加。

培养基的制备与大肠杆菌的纯化技术
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤: 计算 →称量→ 溶化 → 灭菌 →倒平板。 (2)倒平板的过程:

①在火焰旁右手拿锥形瓶,左手 拔出棉塞 。
②右手拿锥形瓶,使锥形瓶的瓶口迅速通过 火焰 。 ③左手将培养皿打开一条缝隙,右手将培养基倒入培养皿,左 手立刻 盖上皿盖 。 ④待平板冷却凝固后,将平板 倒过来 放置,使皿盖在下、皿 底在上。

2.纯化大肠杆菌 (1)微生物接种的最常用方法是 平板划线法 和 稀释涂布平板法。

(2)平板划线法:通过 接种环在琼脂固体培养基表面连续划线 逐步稀释分散到培养基的表面 的操作,将聚集的菌种 。
(3)稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的 梯度稀释,然后将不同 稀释度的菌液分别 涂布到琼脂固体培养基的表面 ,进行 培养。当稀释倍数足够高时,即可获得 单个细菌形成的菌落



3.菌种的保存

为了保持菌种的纯净,需对菌种进行保藏。对于频繁使用的菌 种,我们可以采用 临时保藏 法;对于需要长期保存的菌种, 可以采用 甘油管藏 法。

?[思维激活2] 除平板划线法与稀释涂布平板法外, 还有哪些接种方法?微生物接种技术中最核心的 内容是什么? ?提示 微生物接种方法还有斜面接种及穿刺接种 等方法,所有微生物接种方法中最核心的内容是 “防止杂菌污染,保证培养物的纯度”。

1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 计算:依据牛肉膏蛋白胨培养基配方比例,计算配制 100 mL 的培养基时,各种成分的用量 称量:牛肉膏比较黏稠,可用称量纸称取,牛肉膏和蛋白胨都 易吸潮,称取时动作要迅速,称后要及时盖上瓶盖

加热 溶化:牛肉膏和称量纸+水― ― →取出称量纸― →加蛋白胨和氯化 钠― →加琼脂(注意:不断用玻璃棒搅拌防止糊底而导致烧 杯破裂)― →补加蒸馏水至 100 mL

? ??1?培养基:高压蒸汽灭菌 灭菌? ? ??2?培养皿:干热灭菌

倒平板:待培养基冷却至 50 ℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板

? 2.微生物分离与纯化技术 ? (1)原理 ? 微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样 品通过划线或涂布接种在固体培养基上,样品 中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单 个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上,经 培养后,即可得到一个微生物的纯种。

?(2)方法步骤 ?微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤 ?①梯度稀释操作(如图1)

?图1

微生物分离操作流程图

a . 将 分 别 盛 有 9 mL 水 的 6 支 试 管 灭 菌 , 并 按 101~106的顺序编号。 b.用移液管吸取1 mL已培养的菌悬液,注入第 二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头,吹 吸三次,使菌悬液与水充分混匀。 c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液,注入 102倍稀释的试管中,重复第 2步的操作。以此类 推,直到完成最后一支试管的稀释。 注意:移液管需要经过灭菌。操作时,试管口和 移液管应在离火焰1~2 cm处。

②划线或涂布 平板划线分离法:在近火焰处,左手拿皿底,右 手拿接种环,挑取大肠杆菌培养液在平板上划线, 常用的划线方法有平行划线和连续划线两种。平 行划线时,每转一个角度烧一次接种环。划线完 毕后,盖上培养皿盖,做好标记。

图2 划线示意图

涂布分离法:取3个平板,底面分别用记号笔写 上10-4、10-5和10-6三种稀释度,然后用无菌吸 管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL,放入 已标记好的平板上,用无菌玻璃涂棒在培养基表 面轻轻地涂布均匀,室温下静置5~10 min,使 菌悬液吸附进培养基(图3)。 ③培养 将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中 37 ℃培养16~24 h,即可长出单菌落(图4)

?图3 涂布法示意图

图4 斜面接种法

?(3)结果分析 ?①确认培养基制备是否合格 ?为确认培养基制备是否合格,需设置对照实验, 即接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入 37 ℃恒温箱中,培养12 h和24 h,观察现象并记 录——如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2 d 后无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,否 则实验失败需要重新制备。

