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最新实验原理与方法2009


实验原理与方法
蔬菜生理与生态实验室

南京农业大学园艺学院 二零零九年十月

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1、氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD) 2、POD(过氧化物酶)活性的测定——愈创木酚法 3、CAT(过氧化氢酶)测定 4、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的

测定 5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定: 6、O2-产生速率的测定 7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法 8、丙二醛(MDA)含量的测定 9、还原型抗坏血酸(ASA)和脱氢抗坏血酸(DHA)的测定 10、谷胱甘肽还原酶测定 11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定 12、可溶性总糖的测定 13、考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋白含量 14、叶绿素含量的测定 15、石蜡制片的制作 16、激素 Indole-3-Acetic Acid(IAA) 、Abscisic Acid(ABA) 、GA3 和 ZA 的 测定 17、cDNA 扩增片段长度多态性技术(cDNA-AFLP)

18、3′/5′RACE 扩增基因全长 19、根系活力的测定(TTC法)

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氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD)

【实验原理】
SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的 SOD:Mn-SOD 和 Cu.Zn-SOD, 它们都催化下列反应:

由于超氧自由基(O2.-)为不稳定自由基,寿命极短,测定 SOD 活性一般为间接方法。 并利用各种呈色反应来测定 SOD 的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子 O2.-,当加入 NBT 后,在光照条件下,与超氧自由基反应生成单甲月 (黄 色 ) ,继而还 替 原生成二甲月 , 替 它是一种蓝色物质,在 560nm 波长下有最大吸收。当加入 SOD 时,可 以使超氧自由基与 H+结合生成 H2O2 和 O2,从而抑制了 NBT 光还原的进行,使蓝色二甲 月 生成速度减慢。 替 通过在反应液中加入不同量的 SOD 酶液, 光照一定时间后测定 560nm 波长下各液光密度值,抑制 NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应 液蓝色愈深,说明酶活性愈低。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 甲硫氨酸 4. EDTA-Na2 5. 核黄素 6. 氮蓝四唑(NBT) 7. 陶瓷小研钵 8. 4-5ml 离心管 9. 10ml 玻璃试管

(三)试剂
1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):

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A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4·12H2O(分子量 358.14)71.7g; B 母液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取 NaH2PO4·2H2O(分子量 156.01)31.2g。 分别用蒸馏水定容到 1000ml。 0.05mol/L PBS (pH7.8) 的配制: 分别取 A 母液(Na2HPO4) 228.75ml, 母液(NaH2PO4) B 21.25ml,用蒸馏水定容至 1000ml。 2. 14.5mM 甲硫氨酸溶液:称取 1.0818g Met 用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至 500ml。 3. 3mM EDTA-Na2 溶液:称取 0.1117g EDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 100ml。 4. 60μ M 核黄素溶液:称取 0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100ml,避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液:称取 0.092g NBT 用 PBS 定容至 50ml,避光保存。

【实验步骤】
1. 酶液提取 称取 0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三 次加入 1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上 研磨成匀浆,转入离心管中在 4℃、12000g 下离心 20min,上清夜即为 SOD 粗提液。 2. 酶活性测定 (1)反应混合液配制(以 60 个样为准):分别取配好的 Met 溶液 162ml,EDTA-Na2 溶 液 6ml, NBT 溶液 6ml,核黄素溶液 6ml,混合后充分摇匀; (2)分别取 3ml 反应混合液和 40μ l(可视情况调整)酶液于指形管中此即反应管; 同时做两支对照管,其中 1 支试管加 3ml 反应混合液和 40μ l PBS(不加酶液)作为最大 光还原管, 1 支加 3ml 反应混合液和 40μ l PBS 同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。 另 (3)将试管置于光照培养箱中在 4000 lux 光照 25℃下反应 20min; (4) 反应结束后以不照光的对照管调零, 分别测定各管在 560nm 下的吸光度 (OD560) 3. 计算结果 已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活单位 (U) 按下式计算活 , 性 n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2 SOD 总活性= [( Ack-AE )× V]/(1/2Ack× Vt) W× SOD 比活力=SOD 总活性/蛋白质含量 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g FW) ;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示; Ack 为照光对照管的吸光度;AE 为样品管的吸光度;V 为样品液总体积(ml) ;Vt 为测定 时的酶液用量(ml) ;W 为样品鲜重(g) ;蛋白质含量单位为 mg/g。

【注意事项】
1. 酶液提取须在 4℃下进行,提取后立即进行测定,冰箱中放几小时活性也会下降; 2. 植物中的酚类物质对测定有干扰,制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或

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pvpp 等,尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。 3. NBT 反应液配好后过滤除去不溶物立即使用,若置于冰箱中要避光保存,充分摇匀 然后使用。 4. 加反应液时最好在暗光下进行; 5. 核黄素产生 O2.,NBT 还原为篮甲潛都与光照密切相关,照光强度和时间要严格控 制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸,使箱内均匀光照约达 40μ molm-2s-1,同时使照光时间一 样,选择试管尽量一致,照光结束后测一个拿一个(最好晚上做) (温度高时照光时间缩 短,温度低时延长) ; 6. 测定活性时加入的酶量,以能抑制反应的 50%为佳。 (一个酶单位相当于引起反应 液达到半抑制时酶的用量,即以能抑制反应 50%的酶量为一个 SOD 酶活性单位。 ) (反应液中加酶液与 PBS 调零差异不大,反应液调零与其它两个则有一定差异。李合 生方法:2 支 CK 管均以缓冲液代替酶液。 )

【参考文献】
Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase. Improved assays and an assay applicable to acrylamide gel. Anal Biochem, 1971, 44: 276-287. Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53.



愈创木酚过氧化物酶(POD)活性的测定----愈创木酚法

【实验原理】
在过氧化物酶催化下,H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在 470nm 处有最 大光吸收,故可通过测 470nm 下吸光值变化测定过氧化物酶活性。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 2-甲氧基酚 4. 30%H2O2

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5. 陶瓷小研钵 6. 2ml 离心管

(三)试剂
1. 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0): A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4·12H2O(分子量 358.14)71.7g; B 母液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取 NaH2PO4·2H2O(分子量 156.01)31.2g。 分别用蒸馏水定容到 1000ml。 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)的配制:分别取 A 母液(Na2HPO4 )12.3ml 和 B 母液(NaH2PO4 ) 87.7ml 混匀即为 100ml PBS(0.2M,pH6.0);

【实验步骤】
1. 酶液提取 称取 0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三 次加入 1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上 研磨成匀浆,转入离心管中在 4℃、12000g 下离心 20min,上清夜即为酶粗提液。 2. 酶活性测定 (1)反应混合液的配制:取 50mlPBS(pH6.0,0.2M)缓冲液于烧杯中,加入 28μ l 愈 创木酚(2-甲氧基酚)于磁力搅拌器上加热搅拌,直至溶解愈创木酚溶解,待溶液冷却后 加入 19μ l30%的 H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。 (2)酶活性测定:取 3ml 反应液并加入 40μ l 酶液后测定 OD470 值在 40 秒的变化。以 PBS 代替酶液为对照调零, 3. 计算结果 以每 min OD 值变化(升高)0.01 为 1 个酶活性单位(u),按下式计算活性 。 POD 活性=(Δ A470×Vt)/(W×Vs×0.01×t) 酶液总体积(ml) ;Vs 为测定时取用酶液体积(ml) 。 (u/g FW) Δ A470:为反应时间内吸光度的变化;W 为样品鲜重(g);t 为反应时间(min);Vt 为提取

【注意事项】
1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶,应加热一段时间。加入 H2O2 前注意溶液冷却, 防止 H2O2 的挥发。 2. 由于该反应迅速,加入酶液要立即进行吸光值的测定。 参考文献
J.L. Mu? oz-Mu? F. Garcí oz, a-Molina, P.A. Garcí a-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. Garcí novas, J.N. a-Cá Rodrí guez-Ló pez, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry, Volume 113, Issue 2, 15 March 2009, Pages 435-444 F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vá zquez, B.E. Garcí a-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C. Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611

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【实验原理】

CAT(过氧化氢酶)的测定

过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶,它能催化 H2O2 分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。 2O2 在 240nm 处有一个吸收高峰,其吸光度 H 与 H2O2 的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而 降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
植物叶片等植物材料

(三)试剂
1 0.15mol/L 磷酸缓冲液 (pH7.0) 取 A 母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和 B 母液(NaH2PO4) : 146.25 ml 混合后用蒸馏水定容至 500ml。 2 0.3%H2O2: 吸取 0.5ml 30%的 H2O2,用 PBS (pH7.0)定容至 50ml。

【实验步骤】
1. 酶液提取 称取 0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三 次加入 1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上 研磨成匀浆,转入离心管中在 4℃、12000g 下离心 20min,上清夜即为 CAT 粗提液。 2 酶活性测定 (1)反应混合液的配制:取 100ml PBS(0.15M,pH7.0) ,加入 0.1546ml 30%的 H2O2 摇匀即可。 (2)取 2.9 ml 反应液加入 0.1ml 酶液,以 PBS 为对照调零,测定 OD240 值在 40s 内 的变化。 3 结果计算:酶活性计算:以每 min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位(u) 。 CAT=[Δ A240×Vt ]/(W×Vs×0.01×t) (u/g FW) Δ A240:为反应时间内吸光度的变化;W 为样品鲜重(g);t 为反应时间(min);Vt 为 提取酶液总体积(ml) ;Vs 为测定时取用酶液体积(ml) 。

【注意事项】

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H2O2 易分解,应现用现配。

【参考文献】
Aebi H (1984) Catalase in vitro. In: Packer L (ed) Methods in enzymology. Orlando, FL: Academic Press, pp 121–126


【实验原理】

抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定

AsA-POD 是叶绿体内专一的清除 H2O2 的酶, 催化抗坏血酸(AsA)与 H2O2 反应, AsA 使 氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA) 。随着 AsA 被氧化,溶液的 OD290 值下降,根据单位时 间内 OD290 的减少值,计算 AsA-POD 活性。AsA 氧化量按消光系数 2.8/(mmol/L)· cm(ε =2.8mM-1.cm-1)计算,酶活性用 ?mol AsA· g/FW· 表示。 h

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. EDTA-Na2 4. 抗坏血酸 5. 30% H2O2 6. 陶瓷小研钵 7. 2ml 离心管