?②接种操作成功的标准 ?如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基 本一致,并符合该菌菌落的特点,则说明接种操 作是符合要求的;如果培养基上出现了其他菌落, 则说明接种过程中无菌操作还未达到要求,实验 失败,需要分析原因,再次制备。

特别提醒

(1)进行划线时最后一区和第一区不可接触。

(2)平板划线各次灼烧接种环的目的。 平板划线操作第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌,划线操 作结束仍需灼烧接种环,每次灼烧目的不同。 第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束

避免接种环 灼烧杀死上次划线结束 划线结束后杀死接 后接种环上残留的菌 上可能存在 种环上残留的菌种 目的 的微生物污 种,使每 次划线的菌种 ,避免细菌污染环 染培养物 境和感染操作者 来自上次划线末端
(3)灼烧接种环之后,要冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死 菌种。

?[思维深化]几种常用灭菌方法比较(见下表)
方法 灭菌操作 适用对象 对接种环、接种针或其他金属 工具灭菌,也可以对试管口、 瓶口灭菌 耐高温且需保持干燥的物品, 如玻璃器皿和金属用具等 灼烧 在酒精灯火焰的充分燃烧 灭菌 层灼烧 干热 在干热灭菌箱内,160~ 170 ℃条件下,加热1~2 灭菌 h 高压 在高压蒸汽灭菌锅内,121 蒸汽 ℃,100 kPa,灭菌15~ 灭菌 30 min 紫外 线灭 菌

培养基、发酵设备等

30 W照射30 min

小型接种室、接种箱等

?[归纳提升](1)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与 皿底之间,否则此培养基不能用来培养微生物。 ?(2) 平板倒置原因:平板皿盖上会凝结水珠,培 养基表面的温度也较高,平板倒置后,既可使培 养基表面的水分更好地挥发,又可防止皿盖上的 水珠落入培养基,造成污染。 ?(3)两种纯化方法的比较

项目

优点

缺点 不能计数

适用范围 适用于好氧菌

平板划 可以观察菌落特征, 对混合菌进行分离 线法

吸收量较少,较 稀释涂 可以计数,可以观察 麻烦,平板不干 适用于厌氧菌 布平板 菌落特征 燥效果不好,容 和兼性厌氧菌 法 易蔓延

? 旁栏思考题 ? 1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被 其他外来微生物污染外,还有什么目的? ? 解析 许多微生物对人类是有害的,因此实 验室中无菌技术还能有效避免操作者自身被微生 物感染。 ? 答案 无菌技术还能有效避免操作者自身被 微生物感染。

? 2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或 灭菌。如果需要,请选择合适的方法。 ? (1)培养细菌用的培养基与培养皿。 ? (2)玻璃试管、烧瓶和吸管。 ? (3)实验操作者的双手。 ? 解析 消毒和灭菌是无菌技术的两项基本技 术,实践中需要根据无菌操作的对象合理地选择 使用。原则是既要考虑使用的效果,又要考虑无 菌操作对象的承受能力。 ? 答案 (1)、(2)需要灭菌;(3)需要消毒。

? 倒平板操作讨论题 ? 1.培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃左右时, 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度? ? 答案 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶, 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可以 进行倒平板了。 ? 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰? ? 答案 通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污 染培养基。

? 3.平板冷凝后,为什么要将平板倒置? ? 答案 平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝 固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置, 既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。 ? 4.在倒平板的过程中,如果不小心将培养基 溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用来 培养微生物吗?为什么? ? 答案 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培 养微生物。

? 平板划线操作讨论题 ? 1 . 为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环?在划线操作结束时,仍然需要 灼烧接种环吗?为什么? ? 答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线 前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种 环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的 菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线 次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少, 以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环,能 及时杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环

? 2.在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后 再进行划线? ? 答案 以免接种环温度太高,杀死菌种。 ? 3.在做第二次以及其后的划线操作时,为什 么总是从上一次划线的末端开始划线? ? 答案 划线后,线条末端细菌的数目比线条 起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能 使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少, 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

? 涂布平板操作讨论题 ? 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结 合平板划线与系列稀释的无菌操作要求,想一想, 第2步应如何进行无菌操作? ? 答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例 如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要 接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围; 等等。

? 练习 ? 1.提示 可以通过保持干燥、真空的条件, 以及冷藏等方法来阻止微生物的生长。 ? 解析 可以从微生物生长需要哪些条件的角 度来思考。例如,微生物的生长需要水、空气、 适宜的温度等。

?2. 提示 相同点:三种培养技术都需要为培养 物提供充足的营养。 ?不同点:无土栽培技术的操作并不需要保证无菌 的条件,而其他两种技术都要求严格的无菌条件。 ?解析 可以从这三种培养技术的原理、操作步骤 等方面分别进行总结归纳。

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

微生物的分离与计数

1.筛选菌株 生存环境 (1)自然界中目的菌株筛选的依据是根据它对 的要求, 到相应的环境中去寻找。 (2)实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利于 目的菌株 生 长的条件(包括营养、温度、pH等),同时 抑制 或 阻止 其他微 生物生长。

(3)选择培养基:在微生物学中,将允许 特定 种类的微生物生 长,同时 抑制 和阻止 选择培养基。 2.统计菌落数目 其他种类微生物生长的培养基,称作

(1)常用方法: 稀释涂布平板
(2)统计依据:当样品的 稀释度

法。
足够高时,培养基表面生长

活菌 的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个

。通过统计平

板上的菌落数,就能推测出样品大约含有多少活菌。 (3)平板选择菌落计数时一般选菌落数在 30~300 数公式为 每克样品中的菌落数=(C÷V)×M 的平板,计 。

3.设置对照 (1)对照实验:是指除了 被测试因素 以外,其他条件都相同

的实验。
(2)主要目的:排除实验组中 需以 牛肉膏蛋白胨

非测试因素 对实验结果的影响,

提高实验的可信度。例如为了确认培养基是否被杂菌污染, 培养基培养作为空白对照。

?[思维激活1] 上述的对照组培养基(牛肉膏蛋白胨 培养基)是否也需接种?如何确认所制备的选择培 养基的确起到了选择作用? ?提示 为确认培养基是否被杂菌污染时,对照组 的牛肉膏蛋白胨培养基不需接种。欲确认所制备 的选择培养基是否起到了选择作用,应同时对对 照组的牛肉膏蛋白胨培养基进行接种——若对照组 培养基中菌落种类明显复杂于实验组,则可确认 选择培养基的确起到了选择作用。

? 1.选择培养基的制作方法 ? (1)在培养基全部营养成分具备的前提下,加 入物质:依据某些微生物对某些物质的抗性, 在培养基中加入某些物质,以抑制不需要的微 生物,促进所需要的微生物生长,如培养基中 加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长,但 不影响金黄色葡萄球菌的生长,从而可将该菌 分离出来;而在培养基中加入青霉素时可抑制 细菌、放线菌的生长,从而分离得到酵母菌和 霉菌。

?(2) 通过改变培养基的营养成分达到分离微生物 的目的:培养基中缺乏氮源时,可分离自生固氮 微生物,非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生 存;培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法 生存,而自养微生物可利用空气中的 CO2 制造有 机物生存。 ?(3) 利用培养基的特定化学成分分离特定微生物: 如当石油是唯一碳源时,可抑制不能利用石油的 微生物的生长,使能够利用石油的微生物生存, 从而分离出能消除石油污染的微生物。

?(4)通过某些特殊环境分离微生物:如在高盐环 境中可分离耐盐菌,其他菌在盐浓度高时易失水 而不能生存;在高温环境中可分离得到耐高温的 微生物,其他微生物在高温环境中因酶失活而无 法生存。

?2.结果分析与评价
内容
有无杂菌污 染的判断

现象
对照的培养皿中无菌 落生长

结论
未被杂菌污染

培养物中菌落数偏高
菌落形态多样,菌落 数偏高

被杂菌污染
培养物中混入其他杂菌

选择培养基 的筛选作用 样品的稀释 操作
重复组的结果

牛肉膏培养基上的菌 落数目大于选择培养 选择培养基具有筛选作用 基上的数目
得到三个或三个以上 菌落数目在30~300 的平板 操作成功

若选取同一种土样,统计结果应接近

?特别提示 (1) 不同细菌的菌落在大小、形状、 光泽度、颜色、硬度、透明度等方面的特征不同, 可以作为菌种鉴定的重要依据。 ?(2) 进行活菌计数时,统计的菌落数往往比活菌 的实际数目低,这是因为两个或多个细胞连在一 起时,平板上观察到的只是一个菌落。 ?(3) 选择培养基一般只生长具有特定代谢特性的 微生物,鉴别培养基可以存在其他微生物,而且 能鉴别特定的微生物。