(三)试剂
(按 50 个样计算) : 1. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)的配制:母液的配制方法同前取 A 母液 Na2HPO4 61.0ml,加入 B 母液 NaH2PO4 39.0ml,用去离子水定容到 400ml。 2. 0.1 mM EDTA-Na2: 0.0093g EDTA-Na2 用 PBS pH7.0) 取 ( 缓冲液定容到 250ml (372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g) ; 3. 5 mM AsA:取 0.044g 抗坏血酸用 PBS(pH7.0)缓冲液缓冲液定容到 50ml(现用 现配) ; 4. 20 mM H2O2:取 0.2ml30% H2O2 用去离子水稀释到 100ml。

【实验步骤】

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1. 酶液提取方法同 SOD. 2. 酶活性的测定(以 2 ml 体系测定) (1) (以 2 ml 体系测定)取 0.10 ml 酶液(可视情况调整) ,加入 1.70 ml 含 0.1 mM EDTA-Na2 的 PBS(0.05 mol/L,pH7.0) ,再加入 0.10 ml 5 mM 的 AsA,最后加入 0.10 ml 20mM H2O2,立即在 20℃下测定 OD290 值在 40s 内的变化,计算单位时间内 AsA 减少量和 酶活性(室温下测定,以不加 H2O2 为空白对照调零) 。 (2) 若以 3 ml 体系测定, 则取 0.10 ml 酶液 (可视情况调整) 加入 2.60 ml 含 0.1mM , EDTA-Na2 的 PBS 0.05 mol/L, ( pH7.0)再加入 0.15ml 5 mM 的 AsA, , 最后加入 0.15 ml 20mM H2O2,立即在 20℃下测定 OD290 值在 40s 内的变化 3. 酶活性计算 以 1min 内 A290 变 0.01 定义为一个酶活性单位 u,酶活性以 u/g(FW)表示 APX 活性(u/g)= △A290.VT/0.01VS.t.W △A290 表示在 290nm 处吸光值的变化 VT 提取液总体积;VS 酶液的体积;W 叶片的鲜重 ;t 反应时间

【注意事项】
加入 H2O2 后应混匀反应液然后快速进行比色测定。

【参考文献】
Nakano Y, Asada K. 1981.Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22, 867-880


【实验原理】

GR(谷胱甘肽还原酶)的测定

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 叶片或根系 2. GSSG 3. NADPH 4. Hepes

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(三)试剂
1. Hepes 缓冲液 (PH7.8):称取 Hepes 1.9155g,用蒸馏水定容至 200ml 2. 10mM GSSG:称取 18.3mgGSSG 溶于 3ml 蒸馏水中 3. 2.4mM NADPH:称取 4mgNADPH 溶于 2ml 蒸馏水中

【实验步骤】
1. 酶液提取 称取 0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三 次加入 1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上 研磨成匀浆,转入离心管中在 4℃、12000g 下离心 20min,上清液即为 GR 粗提液。 2. GR 测定 取样品上清液 0.1ml(3 次重复) ,放入试管中,加入 Hepes1700ul,NADPH 100ul 及 其 GSSG100ul 在 OD340 下测定。

【注意事项】
1. 酶液提取须在 4℃下进行,提取后立即进行测定,冰箱中放几小时活性也会下降; 2. 植物中的酚类物质对测定有干扰,制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或 pvpp 等,尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

【参考文献】
Hong Zhu, Zhuoxiao Cao, Li Zhang, Michael A. Trush, Yunbo Li(2007) Glutathione and glutathione-linked enzymes in normal human aortic smooth muscle cells: chemical inducibility and protection against reactive oxygen and nitrogen species-induced injury. Mol Cell Biochem 301:47–59. Wheeler CR, Salzman JA, Elsayed NM, Omaye ST, Korte DW (1990) Automated assays for superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, and glutathione reductase activity. Anal Biochem 184:193–199.


【实验原理】

O2-产生速率的测定

O2-与羟胺反应产生 NO2-,NO2-在对氨基苯磺酸和 α-萘胺作用下,生成粉红色的偶氮 染料,该染料在 530nm 处有最大光吸收,根据 OD530 可计算出样品中的 O2-的含量。

【仪器、材料与试剂】

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(一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 叶片或根系 2. 磷酸氢二钠 3. 磷酸二氢钠 4. 盐酸羟胺 5. 对氨基苯磺酸 6. α-萘胺 7. 冰醋酸

(三)试剂
1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS,pH7.8): A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4· 2O(分子量 358.14)71.7g; 12H B 母液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取 NaH2PO4· 2O(分子量 156.01)31.2g。 2H 分别用蒸馏水定容到 1000ml。 0.05mol/L PBS (pH7.8) 的配制: 分别取 A 母液(Na2HPO4) 228.75ml, 母液(NaH2PO4) B 21.25ml,用蒸馏水定容至 1000ml。 2. 10mM 盐酸羟胺:称取 0.05g 盐酸羟胺用蒸馏水定容至 100ml。 3. 17mM 对氨基苯磺酸:称取 0.2944g 对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液(冰醋酸:水=1: 3)定容至 100ml 4. 7mM a-萘胺:称取 0.1002g 萘胺用冰醋酸溶液(冰醋酸:水=3:1)定容至 100ml。

【实验步骤】
1. 酶液提取 称取 0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三 次加入 1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上 研磨成匀浆,转入离心管中在 4℃、12000g 下离心 20min,上清液即为酶-粗提液。 2. O2-产生速率测定 (1)取 0.5ml 提取液中加入 0.5ml PBS(0.05M,pH7.8),1ml 10mM 盐酸羟胺溶液后摇 匀,同时做一对照管以 PBS 代替样品提取液; (2)在 25℃下保温 1 小时,若测定叶片保温后需加入 2ml 乙醚萃取 Chl; (3)依次先加入 1ml 17mM 对氨基苯磺酸,再加入 1ml 7mMα-萘胺,混合后涡旋;

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(4)在 25℃下保温 20min 后在 3000g 离心 3min; (5)以对照管调零,取粉红色水相液测定 OD530。 3. 计算结果
根据测得的 OD530, NO2-标准曲线得到[NO2-], 查 依照羟胺与 O2-的反应式: 2OH+2O2-+H+NO2NH +H2O2 +H2O 计算[O2-],即[NO2-]×2=[O2-]。再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量, 求得 O2-产生速率(nmol min-1mg-1 蛋白,也可用 nmol min-1g-1 鲜重) 。

【注意事项】
1. 样品中若含有大量叶绿素将干扰测定,可在样品与羟胺温浴后,加入等体积的乙醚 萃取叶绿素,再加入对氨基苯磺酸和 α-萘胺作 NO2-的显色反应; 2. 应用羟胺反应来检测生物材料的含量,必须严格控制反应系统的 pH(<8.0,并尽 可能降低反应液中的溶解氧和 Fe 的含量。 因为羟胺自动氧化随反应系统的 pH 值升高而加 强,同时随反应液的溶解氧和 Fe 含量的增加而加强。

【参考文献】
Desen Ke, Guchou Sun, Zhengxun Wang (2007) Effects of superoxide radicals on ACC synthase activity in chilling-stressed etiolated mungbean seedlings. Plant Growth Regul 51:83–91. Wang AG, Luo GH (1990) Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants. Plant Physiol Commun 6:55–57.



碘化钾分光光度法测定过氧化氢(H2O2)的含量

【实验原理】
过氧化氢(H2O2)既是一种较强氧化剂,又是一种较弱还原剂。它存在范围广,化学性 质活泼,对生命体代谢、物质结构性能和环境保护等都有影响。过氧化氢可以与碘化钾 发生反应: H2O2+2KI→I2+2KOH I2 通常以 I3-的形式存在于水溶液中。 利用 I3-在 352nm 有吸收峰这一原理, 用分光光度 法测定过氧化氢,方法快速简便,干扰少,仪器普及。

【仪器、材料与试剂】 (一) 仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机 3.电子天平

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(二)材料
1. 三氯乙酸 2. 酒石酸 3. 碘化钾 4. 过氧化氢(30%) 5.1ml 移液枪 6.陶瓷小研钵 7.2ml 离心管 8.100ml 容量瓶

(三)试剂
1. 0.1% TCA:称取 0.1g 三氯乙酸,用蒸馏水定容于 100ml 容量瓶中。 2. 3. 4. 2%酒石酸溶液:称取 2g 酒石酸,用蒸馏水定容于 100ml 容量瓶中。 2.5%碘化钾溶液:称取 2.5g 碘化钾,用蒸馏水定容于 100ml 容量瓶中。 过氧化氢标准溶液:取含 H2O2 的 30%标准品过氧化氢 3ml,稀释至 1000ml,用 高锰酸钾标定,再分别稀释成 100、10、1 及 0.1mg/l 的过氧化氢标准溶液。

【实验步骤】
1. 1g 植物样品, 取 加入 0.5mL 的 0.1% TCA, 在液氮下研磨, 研磨后所得匀浆以 19000g 离心 20min。 2. 取上清液 0.5mL,加 2ml 1M KI 溶液和 0.5ml 100mM 硫酸钾的缓冲液,暗反应 1h; 3.反应结束后,以 0.1%的 TCA 为参比,测定在 390nm 处的吸光值; 4.标准曲线绘制:分别取浓度为 10.00mg/1 的 H2O2 使用液 0.00,1.00,2.00,3.00, 4.00,5.00ml 于 100ml 容量瓶中,分别加入 2ml 2%酒石酸溶液,2ml lM 硫酸溶液, 2ml 2.5%碘化钾溶液,用蒸馏水定容后,以试剂空白为参比于 352nm 处,用 1cm 比 色皿测定吸光度 A,作 A~ H2O2 浓度(mg/1)曲线。 5.通过已知浓度的过氧化氢标准曲线,计算样品中过氧化氢的含量。

【注意事项】
pH 值对吸光度有一定的影响,pH2~6 时吸光度最大且稳定,故实验采用酸度条件为 pH2~6。

【参考文献】
Chakrabarty D. and Datta S. K.Micropropagation of gerbera:lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities during acclimatization process.Physiol Plant,2008,(30):325–331

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【实验原理】

丙二醛(MDA)含量的测定

MDA 在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应,形成在 532nm 波长处有最 大光吸收的有色三甲基复合物。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 磷酸氢二钠 2. 磷酸二氢钠 3. 三氯乙酸 4. 硫代巴比妥酸 5. 陶瓷小研钵 6.10ml 离心管

(三)试剂
1. 5%的三氯乙酸 (TCA) 溶液: 称取 5g 三氯乙酸用少量蒸馏水溶解后定容于 100ml 容量瓶中; 2. 0.67%(w/v)硫代巴比妥酸(TBA)溶液:称取 0.67g 硫代巴比妥酸用 10%三氯 乙酸溶液溶解后定容于 100ml 容量瓶中。