土壤中分解尿素的细菌的分离计数实

验操作与评价

1.实验设计 (1)土壤取样 ①土壤微生物大约70%~90%是 细菌 。

②细菌适宜在酸碱度接近中性 的 潮湿 土壤中生长,绝大 多数分布在距地表 3~8 cm 的土壤层。

(2)样品处理
菌落数目 ,选用一定稀 样品的 稀释程度 直接影响平板上生长的 释范围的样品液进行培养,保证菌落数在 30~300 数。 (3)微生物的培养与观察 将培养基平板放置于 30~37 ℃ 之间,便于计

温室中培养1~2d,每隔 24h 统 计一次 菌落 数目,最后选取数目 稳定 时的记录作为结果。
(4)细菌的计数 当菌落数目稳定时,取同一条件下的至少 3 个平板进行计数,求 出 平均值 ,并根据所对应的 稀释度 计算出样品中细菌的数目。

2.操作提示
(1)无菌操作 ①取土样的用具在使用前都需要 灭菌 。 ②应在 火焰 旁称取土壤。并在 火焰 附近将土样倒入锥形瓶 中,塞好棉塞。

③在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在 火焰 旁操作。
(2)做好标记

本实验使用的平板和试管比较多,为避免混淆,最好在使用前 做好标记 就 。

3.课题延伸

细菌合成的 脲酶 将尿素分解成 氨 ,使培养基的 碱性 增强。
在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入酚红 指示剂培养细菌, 若指示剂变 红 ,可确定该种细菌能够 分解尿素 。

?[思维激活2] 分离尿素细菌的培养基为何能起到 选择作用? ?提示 微生物的生长需要氮源,大多数微生物不 能直接利用尿素作氮源,但尿素细菌却可以尿素 作氮源,因此,在以尿素为唯一氮源的培养基中, 唯有能利用尿素的微生物方可生长繁殖,其他微 生物则不能生长繁殖而被淘汰,因而该培养基可 起到筛选尿素细菌的作用。

1.土壤中分解尿素的细菌的分离 (1)分离的原理 ①土壤中的细菌之所以能够分解尿素,是因为 它们体内能合成脲酶。这种物质在把尿素分解 成无机物的过程中起催化作用。 ②实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利 于目的菌株生长的条件 (包括营养、温度、 pH 等),同时抑制或阻止其他微生物生长。 ③分离分解尿素的细菌的培养基中的氮源只有 尿素,理论上只有能合成脲酶的微生物才能在 上面生长。

?(2)尿素细菌分离与计数的实验流程: ?土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→ 观察并记录结果→细菌计数

2.统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法 ①原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板, 在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。 ②方法:用计数板计数。 ③缺点:不能区分死菌与活菌。

(2)间接计数法(活菌计数法) ①原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面 生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活 菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品 中大约含有多少活菌。 ②操作 a.设置重复组:同一稀释度下,至少涂布3个平 板作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性。 分析结果时,需考虑重复组的结果是否一致,结 果明显不一致,意味着操作有误,需要重新实验。

b .为了保证结果准确,一般选择菌落数在 30 ~ 300的平板进行计数。 ③计算公式:每克样品中的菌株数=C/V×M,其 中 C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数, V代表涂布平板时所用的稀释液的体积/mL,M代 表稀释倍数。

特别提醒

进一步鉴别尿素细菌需在培养基中加酚红指示剂,若

此种菌存在,则会变红,原理是分解尿素的细菌能产生脲酶,该 脲酶 酶可催化下列反应:CO(NH2)2+H2O ― ― → CO2+2NH3。因产生 NH3使培养基碱性增强,pH升高,使酚红指示剂呈现红色反应。

[思维拓展] (1)利用选择培养基设计实验分离纯化微生物。 ①真菌:用含青霉素的培养基分离。 ②金黄色葡萄球菌:用含高浓度食盐水的培养基 分离。 ③固氮微生物:用无氮培养基分离。 ④自养型微生物:用含无机碳源的培养基分离。 ⑤光合细菌:用含无机碳源的培养基在无氧而有 光照的环境中分离。 ⑥厌氧型和兼性厌氧型微生物:用普通培养基在 无氧条件下分离。