【实验步骤】
1. 取 0.5g 样品(叶片或根系)剪碎放入研钵中,加入 5ml 5%TCA 溶液研磨成匀浆后 转入离心管中在 3000r/min 下离心 20min; 2. 取上清液 2ml 于离心管中, 加入等体积的 0.67%TBA (硫代巴比妥酸) 混和后在 100℃ 沸水浴中煮 30min,用冷水迅速冷却后在 3000 r/min 下离心 10min; 3. 取上清液在 450nm、532nm、600nm 下测 OD 值(用去离子水调零) ; 4. 计算组织中 MDA 含量: MDA 浓度 C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450 MDA 含量(umol/g FW)=C×V/W 式中 V 为提取液体积(1.8ml),W 为样品鲜重(0.5g)。

【注意事项】
煮沸后要再进行一次离心

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【参考文献】
Kumar G N M, Knowles N R. Changes in lipid peroxidation and lipolytic and free-radical scavenging enzyme activities during aging and sprouting of potato (Solanum tuberosum) seed-tubers. Plant Physiol, 1993, 102: 115-124



还原型抗坏血酸(ASA)和脱氢抗坏血酸(DHA)的测定

【实验原理】
抗坏血酸又名维生素 C,以两种形式存在于植物中,即还原型抗坏血酸(Ascorbic acid , AA)和脱氢型抗坏血酸((Dehydroascorbic acid,DHA)。这两种形式可通过氧化还原而互变, 因而都具有生理活性。抗坏血酸可以将金属离子还原,使之产生稳定的有色溶液。最通用 的是抗坏血酸将 Fe3+还原成 Fe2+,加入螯和剂后,Fe2+即显色,在络和物最大吸光处测定 吸光度,其吸光值同抗坏血酸的浓度成正比。该法可以同时测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸 的含量,脱氢抗坏血酸用二硫苏糖醇还原成抗坏血酸,通过还原前后吸光值的差值对两种 物质定量。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机 3.电子天平

(二)材料
1. 偏磷酸 2.磷酸氢二钠 3.磷酸二氢钠 4. 三氯乙酸 5.正磷酸 6.红菲罗啉 7.氯化铁 8.1ml 移液枪 9.陶瓷小研钵 10.2ml 离心管 11.5ml、100ml、1000ml 容量瓶

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(三)试剂
1. 5%的偏磷酸:称取 5g 偏磷酸(HPO3) ,定容于 100ml 容量瓶中。 2. 150mmol/L 磷酸缓冲液(PBS,pH7.4): : A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4·12H2O(分子量 358.14)71.7g; B 母液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取 NaH2PO4·2H2O(分子量 156.01)31.2g。 3. 10% TCA:称取 0.5g 三氯乙酸,用蒸馏水定容于 5ml 容量瓶中。 4.44%正磷酸:称取 2.2g 偏磷酸(H3PO4) ,用蒸馏水定容于 5ml 容量瓶中。 5.0.5%BP-乙醇:称取 1.5g 红菲罗啉(BP) ,用无水乙醇定容于 5ml 容量瓶中。 6.0.3%FeCl3:98L 称取 0.3g 氯化铁,用蒸馏水定容于 100ml 容量瓶中。

【实验步骤】
1.称取 1g 植物材料置于研钵中,加入 5mL 的 5%的偏磷酸,在 4℃下下研磨,所得匀浆 于 22000g 离心 15 min。 2. 收集上清液用于测定(AsA+DHA)和 AsA 的含量。取 0.3 mL 上清液,加入 0.75 mL 含 5 mmol.L-1EDTA 的磷酸缓冲液(150 m mmol.L-1,pH 7.4)和 0.15 mL 10 mmol.L-1 的二硫苏 糖醇溶液(DTT) 。 3. 室温下放置 10 min 后,加入 0.15 mL 0.5% N-乙基马来酰亚胺以消除多余的 DTT。 4.加入 0.6 mL 的 10%三氯乙酸(TCA)、0.6 mL 的 44%正磷酸溶液、0.6mL 的 0.5%BP-乙 醇溶液和 0.15 mL 的 0.3%(W/V)FeCl3 溶液。混匀后 40℃水浴 40 min,测 525 nm 处的 吸光值。 5.AsA 的测定过程中以 0.3 mL 水代替 DTT 和 N-乙基马来酰亚胺,其余操作步骤如上所述。 DHA 为总抗坏血酸与 AsA 的差值。

【参考文献】
Zhang J, Kirkham M B . Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seedlings.New Phytologist,1996,( 132): 361-373

十 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性的测定
【实验原理】
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)可使过氧化物(如 H2O2,ROOH 等)还原为相应的氧化物:

GPx 的活力可用单位时间内催化 GSH 氧化的减少量表示。GSH 可和二硫代对二硝基

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苯甲酸(DTNB)反应生成黄色的 5-硫-2-2 硝基苯甲酸阴离子,在 412 nm 处有最大光吸收,测定 该离子的浓度,即可计算出 GSH 减少的量。

由于上述反应在非酶条件下仍能进行,故计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的 GSH 减少量。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机 3.电子天平 4. 水浴锅

(二)材料
1.谷胱甘肽(GSH) 2.磷酸氢二钠 3.磷酸二氢钠 4. 三氯乙酸 5.5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB) 6.过氧化氢(H2O2) 7.柠檬酸 8.移液枪 9.陶瓷小研钵 10.离心管 11.5ml、100ml、1000ml 容量瓶

(三)试剂
1.pH7.8 磷酸缓冲液 A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4·12H2O(分子量 358.14)71.7g; B 母液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取 NaH2PO4·2H2O(分子量 156.01)31.2g。 0.05M A 母液 pH7.8 228.75ml+ B 母液 21.25ml→定容至 1000ml

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2.1.0mmol/LGSH(当日配制) 3.07mgGSH 用 PBS 溶解至 10ml. 3.1.5 mmol/L H2O2(当日配制)取 30% H2O215ul,以双蒸水定容至 100ml 4.0.61 mmol/L 的三氯乙酸(TCA) 5.0.32mol/L Na2HPO4 6.5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)显色液:DTNB20mg 加 1%柠檬酸三钠 50mL 溶解

【实验步骤】
加入酶提取液 1.6mL,冰浴研磨匀浆,4000rpm,离心 10min,取上清液再 12000rpm,离 心 5min,上清液供酶活性测定用。取上述酶液 0.4ml,分别注入酶管与非酶管,并将非酶 管加热失活, 分别加入 1.0 mmol/LGSH 0.4mL 和经 37℃预热的 H2O20.2mL, 立即记时 3min, 再在 2 支试管中加入 0.61 mmol/L 的三氯乙酸(TCA)4mL,3000rpm,离心 10min,保留上 清液,另取 2 支试管分别加入上述上清液 2.0mL;再取 1 支试管加入蒸馏水 1mL 和 TCA1.6mL 作空白管,并在以上 3 支试管中分别加入 0.32mol/L 的 Na2HPO4 2.5 mL 和 5, 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)显色液 0.5 mL(显色液内含有 0.04%DTNB 和 1% 柠檬酸三钠) ,反应 5min,在 412nm 处比色读取光密度值。活性单位为 umol-1g-1FW。 标准曲线制作: 取 1mrnol/LGSH 溶液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml,以双蒸水稀释至 10ml, 即得到浓度为 0、20、40、60、80、100umol/L 的 GSH 标准液,取标准液各 2.00ml,移入 试管中,加 0.32mol/LNa2HPO4 溶液 2.5ml 和 DTNB 显色液 0.5ml,反应 5min 于 412nnl 波 长读取光密度(双蒸水调零)。 以扣除非酶促反应后, 37℃反应每分钟每克蛋白使 GSH 降 在 低 1umol 为一个酶活力单位,单位为 umol/mg 蛋白质·min。 。 5.计算方法:

A=标准 GSH(um)/标准 GSH(OD412)即标准曲线的斜率

【参考文献】
Leopold F lohe,Wolfang AG.Assay of glutathione peroxidase in methods of Enzymology.1984,105:104-121.

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十一 MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定(Mustafa Erkan and Wen-Chi Hou ,2008,1999 ) 1. MDAR 提取: 一般取 0.2g 材料于预冷的研钵中, 分三次加入 0.05mol/L (PH7.3) 的磷酸钾缓冲液(预冷)1.8ml(难磨的材料可以加入适量的石英砂) ,在冰浴上研磨至匀 浆, 然后移到 2.0ml 的离心管 (冲洗) 于 4℃12000r/min 下离心 20min, , 上清液即为 MDAR 粗提液,将其放入冰箱中备用(-20℃或-80℃,在液氮中迅速冷却) 。 2. MDAR 的测定: 酶活性的测定的反应体系包括: 2.7ml 的预冷磷酸钾缓冲液 (0.05mol/L,pH7.3)+0.1ml 的 NADH(0.2mmol/L)+0.1ml 的 ASA(1.0mmol/L)+0.001ml 的 AAO(1.0U)+0.1ml 的酶提取液,以不加酶液的体系为对照,在 340nm 下测 OD 值的 变化。 参考文献:Wen-Chi Hou, Hsien-Jung Chen, Yaw-Huei Lin, Dioscorins, the major tuber storage proteins of yam (Dioscorea batatas Decne), with dehydroascorbate reductase and monodehydroascorbate reductase activities,Plant Science, Volume 149, Issue 2, 3 December 1999, Pages 151-156 Mustafa Erkan, Shiow Y. Wang, Chien Y. Wang , Effect of UV treatment on antioxidant capacity, antioxidant enzyme activity and decay in strawberry fruit,Postharvest Biology and Technology, Volume 48, Issue 2, May 2008, Pages 163-171

十二.可溶性总糖的测定 【实验原理】
实验采用蒽酮比色法测定可溶性总糖的含量。糖在硫酸作用下生成糖醛,糖醛与蒽酮 作用形成绿色络合物,在一定范围内,颜色深浅与糖含量有关。在 625nm 波长下的 OD 值 与糖含量成正比。方法简单,但没有专一性。

【仪器、材料与试剂】
(一)仪器 1. 分光光度计 2. 恒温水浴锅 3. 分析天平 4. 烘箱 5. 刻度试管 (二)材料 1. 活性炭 2. 3. 4. 5. 刻度试管、 漏斗 酒精(20%) 植物叶片或种子

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6. 滤纸 (三)试剂 1. 葡萄糖标准液:80℃烘箱烘至恒重的葡萄糖 100mg,配成 500ml 溶液,即为 200μ g/ml 的标准液, 2. 蒽酮试剂:100mg 蒽酮溶于 100ml 稀硫酸(76ml 浓硫酸加 30ml 水中) 。 3. 酒精(20%) :20ml 酒精溶解至 100ml。