⑦乳酸菌:用乳酸含量较高,pH较低的普通培养 基分离。 ⑧假单胞杆菌:用石油作为唯一碳源的培养基分 离。 (2)微生物分离与计数中两种对照组的作用: ①判断培养基中是否有杂菌污染,需将未接种的 培养基同时进行培养。②判断选择培养基是否具 有筛选作用,需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接 种后培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行 对比得出结论。

? 旁栏思考题 ? 1 . 想一想,如何从平板上的菌落数推测出每 克样品中的菌落数? ? 答案 统计某一稀释度下平板上的菌落数,最 好能统计 3 个平板,计算出平板上的菌落数的平 均值,然后按课本旁栏的公式进行计算。

? 2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀 释度?测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分 解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围相同吗? ? 答案 这是因为土壤中各类微生物的数量 ( 单 位:株 /kg) 是不同的,例如在干旱土壤中的上层 样本中,好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万,放 线菌数约为 477 万,霉菌数约为 23.1 万。因此, 为获得不同类型的微生物,就需要按不同的稀释 度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培 养的条件。测定土壤中细菌的总量和测定土壤中 能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围不相 同。

?练习(教材P26) ?1. 提示 菌落是单个微生物在适宜固体培养基 表面或内部生长繁殖到一定程度,形成肉眼可见 的、有一定形态结构的子细胞的群落。可以通过 稀释涂布平板法计算活菌的数目,其原理是培养 基上的一个菌落来源于一个活菌。 ?2. 提示 利用以尿素为唯一氮源的选择培养基 在无氧环境中培养牛瘤胃提取物,选择能够正常 生长的菌落即为分解尿素的微生物。

?解析 反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物,其 中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生 物多为厌氧菌,接触空气后会死亡,因此分离其 中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基 外,还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。

课题3 分解纤维素的微生物的分离

纤维素分解菌的筛选

1.纤维素酶 (1)组成:一种 复合酶,它至少包括三种组分,即 C1酶 、

Cx酶 和 葡萄糖苷酶 。
(2)作用

葡萄糖苷酶 C1酶、Cx酶 纤维素― ― ― ― ― ― ― →纤维二糖― ― ― ― ― ― →葡萄糖。

2.纤维素分解菌的筛选 (1)筛选方法: 刚果红染色 法。

(2)筛选原理:刚果红可以与纤维素形成 红色复合物 ,当纤维

素被 纤维素酶

分解后,刚果红——纤维素的复合物就无法形 成,培养基中会出现 以纤维素分解菌为中心的透明圈 ,
我们可以通过 是否产生透明圈

来筛选纤维素分解菌。

?[思维激活1] 纤维素分解菌的选择培养基中“选 择因子”是什么? ?提示 纤维素分解菌中唯一的碳源是 “ 纤维素 粉”,唯有能利用纤维素的微生物方可在该培养 基上生存,其他微生物将因缺乏碳源而无法生存, 以此,可筛选到纤维素分解菌。

?1.纤维素分解菌的筛选原理

?即:可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2.筛选过程中涉及的两种培养基 (1)纤维素分解菌的选择培养基 ①配方: 组分 纤维素粉 NaNO3 Na2HPO4·7H2O KH2PO4 MgSO4·7H2O KCl 酵母膏 含量 /g 5 1 1.2 0.9 0.5 0.5 0.5 提供的主要营养 碳源、能源

无机盐

生长因子、碳源、氮源

0.5 水解酪素 氮源、生长因子 将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL

②该培养基为液体培养基,利用液体选择培养基 可增加纤维素分解菌的浓度。 (2)鉴别纤维素分解菌的培养基 ①配方:
组分 含量 提供的主要营养 5~10 CMC-Na g 酵母膏 KH2PO4 琼脂 土豆汁 1g 0.25 g 15 g 100 mL

碳源
碳源、氮源、生长因子 无机盐 凝固剂 碳源

将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL

?②此培养基为固体培养基——在其中加入刚果红 可形成以纤维素分解菌为中心的透明圈,据此可 筛选到纤维素分解菌。

分离土壤中纤维素分解菌实验操作

1.分离纤维素分解菌的实验设计 (1)实验流程:土壤取样→ 选择培养

(此步可省略)→梯度稀释
的培养基上→挑选产生

纤维素分解菌 →将样品涂布到鉴别 透明圈
(2)土壤取样 采集土样时,可以选择 纤维素丰富 的菌落。

的环境。

(3)选择培养
①目的:增加纤维素分解菌的 浓度 所需要的 微生物 。 ,确保能够从样品中分离到

②选择培养:称取土样20 g,在无菌条件下加入装有30 mL培养 基的锥形瓶中,将锥形瓶固定在 摇床 上,在一定温度下振荡 培养1~2 d,直至培养液变 混浊 。也可重复选择培养。