【实验步骤】
1. 可溶性糖的提取 各种植物叶片或种子在 110℃烘箱中烘 15min,然后调至 70℃过夜。干叶片磨碎后称 取 50mg 样品倒入 10ml 刻度试管内, 加入 4ml80%酒精, 置于 80℃水浴中不断搅拌 40min, 离心,收集上清液,残渣加 2mll80%酒精重复提取 2 次,合并上清液。在上清液中加 10mg 活性炭,80℃脱色 30min,定容至 10ml,过滤后取滤液测定。 2. 显色及比色 吸取上述酒精提取液 1ml, 5ml 蒽酮试剂混合, 加 沸水浴煮 10min, 取出冷却。 625nm 在 处测 OD 值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。 3. 绘制标准曲线 取标准糖溶液将其稀释成一系列 0-100μ g/ml 的不同浓度的溶液。按上述方法分别测 定 OD 值,然后绘制标准曲线。

【参考文献】
1. Fairbairn N J. A modified anthrone reagent [J].Chem.and Ind., 1953(4):86 2. 中国科学院上海植物生理研究所,上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南[M]. 北京:科学出版社, 1999. 127

十三. 葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖的测定 【实验原理】
糖类的测定方法种类甚多,常规的化学反应法只能测定总糖和还原糖,运用乙腈作 为流动相,当其中所含的混合物(包含糖类)经过固定相时,就会与固定相发生作用,由 于混合物中各糖类组分在性质和结构上的差异,在流动相的作用下,不同糖类组分在固定 相中的保留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出,实现分离。

【仪器、材料与试剂】
(一)仪器 1. 高效液相色谱仪 2. 高压泵 3. 示差折光检测器 4. 电子分析天平

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5. 离心机 (二)材料 1. 研钵 2. 10ml 离心管 3. 100ml 容量瓶 4. 0.45μ m 微孔滤膜 (三)试剂 1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 乳糖 以上均为分析纯 5. 乙睛为进口色谱纯 6. 超纯水

【实验步骤】
1. 将样品洗净、擦干、切碎、混匀。 2. 称取 5.00g 于研钵中,加入 5ml 的蒸馏水研磨匀浆,用 10ml 蒸馏水将匀浆全部移入离 心管中,3000r/ min 离心 5 min。 3. 离心液倒入干净试管中,再向盛有沉淀的离心管加入 10ml 蒸馏水并搅拌沉淀物,离心, 合并离心液于 100ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度。 4. 稀释液再用微孔滤膜(0.45μ m)过滤,备 HPLC 分析用。 5. 标准曲线的制定:精密配制 4 种糖组分的混合标准溶液,按上述操 作条件分离检测,以质量浓度(X ,g/L)为横坐标,色谱峰峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线, 得 4 种糖组分标准曲线的回归方程及相关系数。

【注意事项】
1. 色谱分析时,折光示差检测器对环境的温度比较敏感 ,温度变化明显 ,基线会出现漂移 或波浪起伏。故实验室的温度控制在 25±1℃,尽量避免大的变化。 2. 色谱条件根据具体实验情况设定。

【参考文献】
1. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Official methods of analysis of the AOAC (14th edition)[R],AOAC,Arlington VA,1984 2. W.Schwald , R.Concin, G.Bonn , O.Bobleter. Analysis of oligomeric and monomeric carbohyd-rates from hydrothermal degradation of coton- wastematerials using HPLC and GPC [J]. Chromatographia, 1985,20(1): 35-40.

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十四
【实验原理】

考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋白含量

考马斯亮蓝 G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法 的一种。该染料在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青 色,前者最大光吸收在 465 nm,后者在 595 nm。在一定蛋白质浓度范围内(1~1000 ?g) , 蛋白质与色素结合物在 595 nm 波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的 定量测定。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机

(二)材料
1. 叶片或根系 2. 磷酸氢二钠 3. 磷酸二氢钠 4. 考马斯亮蓝 G-250 5. 95%乙醇 6. 85%磷酸

(三)试剂
1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS,pH7.8): A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液: 取 Na2HPO4· 2O(分子量 358.14)71.7g; 12H B 母液:0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取 NaH2PO4· 2O(分子量 156.01)31.2g。 2H 分别用蒸馏水定容到 1000ml。 0.05mol/L PBS (pH7.8) 的配制: 分别取 A 母液(Na2HPO4) 228.75ml, 母液(NaH2PO4) B 21.25ml,用蒸馏水定容至 1000ml。 2. 考马斯亮蓝溶液:称取 100 mg 考马斯亮蓝,溶于 50 ml 95%乙醇中,加入 100 ml 85%(W/V)的磷酸,再用蒸馏水定容到 1L。在黑暗中静置 2 小时后用漏斗过滤并贮于棕 色瓶中,常温下可在暗中保存一个月。

【实验步骤】
1. 酶液提取 称取 0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中,分三 次加入 1.6ml (0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml)50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上 研磨成匀浆,转入离心管中在 4℃、12000g 下离心 20min,上清液即为蛋白粗提液。

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2. 酶活性测定 取 100?l 酶液,加入 2.9ml 考马斯亮蓝溶液,反应 2min 后测 OD595。 3. 计算结果 蛋白质含量(mg/g)=(查得的蛋白质含量/ug× 提取液总体积/ml)/(样品鲜重/g× 测定 时所用提取液体积/ml) Protein content(mg/g)=(C/ug× VT/ml)/(W/g× Vs/ml× 1000) C 为可溶性蛋白质含量(mg/g ) ,VT 为提取液总体积(ml) ;Vs 为测定时所用提取液 体积(ml) ;W 为样品鲜重(g) 。

【注意事项】
还原物质,其他酚类物质及柠檬酸对此反应有影响。

【参考文献】
Arora R.,Wisniewski M.E.1994.Cold acclimation in genetically related(sibling)deciduous and evergreen peach:A 60-kDa bark protein in cold-acclimated tissue of peach is heat-stable and related to the dehydrin family of proteins.Plant Physiol.,105:95-101. Brady,C.J.,Tung,H.F.:Rate of protein synthesis in senescing,detached wheat leaves.Aust.J. Plant Physiol.2,163-176(1975).

十五
【实验原理】

叶绿素含量的测定

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长下测定其 吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。叶绿素 a、b 在 95%乙醇中最大吸收 峰的波长分别为 665nm 和 649nm,类胡萝卜素为 470nm,可据此列出以下关系式: Ca=13.95 A665-6.88 A649 Cb=24.96 A649-7.32 A665 Cx.c=(1000 A470-2.05 Ca-114.8 Cb)/245 式中:Ca、Cb 分别为叶绿素 a 和 b 的浓度;Cx.c 为类胡萝卜素的总浓度。 试剂及配制: 95%乙醇

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 电子天平

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(三)试剂
95%乙醇

【实验步骤】
1. 2. 3. 4. 取新鲜植物叶片(或其他绿色组织) ,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉) ,混匀。 称取待测剪碎的新鲜样品 0.1g(可调整) ,共 3 份,分别置于试管中。每个试管加入 将叶绿素色素提取液倒入比色杯内,以 95%为对照调零,在波长 665nm、649nm 和 按上面的公式分别计算叶绿素 a、b 和类胡萝卜素的浓度(mg/L) ,a+b 即得叶绿素总

5ml 95%乙醇,使样品完全浸泡在乙醇溶液中。置于暗处浸泡 24h 后,进行比色测定。 470nm 下测定吸光度。 浓度。求得色素的浓度后,再按下式计算组织中单位鲜重的各色素的含量: 叶绿体色素的含量=(色素浓度×提取液体积)/样品鲜重 单位 mg/g

【参考文献】
Arnon D L. Copper enzymes in isolated chloroplasts, polyphenol oxidase in Brta vulgaris, Plant Phsiol., 1949,24:1-15.

十六.激素 Indole-3-acetic Acid(IAA) 、Abscisic Acid(ABA) 、GA3 和 ZA 的 测定

【实验原理】
植物激素可以被 80%的甲醇浸提,通过减压蒸馏去除甲醇,水相中的部分杂质在石油 醚萃取和 PVPP 吸附等环节中去除而植物激素得到保留。 在酸性条件下水相中的 IAA、 ABA 和 GAs 被乙酸乙酯萃取而 CTKs 不受影响,在微碱性条件下水相中的 CTKs 可被水饱和正 丁醇萃取而得到分离。

【仪器、材料与试剂】
(一)仪器: 1. 液相色谱仪 2. 紫外检测器 3. 旋转蒸发仪 4. 真空泵 5. pH 计 6. 离心机

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(二)材料: 1. 生长素、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素标准样品 2. 色谱甲醇 3. 石油醚(沸程 30~60℃) 4. 乙酸乙酯 5. 水饱和正丁醇 6. 乙酸 7. 超纯水 8. PVPP 9. 液氮 10. 研钵 11. 15ml 试管 12. 注射器 13. 超微滤膜 14. 分液漏斗 (三)试剂: 1. 80%甲醇:80ml 甲醇超纯水稀释至 100ml 2. 1mol/L 柠檬酸:21.014g 超纯水定容至 100ml 3. 0.5mol/L 氢氧化钠:2.00g 超纯水定容至 100ml 4. 水饱和正丁醇: 将正丁醇和蒸馏水混合,振摇,混匀,放置过夜(可利用超声,这样不 必过夜) 。得到的混合液分层,上层为水饱和的正丁醇溶液,下层为正丁醇的饱和水溶液。

【实验步骤】
1、 取样品 1-2g 弱光下用液氮研磨匀浆后,加入 80%甲醇(体积 ml 是样品质量 g 的 10 倍)10ml,于 4℃下浸提 24h,4000rpm 离心 15min。 2、 残渣再用 10ml 80%甲醇浸提 12h 后, 4000rpm 离心 15min。 合并两次上清液, 35-38℃ 下减压浓缩至原体积的 1/3,用等体积石油醚萃取脱色三次,分液,醚相弃去。 3. 水相用磷酸缓冲液(NaH2PO3)调 pH 到 8.0,加入 0.4g PVPP,低温震荡 30min,过滤。 滤液用 1M 柠檬酸调 pH 到 2.8–3.0,加入等体积的乙酸乙酯萃取三次,合并乙酸乙酯相加 压浓缩至干,用 5ml 甲醇溶出。经 0.45μ m 有机系滤膜过滤,作为待测液 HPLC 检测。 4. 水相用 0.5mol/L 的 NaOH 调 pH 到 8.0,等体积水饱和正丁醇萃取 3 次,合并 3 次正丁 醇相,55—60℃加压浓缩至干,5ml 甲醇洗出。经 0.45μ m 有机系滤膜过滤,作为待测液 HPLC 检测。 5. 标准曲线的制作: 称取 IAA、 3、 GA ABA 和 ZA 标准品各 10 mg 分别用甲醇定容于 10 ml 容量瓶中,作为母液(含量为 1000 mg·L-1) 。将此母液稀释成不同浓度梯度的溶液,将各

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溶液在确定的色谱条件下进样,外标法计算峰面积,制作标准曲线。

【注意事项】
1、第一次减压浓缩时要控制提取液中甲醇的量,过多时萃取效果不理想,完全蒸掉只剩 水相时又不易分层。 2、萃取过程中要振荡充分,分相清晰以及防止因渗漏造成的损失。 3、调节溶液 pH 值一般用弱酸、弱碱,注意滴加速度不能过快且须不断摇动,以免局部酸 化引起某些激素破坏。 4、在用乙酸乙酷萃取时,注意提取液中的甲醉要彻底去除,否则影响分层。

【参考文献】
1. B. Ferná ndez, M.L. Centeno, I. Feito, R. Sá nchez-Tamé and A. Rodrí s guez, Simultaneous analysis of cytokinins, auxins and abscisic acid by combined inmunoaffinity chromatography, high performance liquid chromatography and inmunoassay, Phytochem. Anal. 1995 (6):49–54. 2.陈昆松,徐昌杰,李方,等.HPLC 法检测果实组织中内源 IAA、ABA 方法的改进[J].果树学 报,2003,20(1):4-7 3.丁静,沈镇德,方亦雄,等.植物内源激素的提取分离和生物鉴定[J].植物生理学通讯,1979 (2):27-39

十七. 石蜡切片的制作

【实验原理】
石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。 它可以使植 物材料切成薄的薄片,又可以切成连续薄片,切片经染色,观察效果甚好。番红 -固 绿对染法,为植物制片上最普遍的一种二重染色法,其染色程序简单并能清晰地显示 出细胞的结构。番红为碱性染料,能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色;固绿为酸 性染料,能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。活的细胞或组织多为无色透明,各 种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别出;组织离 开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、 石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,而能清晰辨认其形态结构。

【仪器、材料与试剂】
(一)仪器 1. 石蜡切片机

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2. 烘箱 3. 显微镜 4. 电热展片台 (二)材料 1. 染色缸 2. 小培养皿 3. 镊子 4. 毛笔 5. 吸水纸 6. 纱布 7. 载玻片 8. 盖玻片 9. 纸盒 10. 酒精灯 11. 指形管 12. 圆刃解剖刀 13. 记号笔 14. 试管架 (三)试剂 1. 10%番红溶液(85%酒精配制) :10g 番红溶于 100ml85%酒精; 2. 0.5%固绿(用 95%的酒精配制) :0.5g 固绿溶于 100ml95%酒精; 3. 酒精(100%、95%、85%、75%、50%) 4. 二甲苯 5. 甘油 6. 中性树胶 7. 甲醛 8. 乙酸 9. 不同熔点的石蜡、 10. 蛋清甘油:鸡蛋清 50ml,甘油 50ml,水杨酸纳 1g,用蛋白与甘油搅拌,同时加入水 杨酸纳,调匀过滤应用。

【实验步骤】
1. 取材 选取经过自己设计实验的对照和处理的材料的根、茎、叶的相同部位。 2. 固定和抽气 固定液为 FAA(70℅酒精 90ml+冰醋酸 5ml+甲醛 5ml) ,重复 3 次,材料的长和宽最

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大不超过 1cm,固定液为材料的 20 倍左右。将选取的材料分装两试管,加入固定液。固定 时间 24 小时,其间要放入抽真空机中抽气 15-30 分钟至材料完全沉浸在固定液下面,并用 铅笔写好标签。 3. 脱水、透明及渗蜡 将材料从固定液中取出后,其具体流程如下: A:酒精 X:二甲苯

75%A(1/2-3h)→85%A(1/2-3h)→95%A(1/2-3h)→100%A(1h)→100%A(1h) →2/3A+1/3X(2h)→1/2A+1/2X(1-3h)→1/3A+2/3X(2h)→X(2h)→1/2X+1/2 蜡(过 夜)→渗蜡 1(2h)→渗蜡 2(2h)→渗蜡 3(2h) 设置浓度梯度是为了防止材料皱缩,但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定, 对于幼嫩的材料,梯度要大些,各步浸泡时间可短些,老的硬的梯度则要小些,各步浸泡 时间则相应要长些。第二次 100%A 脱水很关键,一定要确保水脱尽。 4. 包埋 将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒(小纸盒折叠方法如下) ,用加热的镊子迅速 把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直,倒入纯蜡进行包埋。稍微凝固后 倒置于清水盆中彻底冷却凝固。 折纸盒按下列顺序折叠: (1) 折 AA'及 BB'; (2) 折 CC'及 DD'; (3) 折 CE'与 AE'、向外夹出 EE'。同样折出 FF',GG'及 HH'; (4) 使 CE'E 与 E'IE 两三角形相叠,并沿 E'C 和 EI 重叠的折痕向后转折。同样折其余三只 角; (5)折 RIJF 向外,同样折出 GKLH,即折成所需的纸盒。

5. 修块 将包埋好的材料切割成小块,每个小块包含一个材料,并修成梯形,切面在梯形的上 部。注意上部矩形对边平行,梯形底部用烧热的蜡将其固定在木块上。 6. 切片

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将粘有蜡块的小木块至于切片机上,调整切距到适当大小,转动调节器条切片厚度 12?m 进行切片。注意切片时要一手转动切片机,另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形 成一长条蜡带。切片过程中,如果蜡带偏向一边,也要及时修正。 7. 烫片 滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央,用干净的手指涂抹均匀后,滴上清水,将取下 的蜡带切成小段置于载玻片上 (放上两至三段)然后将载玻片放到展片台上(保持 40℃) , 烫片。 待充分烫平后用吸水纸吸去多余的水。 烫片时要注意把握时间,不能烫片过度,但要保 证充分烫平。 8. 烘片 将烫好的片子自然烘干,或 45℃烤片箱干燥 1~2 天。 9. 脱蜡、染色、脱水、透明 将玻片标本放于 100%X(15-30min)→100%X(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→ 100%A(1-2min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红(85%A 配制)(2-4h)→85%A(3-5s) →95%A(3-5s)→固绿(100%A 配制)(30s)→95%A(1-2min)→100%A(1-2min)→ 100%A(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%X(1-2min)→100%X(1-2min) 注意番红染色时间要长些(至少 3h 以上) ,随后的两次经过酒精的时间都应很短,以免洗 掉染上的番红,固绿的染色时间大约在 20-30s,其他各步的时间大约 1 至 2 分钟,均要视具 体情况而定。 10. 封片 从二甲苯中取出然好色的片子,用中性树胶进行封片。注意封片用的该玻片要清洁, 封片时要注意不要产生气泡。 二.显微测量与分析方法 在显微镜下分别进行 4×10 倍和 10×10 倍观察各切片,并进行显微数码摄影。

【注意事项】
1.脱水应彻底,否则材料不能透明,影响石蜡的浸入,致使难以切片。 2.在低浓度或纯酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。 3.在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。 4.如需过夜,应停留在 70%酒精中。 5.使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。 6.室温过高时,可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组 织块,减少刀与组织块在过程中产生的热时,使石蜡保持合适的硬度以利于切片。 7. 切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑,否则易引起破碎。

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【参考文献】
1. 2. 李扬汉.蔬菜解剖及解剖技术(第一版)[M].北京:农业出版社,1991 王心钗.植物显微技术(第一版)[M].厦门:福建教育出版社,1986

十八

cDNA 扩增片段长度多态性技术(cDNA-AFLP)

【实验原理】
AFLP 技术是 1993 年由荷兰的 Keygene 公司科学家 Zabean 和 Vos 等创建的一种 DNA 指纹技术。 Bachem 等于 1996 年将 AFLP 技术应用于 mRNA 差异分析, 发展成为一种 mRNA 指纹图谱技术, cDNA-AFLP 技术。 即 cDNA-AFLP 技术的基本原理: 提取植物总 RNA 后, 将模板 mRNA 逆转录成 cDNA,两边同时利用 2 个分别识别 6-bp 和 4-bp 的限制性内切酶 进行酶切,酶切片段同适宜接头连接,然后利用同接头互补的引物进行预扩增,再在引物 3’末端加 2~3 个选择性碱基进行选择性扩增,即:引物=接头序列+酶切位点序列+2~3 个 随机核苷酸,以预扩增产物为模板,进行选择性扩增,最后在测序胶上展示可获得大小在 100~1000bp 之间的重复性好、清晰的条带以便直观地进行指纹图谱分析。

【仪器、材料与试剂】 (一)仪器
1. 分光光度计 2. 台式离心机 3.电子天平 4.漩涡混合器 5.电泳仪 6.PCR 仪

【实验步骤】
1.提取 RNA 采用 TaKaRa 公司的 RNAiso Reagent 试剂盒提取。方法如下: ① 称取植物样品 30mg。 ② 液氮研磨,直至成粉末状。 ③ 向研钵中加入 1mL RNAiso Reagent,完全覆盖粉末,继续研磨裂解液成透明状。 ④ 透明状液体转移至离心管中,室温静置 5min,4℃,12000rpm 离心 5min.。吸上清液, 移入新的离心管中,加入 200μl 氯仿,充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后,再室 温 5 min。静置后离心,4℃,12000rpm 离心 15min。 ⑤ 吸上清液,加入 500μl 异丙醇,室温下放置 2min。接着 4℃,12000rpm 离心 10min.,