③挑选菌落

a.刚果红染色法,挑选 产生透明圈 的菌落,一般即为分解纤维
素的菌落。 b.常用的刚果红染色法包括两种,一种是先 培养微生物 加入 刚果红 入刚果红。 颜色 进行 反应,另一种是在 倒平板 ,再 时就加

2.课题延伸
(1) 为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌,需要进行 发酵产纤维素酶 有 固体发酵 和 的实验,纤维素酶的发酵方法 液体发酵 两种。

(2)纤维素酶的测定方法 一般采用 对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖

进行定量测 定



?[思维激活2] 由“选择培养”实验操作过程请你 推测纤维素分解菌的异化类型是需氧型还是厌氧 型? ?提示 由选择培养操作中“将锥形瓶置于摇床上” 可推测纤维素分解菌的异化类型为需氧型。

?1.土壤中纤维素分解菌的分离流程

?2.两种刚果红染色法比较
项目 内容 培养基长出菌落→覆盖 10~15 min CR ― ― → 倒去CR→加 15 min 入NaCl溶液 ― ― → 倒掉 NaCl溶液→出现透明圈 配制CR溶液→灭菌→ 按照1 mL CR/200 mL 培养基比例混匀→倒平 板→培养→出现透明圈 方法一 方法二

过程

显示出颜色反应 优点 基本上是纤维素 分解菌的作用
操作繁琐,加入 缺点 刚果红会使菌落 之间发生混杂

操作简便,不存在菌落混杂问题 ①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类 物质,可能使产生淀粉酶的微生物也 形成透明圈,即假阳性反应;②有些 微生物具有降解色素的能力,它们会 降解刚果红形成透明圈,与纤维素分 解菌不易区分

?特别提醒 (1) 本实验方案中应设置普通培养基 (或牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照实验。 ?(2) 分离纤维素分解菌先经选择培养,其目的是 增加纤维素分解菌的浓度;然后经梯度稀释后, 再涂布到鉴别培养基上。

?[归纳提升](1)经选择培养后,再经梯度稀释,才 能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。 (2)富集培养可省略。(3)经稀释培养后,用刚果红 染色。(4)设置对照能证明经富集培养的确得到了 欲分离的微生物。

? 旁栏思考题 ? 1.本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同? ? 解析 本课题的选择培养可以提供目的微生物繁殖所需的条 件,增加选择培养可以使实验的成功率更高。 ? 答案 本实验流程与课题 2的流程的区别如下:课题 2是将土 样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上, 直接分离得到菌落。本课题通过选择培养,使纤维素分解菌得到 增殖后,再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。

? 2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维 素分解菌? ? 答案 由于生物与环境的相互依存关系,在 富含纤维素的环境中,纤维素分解菌的含量相对 较高,因此从这种土样中获得目的微生物的几率 要高于普通环境。

? 3.将滤纸埋在土壤中有什么作用?你认为滤 纸应该埋进土壤多深? ? 答案 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对聚集,实际上是人工设置纤维素分解菌生存 的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约 10 cm左右 腐殖土壤中。

? 4.想一想,这两种方法各有哪些优点与不足? 你打算选用哪一种方法? ? 解析 两种方法各有优缺点,实践中可以根 据需要选择不同的方法进行实验。 ? 答案 方法一是传统的方法,缺点是操作繁 琐,加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂;其 优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分 解菌的作用。方法二的优点是操作简便,不存在 菌落混杂问题,缺点是由于纤维素和琼脂、土豆 汁中都含有淀粉类物质,可以使能够产生淀粉酶 的微生物出现假阳性反应。

?但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为 模糊,因为培养基中纤维素占主要地位,因此可 以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另 一缺点是:有些微生物具有降解色素的能力,它 们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的 透明圈,与纤维素分解菌不易区分。

? 5.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生 物? ? 解析 这里的选择培养的实质是富集培养, 也就是提供了目的微生物生长繁殖的条件。 ? 答案 在选择培养的条件下,可以使那些能 够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖,而 那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制, 因此可以起到“浓缩”的作用。


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