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离心后管底部有沉淀。 ⑥ 小心弃去上清液, 缓慢加入 1mL75﹪乙醇, 轻轻上下颠倒洗涤离心管壁, 4℃, 12000rpm 离心 5min 后小心弃去乙醇。 ⑦ 室温干燥 2-5 min 后,加入 40μl 的 RNase-free H2O 溶解沉淀后-20℃保存。 2.RNA 纯化 参照 TakaRa 公司的 DnaseⅠ说明书去除 RNA 中的 DNA,具体操作均在冰上完成。 ① 在 1.5ml 离心管中, 加入下列试剂: DNase I Buffer 5μL; RNase Inhibitor 1μL; Rnase-Free DNaseI 3μL;DEPC 水 1μL;RNA 溶液 40μL;反应体系 50μL。 ② 以上混合溶液在 37℃温浴 30 min。 ③ 水浴结束后,加入 50μLDEPC 水。 ④ 加入等体积(100μL)水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1) ,充分混匀,静置 2min,4℃, 12000rpm 离心 20min; ⑤ 将上清转移入干净的离心管中,加入 1/10 体积(10μL)的 3 mol/L NaAc(PH5.2)和 2.5 倍体积(250μL)的预冷无水乙醇,混匀后,-70℃放置 1~2 h(-20℃放置 12 h) ,沉 淀 RNA。 ⑥ 4℃,12 000 r/min 离心 20min。 ⑦ 弃去上清,沉淀经 75%乙醇洗涤沉淀 2~3 次,干燥后溶解于 20μL DEPC 水中。 3.双链 cDNA 的合成 合成方法具体操作如下: ① cDNA 第一链的合成:取总 RNA 10μl、2μl oligo-dT18V(1?g/μl)和 10μl DEPC-ddH2O ② 加入 PCR 管中混匀,65~70℃水浴 5~10min,以促进 mRNA 和引物之间的退火。 将以下体系试剂混匀后加入以上 PCR 管中混匀,加入 2μl M-MLV(RNase H- ) 200U/μl) ,稍微离心,在 PCR 仪上 42℃温育 1h 进行逆转录,然后 70℃温育 10min, 灭活逆转录酶,转移至冰上。 5 ×R T b u f f e r 10μl DTT(0.1mol/L) 5μl dNTP(10 mmol/L) 5μl RNase Inhibitor(40 U/μl) 1.5μl DEPC-ddH2O 6.5μl



cDNA 第二链的合成:以下试剂混匀后加入合成第一链的 PCR 管中 MgCl2(10mmol/L) 70μl Tris-HCl(1mol/L,pH7.4,37℃) 10μl (NH4)2SO4(1mol/L) 1.5μl RNaseH(10 U/μl) 1μl E.coli DNA Pol ymeraseⅠ(10 U/ μl) 4.5μl DEPC-H2O 10 μl 温和振荡混合反应液, PCR 仪上 16℃温育 3 h。 在 温育结束后, 1μl β-NAD(50 mmol/L) 将 和 1μl 大肠杆菌 DNA 连接酶(1~4U/μl)加到反应混合液中,室温放置 15 min。反应液转入

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1.5mL 离心管中,用等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)、氯仿/异戊醇(24/1)各抽提 1 次。加入 10μl 3 mol/L NaAc(pH5.2)和 250μl 无水乙醇, -20℃下静置 30~60 min。在 4℃,12000 r/min 下离心 10 min,回收沉淀,用 250μl 75%的乙醇洗 2 次。加入 30μl TE(pH 7. 6)溶解 cDNA 在 -20℃保存。 4.接头和引物的合成 各引物序列详见下表。

名称 接头: AseI AseI TaqI TaqI 预扩增引物: A3 T3 选择性扩增引物: A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

序列 5’-GCGTAGACTGCGTACC-3’ 5’-TAGGTACGCAGTC-3’ 5’-GACGATGAGTCCTGAC-3’ 5’-CGGTCAGGACTCAT-3’ 5’-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3’ 5’-GACGATGAGTCCTGACCGA-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATAG-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATAA-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATAT-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATAC-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATTG-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATTA-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATTT-3’ 5’-GACTGCGTACCTAATTC-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAGG-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAGA-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAGT-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAGC-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAAG-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAAA-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAAT-3’ 5’-GATGAGTCCAGACCGAAC-3’

5. cDNA 双酶切

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使用限制性内切酶 TaqⅠ和 VspⅠ对 cDNA 进行双酶切,以便加上接头。 TaqⅠ酶切:cDNA20μl,TaqⅠ10U,Bueffr(10× )4μl,BSA(10ug/μl)0.4μl,加水至 40μl, 混匀后 65℃温浴 1.5 小时。 VspⅠ酶切:TaqⅠ酶切物 40μl, VspⅠ10U,Buffer(10× )1μl,BSA(10ug/μl)0.1μl, 加水至 50μl,混匀后 37℃温浴 1.5 小时。 6.接头连接 按下面体系加入各反应成分: cDNA 酶切物 Ta q Ⅰ 接 头 VspⅠ接头 AT P ( 1 0 m M ) T4DNA Ligase(3U/μl) L i g a s e B u f f e r ( 1 0 ×) 总体积 59μl,各反应成分混匀后,37℃反应 2h。 7.预扩增 cDNA 酶切片断加上接头后,使用预扩增引物进行一次 PCR 扩增。 扩增体系与反应条件如下: 初级模板(加接头的 cDNA 片段) 预扩增引物 1

50μl 1μl 1μl 0.5μl 0.8μl 5.9μl

10μl 1μl

预扩增引物 2 1μl dNTPs(四种成分各 10mM) 1.5μl P C R B u f f e r ( 1 0 ×) 5μl MgCl2(25mM)4ul 4μl Ta q D N A P o l y m e r a s e ( 5 u / μ l ) 0.5μl 超纯水 27μl 总体积 50μl,各反应成分混匀后进行 PCR 扩增,扩增参数为:94℃,30s; (94℃,30s, 55℃,30sec,72℃,1min)× 25;72℃,5min。 8.预扩产物的选择性扩增 TaqⅠ选择性扩增引物:5’-GATGAGTC-CAGACCGANN-3’ VspⅠ选择性扩增引物:5’-GACTGCGTACCTA-ATNN-3’ N 代表 ATCG 中任意一种。 选择性扩增体系如下: 预扩增后模板(1ng/μl) PCR Buffer(10×) Ta q D N A P o l y m e r a s e ( 5 U / u l ) MgCl2(25mM)

5μl 2μl 0.2μl 1.6μl

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dNTPs

0.5μl

引物 1(A7-A14) 1μl 引物 2(T4 -T 11 ) 1μl 超纯水 8.7μl 具体热循环参数如下:94℃,30 s;(94℃,30s;65℃,30s(-0.7℃/cycle) ,72℃,1min ) × 11;( 94℃,30s ,56℃,30s , 72℃,1min ) × 24;72℃,5min。 9.聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① 洗板:用清洗液将电泳槽两块玻璃板彻底洗净;依次用自来水和蒸馏水冲洗干净晾干; 用吸水纸沾取 75%酒精擦洗后晾干; ② 涂板: Repel 配制(涂短板) :3ml 氯仿+300?Lrepel(汽车防雾剂) Binding 配制(涂长板) :3ml 无水乙醇+10?LBinding+10?L 冰醋酸 分别用少许反硅化剂(3ml 无水乙醇+10?LBinding+10?L 冰醋酸)和硅化油(3ml 氯仿 +300?LRepel)均匀迅速地涂抹长短板;室温晾干至少 30 分钟; ③ 装板:将边条和梳子洗净擦干后,长板在下,短板在上,边条对齐置于接触的两边; 两边用长尾夹对称夹紧,用梳子试好松紧后并调整板面水平。 ④ 制胶: Arc:Bis12ml+ddH2O10ml+10× TBE 6ml+尿素 25.9g,ddH2O 定容至 60ml 后,置于 4℃冰 箱预冷,用时加入 312?l 10% AP+84 ?l TEMED 称取 25.9g 尿素,加入 6ml 10× TBE 缓冲液,12ml Arc:Bis(19:1),搅拌水浴溶解,用蒸馏 水定容至 60ml 后,置于 4℃冰箱预冷; ⑤ 灌胶:加入 84?l TEMED 和 312?l 10% APS,迅速摇匀后置于冰板上防止凝固;连续迅 速地倾倒凝胶溶液到达玻璃板底部; ⑥ 插梳子:立即将梳子插在玻璃板中间,注意不要产生气泡;凝固 3~4 小时(或过夜) 。 ⑦ 样品变性:测序胶电泳之前,在 PCR 产物中加 5?L 6×Loading Buffer 于 PCR 仪 95℃ 持续变性 5min,立即冰浴 5min。 ⑧ 预电泳:上下槽缓冲液 1× TBE,恒定功率 65W,待板温上升至 50~55℃,约需 0.5h。 ⑨ 电泳:点完样后继续电泳直至二甲苯青距板底 10cm,1.5~2h。 ⑩ 染色: 卸下电泳装置后按以下流程立即将凝胶板染色: 固定:200ml 冰醋酸用蒸馏水定容至 2L 将胶板浸入 10%醋酸的固定液中, 并于脱色摇床上缓慢振荡 20~30min 至二甲苯青 指示带颜色褪尽,亦可静置于固定液中保存过夜 洗胶:凝胶从固定液中取出后,放入超纯水中振荡洗涤约 3min,重复一次 染色:2L 蒸馏水+2.4g AgNO3+3.6ml 甲醛

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将洗涤后的凝胶板转入染色液(黑暗中放置)中,振荡染色 30min 显影:72g Na2CO3+2 L 蒸馏水+3.6ml 甲醛+480ul Na2S2O3 溶液 染色后的凝胶板于超纯水中快速浸洗 5~10s,沥干后放入预冰的显影液中,缓慢振 荡 停显:200ml 冰醋酸用蒸馏水定容至 2L 待 DNA 条带清晰可见后,直接加入停影液(固定液)使之停止显色反应,振荡 2~3min 后取出凝胶板 洗胶:用超纯水振荡清洗胶板 干胶:将凝胶板自然风干,摄像保存 10× TBE 配制:108gTris 碱 + 54g 硼酸 + 40ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0) 用蒸馏水定容至 1L. Arc:Bis(19:1)配制:57g Arc + 3g Bis(加热溶解) ,用蒸馏水定容至 200ml,过滤。 10 AFLP 多态性片段的回收,纯化 10.1 差异片段的回收 在观片灯下观察聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板并找到目的条带,用锋利的刀片将条带割 下,放入已灭菌的 EP 管中,用封口膜封口,置于沸水中煮 15min 后,拿出冷却 3-5min 后, 12000rpm 离心 10min,取上清液,-20℃保存备用。 10.2 异条带的二次扩增 以差异条带回收液为模板,以相应的选扩引物组合重新扩增,其他试剂与扩增程序与 选扩所用完全相同。选扩结果在 1.2%琼脂糖电泳检测。如是一条带并且和在变性聚丙烯酰 胺凝胶上的分子量一样, 则可直接用于连接, 否则使用试剂盒在琼脂糖凝胶回收目的条带。 10.3 回收条带的纯化及再次扩增 将琼脂糖胶上的目的条带割下,使用琼脂糖胶回收试剂盒按照其使用说明书回收 DNA。取 5?l 用于检测。如仍是相同位置的条带,-20℃保存用于连接。 10.4 与载体的连接和转化及测序 将回收的 DNA 取 2?l 与载体 PMD-T18 连接。连接体系如下: 模板 2?l PMD-T18 0.5?l Solution I 0.5?l 将连接产物加入感受态,置于冰上,冰浴半小时。接着放入 42℃水中热激 90s,再放 置于冰上 2-5min,于 EP 管中加入 1ml LB 液体培养基,100rpm,37℃的条件下摇床上摇 1h。到时取出 8000rpm 离心 1min,去上清 1ml 后,余下的液体用移液枪吹打浑浊。吸取后 涂板,晾制 2-3min,封口,倒置,37℃过夜培养。挑取单一菌溶入已加入氨卞的 LB 中, 在摇床上过夜。第二天从菌液中吸取 1?l 做模板检测,送剩余菌液测序。

【参考文献】
Bachem C W B,Van derHoeven R S,De Bruijn S M,et al.Visualization of differential gene

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expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP:analysis of gene expression during potato tuber development.Plant J,1996,9(5):745-753.

十九
【实验原理】

3′/5′RACE 扩增基因全长

SMARTTM 3‘-RACE 的原理是:利用 mRNA 的 3‘末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连 有 SMART 寡核营酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物反转录合成标准第一链 cDNA。 然后用一个基因特异引物 GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通 用引物 UPM(universal primer,UPM)作为下游引物,以 cDNA 第一链为模板,进行 PCR 循环,把目的基 因 3‘末端的 DNA 片段扩增出来。
SMART TM 5‘-RACE 的原理是先是利用 mRNA 的 3‘末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物在反转录酶 MMLV 作用下,反转录合成标准第一链 cDNA。利用该反转录酶具有的 末端转移酶活性, 在反转录达到第一链的 5‘末端时自动加上 3 一 5 个(dC)残基, 退火后(dC)残基与含有 SMART 寡核苷酸序列 Oliogo(dG)通用接头引物配对后,转换为以 SMART 序列为模板继续延伸而连上通用接头 (figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM(universal primer,UPM)作为上游引物,用一个 基因特异引物 2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物,以 SMART 第一链 cDNA 为模板,进行 PCR 循环,把目的基因 5‘末端的 cDNA 片段扩增出来。最终,从 2 个有相互重叠序列的 3' / 5‘-RACE 产物中获 得全长 cDNA,或者通过分析 RACE 产物的 3‘和 5‘端序列,合成相应引物扩增出全长 cDNA 我们在实验中发现,要做好 RACE 反应实验不容易,实际操作中仍存在不少困难。因此,对 RACE 反应条件进 行反复摸索是实验必须要做地。这是因为:第一,在 5‘-RACE 包含了有 3 个连续的酶反应步骤(反转录、同 聚物加尾和 PC R 扩增),每一步都可能导致失败;第二,扩增。DNA 末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增 DNA 模板样品不均一性, 因而特异性一般很低, 常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。 因此, 使用 RACE 技术扩增得到的特异末端片段,所获得的重组克隆最好能够全部测序,以排除 RACE 实验结果中扩增产物假 阳性和假阴性,最终有可能获得新基因的全序列。

随着 RACE 技术日益完善,目前己有商业化 RACE

技术产品推出,如 CLONTECH 的 MarathoTM 技术和 SMART TM RACE 技术术。本章介绍的为 Investigation 的 RACE 技术。

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RT-PCR及RACE技术
RT-PCR获得基因片段 ←
GSP4


GSP3


GSP1


GSP2

5′RACE

3 ′ RACE

full length cDNA

3′RACE原理图

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5′RACE原理图

【仪器、材料与试剂】 3.1.材料与方法
3.1.1 材料
3.1.1.1 植物材料 供试材料为不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)抗寒品种 043,由南京农业 大学白菜课题组提供。 3.1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌菌株 JM109 由本实验室保存,质粒载体 pMD18-T 购自 TaKaRa 公司。 3.1.1.3 各种酶类 Taq DNA 聚合酶购自上海申能博采公司,RNase Free DNaseⅠ、T4 DNA 连接酶、RNA 酶 抑制剂等均购自 TaKaRa 公司。 3.1.1.4 试剂盒 Agarose Gel DNA Purification kit、 AMV 反转录试剂盒购自 TaKaRa 公司。 /3' 5' RACE 试剂盒购自 Invitrogen 公司。 3.1.1.5 常用储液 X-gal(20mg/ml)储液的配制:0.2 克 X-gal 溶于 10ml 的二甲基甲酰胺,分装于 1.5ml 的 eppendorf 管中,外包铝箔,储存于-20℃。

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IPTG 储液(24mg/ml)的配制:10ml 蒸馏水中溶解 240mg IPTG 后,用 0.22 ?m 滤膜 过滤除菌,分装于 1.5ml 的 eppendorf 管中,储存于-20℃。 LB 培养基:1% Tryptone,0.5% Yeast extract,1% NaCl,pH7.0(固体培养基另加 1.5% 的琼脂粉) 。 DNA 提取缓冲液:83.5mmol/L Tris-HCl(PH8.0) ,1.17mol/L NaCl,16.7mmol/L EDTA (PH8.0) ,2%(W/V)CTAB,15μl/mL β -巯基乙醇(临用前加入) 。 TE 缓冲液(PH 8.0) :10mmol /L Tris-HCl,1mmol/L EDTA。

3.1.2 方法
3.1.2.1 材料的准备 将不结球白菜播种于装有灭菌基质的穴盘中,置于人工气候箱内培养,每日 25℃光照 培养 14hr,20℃下暗培养 10hr。幼苗两片真叶时,4℃冷诱导 8hr,提取叶片总 RNA。 3.1.2.2 总 RNA 的提取 采用 Bioflux 公司 Simply P Total RNA Extraction Kit 提取试剂盒提取总 RNA。 ①取 0.05g 的新鲜叶片,在液氮中研磨,加入 600μL R2 溶液,移入 1.5ml 的离心管中。 ②涡旋仪上涡旋 1min,静置 2 min。 ③4℃ 12000rpm 离心 1min。 ④将试剂盒中的 Spin Column 管安置于 Collection Tube 上。 ⑤上清液转移到试剂盒中的 Spin Column 管中,12000rpm 离心 1min,弃滤液。 ⑥4℃ 12000rpm 离心 1min。 ⑦将 600μL Wash Buffer 加入 Spin Column 中,4℃ 12000rpm 离心 1min,弃滤液。 ⑧将 600μL Wash Buffer 加入 Spin Column 中,4℃ 12000rpm 离心 2min,弃滤液。 ⑨将 Spin Column 安置于新的 1.5ml 的离心管上, Spin Column 膜的中央处加入 20μL 在 的 DEPC 水,室温静置 1min。 ⑩4℃ 12000rpm 离心 1min 洗脱 RNA。 3.1.2.3 sscDNA 的合成 2.1.2.3 去除总 RNA 中痕量 DNA 污染 参照 RNase Free DNaseⅠ(TaKaRa)说明书。 ① 在微量 Tube 中配制下列反应液,全量 50μ L。 全 RNA 10× DNase Ⅰ Buffer DNase Ⅰ (RNase-free,5U/μL) RNase Inhibitor (40 U/μL) DEPC 处理水 ② 37℃反应 20-30min。 ③ 加入 50μ L 的 DEPC 处理水。 20-50μg 5μL 2μL 0.5μL up to 50μL

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④ 加入 100μ L(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分混匀。 ⑤ 离心,取上层(水层)移至另一微量离心管中。 ⑥ 加入 100μ L(等量) 的氯仿/异戊醇(24:1) ,充分混匀。 ⑦ 离心,取上层(水层)移至另一微量离心管中。 ⑧ 加入 10μ L(1/10 量)的 3M NaAC(pH5.2)。 ⑨ 加入 250μ L(2.5 倍量)预冷的无水乙醇,-20℃放置 30~60min。 ⑩ 离心回收沉淀,用 70%的冷无水乙醇洗沉淀,真空干燥。用适量的 DEPC 水处理 水溶解后,进行琼脂糖电泳确认是否除去基因组 DNA。 2.1.2.4 sscDNA 的合成 RT 反应参照大连 TaKaRa 生物公司的 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 2.1 试剂盒说 明书进行。反应体系如下: 10× Buffer RT MgCL2 (25mM) dNTPs (10 mM each) RNase Inhibitor AMV Reverse Transcriptase XL (5U/μL) Oligo dT-Adaptor Primer (2.5pmol/μL) 实验样品 RNA RNase Free dH2O 反应程序为: 30℃ 10min 42℃ 30min 99℃ 5℃ 5min 5 min 1Cycle 1 μL 2μL 1 μL 0.25μL 0.5μL 0.5μL 1 μL up to 10μL

3.1.2.4 引物的设计 特异引物参照拟南芥 CBF3(AF074602)保守区设计引物 FCBF 和 RCBF 。根据扩增得 到的中间片段设计 5'/3' 引物,由上海英杰及上海 Sangon 生物工程公司合成(表 3-1) 。 3.1.2.5 PCR 扩增 以不结球白菜冷诱导8h的叶片cDNA为模板,利用特异引物FCBF和RCBF进行PCR扩 增,以反转录的cDNA为模板进行扩增,反应体系参见第二章,引物为FCBF和RCBF,退 火温度为55℃。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像分析系统进行拍照及分 析。

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表 3-1 BrCBF 基因特异引物 Table 3-1 Primer for the cloning of BrCBF 实验编号 FCBF RCBF CBF3'GSP1 CBF3'GSP2 CBF5'GSP1 CBF5'GSP2 3′ AP 3′ AUAP 5′AAP 5′AUAP 引物序列 5'- CAAACCGCTGAGATGGCAGCTCG-3' 5'- TGTACGGACGGAAGCGGCAAAAG-3' 5' -TTATGCGGACTCGGCTTGGCG-3' 5' -CTGAGAAAAGTGATGTGACGATGC-3' 5' -AAAGCATT CCTTCCGCCATAC-3' 5'-TCAGCAGCA GCCTTCTGGATA-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'

3.1.2.6 3'RACE sscDNA 的合成参见第二章,引物为 3′ AP,其它条件相同。 根据已获得的不结球白菜 CBF 基因中间片段测序结果,设计两条正向嵌套引物 CBF3′GSP1 和 CBF3′GSP2,分别与通用引物 3′ AUAP 进行巢式 PCR 扩增。第一轮 PCR 产 物稀释 10 倍作为模扳进行第二轮巢式扩增。 ①第一轮 PCR 反应体系及扩增程序如下: 10× Tag Buffer MgCl2 (25mM) Tag(5U/μ L) CBF3′GSP1 3′ AUAP cDNA模板 ddH2O PCR反应程序如下: 94℃ 94℃ 78℃(每循环降0.5℃) 72℃ 94℃ 61.5℃ 72℃ 5min 30sec 30sec 1min 30sec 30sec 30sec 1min 30sec 30Cycle 10Cycle 4μL 3μL 0.25μL 10 pmol 10 pmol 5μL up to 50μL

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72℃ 10× Tag Buffer MgCl2 (25mM) dNTPs (2.5mM) Tag(5U/μ L) CBF3′GSP2 3′ AUAP 模板 ddH2O PCR反应程序如下: 94℃ 94℃ 63℃ 72℃ 72℃ 3.1.2.7 5'RACE

10min 5μL 3μL 3μL 0.5μL 20 pmol 20 pmol 2μL up to 50μL 5min 30sec 30sec 1min 30sec 10min 38Cycle

②第二轮PCR反应体系及扩增程序如下:

扩增产物在 1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像分析系统进行拍照及分析。 3.1.2.7.1 1st Strand cDNA 的合成 ①按下列组成配制反转录反应液。 RNA 3′AP ddH2O 2?l 10pml up to 15?l

②70℃ 5min,冰上放置 5min。 ③在①中加入以下反应液。 M-MLV 5× Reaction Buffer dNTPs (10 mM each) RNase Inhibitor M-MLV RT RNase Free dH2O ④42℃ 60min。 3.1.2.7.2 cDNA 的纯化 ①先将 Wizard DNA Clean-Up Resin 37℃ 温育 10min,冷却至 25-30℃待用。 ②在 3.1.2.7.1 中加入 75μL 水,再加入 1ml Wizard DNA Clean-Up Resin,充分混匀。 ③将 Syringe Barrel 与 Luer-Lok 连接,将②中混合液加入到 Syringe Barrel 中,真空抽 5 μL 1.25 μL 0.625μL 1 μL up to 25μL

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滤。 ④在 Syringe Barrel 中加入 2ml 80%的异丙醇,真空抽滤。 ⑤丢弃 Syringe Barrel, Luer-Lok 与 1.5ml 管连接, Luer-Lok 中央加入 50μL DEPC 将 在 水,静置 1min。 ⑥1000rpm 离心 30sec。 3.1.2.7.3 cDNA 的末端加尾 ①按下列组成配制反转录反应液。 纯化 cDNA 5×TDT 反应缓冲液 0.1%BSA 100mMdCTP ddH20 25μL 10μL 5μL 0.25μL up to 50μL

②94℃ 3min,冰上放置 5min。 ③在②反应液中加入 1μ L TdT 酶。 ④37℃反应 30min,65℃ 10min 灭活 TdT。 3.1.2.7.4 1st PCR 反应 ① 按下列组成配制 1st PCR 反应液(模扳为 3.1.2.7.3 中的 cDNA 末端加尾产物)。 10×Tag Buffer MgCl2 (25mM) dNTPs(2.5mM) Tag(5U/μ L) CBF5′GSP1 5′ AAP cDNA模板 ddH2O ②PCR反应程序如下: 2.5μL 1.5μL 1.5μL 0.25μL 10 pmol 10 pmol 1μL up to 25μL

94℃ 94℃ 63℃ 72℃ 72℃

5min 30sec 30sec 1min 30sec 10min 35Cycle

3.1.2.7.5 第二轮PCR反应体系及扩增程序如下: ① 按下列组成配制2nd PCR反应液(模扳为3.1.2.7.4中的1st PCR产物稀释10倍)。 Tag Buffer (Mg2+ Plus) 5μL

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MgCl2 (25mM) dNTPs (2.5mM) Tag(5U/μ L) CBF5′GSP2 5′ AUAP 模板 ddH2O ②PCR反应程序如下: 94℃ 94℃ 58℃ 72℃ 72℃ 3.1.2.8 目的片段的回收及克隆 2.1.2.9.1 目的片段的回收 5min 30sec 30sec 1min 30sec 10min 38Cycle

3μL 3μL 0.5μL 20 pmol 20 pmol 2μL up to 50μL

目的片段的回收按照 TaKaRa 生物公司的 Agarose Gel DNA Purification kit Ver2.0 试剂 盒的使用说明进行。 2.1.2.9.2 感受态大肠杆菌 JM109 的制备 ①取-20℃甘油冻存的大肠杆菌 JM109 100uL,于 5ml LB 液体培养基中培养(37℃, 250rpm)过夜; ②取过夜培养的大肠杆菌 2ml 于 50ml LB 的液体培养基中,37℃,250rpm 培养 2 小时 左右; ③4℃, 4000rpm, 离心 10min, 弃上清, 沉淀重悬于 10ml 0.1mol/L CaCl2(4℃), 冰浴 30min; ④4℃,4000rpm,离心 10min,弃上清,沉淀重悬于 2ml 的 0.1mol/L CaCl2; ⑤分装于 1.5 ml 离心管(200uL/管) ,4℃过夜备用。 2.1.2.9.3 重组质粒的构建 参照 TaKaRa 生物公司的 pMD18-T kit 提供的方法,向 10μ L 的反应总体积中加入 1 μ L pMD18-T vector, L 回收并纯化的 DNA 片段以及 5μ L Ligation solution Ⅰ, 16℃ 4μ 于 连接过夜。 2.1.2.9.4 重组质粒的转化

①将 10μ L 上述连接液加入到感受态 JM109 中,轻轻混匀,冰浴 30min; ②42℃热激 90s,迅速冰上冷却 3min; ③加入 37℃预热的 LB 液体培养基 400μ L,置 37℃摇床,100rpm 复苏 45-60min;

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④涂抹于含 100μ g/ml 氨苄青霉素的 LB 固体培养基(临用时表面涂抹 X-gal 20mg/ml 40ul+IPTG 24mg/ml 30μ L)上; ⑤37℃倒置培养 12~14 hr,长出的白色菌落可能为含有重组质粒的转化子。 2.1.2.10 重组质粒的鉴定 以菌液为模板,利用特异引物FBrCOR和RBrCOR进行PCR扩增,反应体系为25μ L, 其中加入10 ×Taq plus buffer 2.5μ L, 25mmol/LMgCL21.5μ L ,10 mmol/L dNTP 1μ L, 10μ mol/L正向引物1μ L, 10μ mol/L反向引物1μ L, 菌液1μ L, 灭菌H2O 16.75μ L, Taq plus DNA polymerase 0.25μ L (5 U /μ L) 。PCR反应参数为94℃预变性5min, 随后94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 38个循环后, 72℃再延伸10 min。 扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行 电泳,凝胶成像分析系统进行拍照及分析。 2.1.2.11 序列测定及分析 序列测定由上海英杰生物科技公司在 ABI 377 测序仪上进行;相似性比较在 NCBI 站点上 用 BLAST 完成;多序列比较利用 BioEdit 及 DNAman 软件完成;利用 SMART 进行蛋白 的结构域分析。 超氧阴离子(O2-· )产生速率、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含量的上升,增加了超氧化 物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)以及 AsA-GSH 循环中抗坏血酸过 氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)的活性,提高了抗氧化物质抗坏血酸(AsA)、还原型 谷胱甘肽(GSH)的含量, 对单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、 脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR) 活性没有影响

二十 根系活力的测定(TTC 法)
一、 原理
氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为 80mV 的氧化还原色素,溶于水中成为 无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙,生成的三苯甲腙比较稳定,不会 被空气中的氧自动氧化, 所以 TTC 被广泛地用作酶试验的氢受体, 植物根系中脱氢酶所引 起的 TTC 还原,可因加入琥珀酸,延胡索酸,苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑 制。所以 TTC 还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。 二、材料、设备仪器及试剂 (一)材料:水培或砂培小麦、玉米等植物根系。 (二)仪器设备:1)分光光度计;2)分析天平(感量 0.1mg);3)电子顶载天平(感 量 0.1g);4)温箱;5)研钵;6)三角瓶 50ml;7)漏斗;8)量筒 100ml;9)吸量管

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10ml;10)刻度试管 10ml;11)试管架;12)容量瓶 10ml;13)药勺;14)石英砂适量; 15)烧杯 10ml、1000ml。 (三)试剂:1)乙酸乙酯(分析纯);2)次硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉末;3)1%TTC 溶液:准确称取 TTC1.0g,溶于少量水中,定容到 100ml,用时稀释至各需要的浓度;4) 磷酸缓冲液(1/15mol·L-1,pH7)。5)1mol·L-1 硫酸:用量筒取比重 1.84 的浓硫酸 55ml, 边搅拌边加入盛有 500ml 蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至 1000ml;6)0.4mol·L-1 琥珀酸: 称取琥珀酸 4.72g,溶于水中,定容至 100ml 即成。

三、实验步骤
1)TTC 标准曲线的制作:取 0.4%TTC 溶液 0.2ml 放入 10ml 量瓶中,加少许 Na2S2O4 粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取此液 0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml 置 10ml 容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度, 即得到含甲月替 25μ g、50μ g、100μ g、150μ g、200μ g 的标准比色系列,以空白作参 比,在 485nm 波长下测定吸光度,绘制标准曲线。 2)称取根尖样品 0.5g,放入 10ml 烧杯中,加入 0.4%TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混 合液 10ml,把根充分浸没在溶液内,在 37℃下暗保温 1~3h,此后加入 1mol·L-1 硫酸 2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。 3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯 3~4ml 和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提 出甲月替。红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次,皆移入试管, 最后加乙酸乙酯使总量为 10ml,用分光光度计在波长 485nm 下比色,以空白试验作参比测 出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量

四、结果计算
四氮唑还原强度(mg·g-1 根鲜重 h-1)=四氮唑还原量(mg)根重(g)×时间(h)

植物根系活力的测定---甲烯蓝法 2009 年 06 月 14 日 星期日 9:33 植物根系活力的测定 植物根系是活跃的吸收器官和合成器官,根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养 状况及产量水平。本实验学习测定根系活力的甲烯蓝法。 【原理】 根据沙比宁等的理论,植物对溶质的吸收具有表面吸附的特性,并假定被吸附物质在根系 表面形成一层均匀的单分子层;当根系对溶质的吸附达到饱和后,根系的活跃部分能将吸 附着的物质进一步转移到细胞中去,并继续产生吸附作用。在测定根系活力时常用甲烯蓝 作为吸附物质,其被吸附量可以根据吸附前后甲烯蓝浓度的改变算出,甲烯蓝浓度可用比

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色法测定。已知 1mg 甲烯蓝形成单分子层时覆盖的面积为 1.1m2,据此可算出根系的总吸 收面积。从吸附饱和后再吸附的甲烯蓝的量,可算出根系的活跃吸收表面积,作为根系吸 收活力的指标。 【材料、仪器与试剂】 1.材料:植物根系。 2.仪器及用具:分光光度计;移液管;烧杯;比色管。 3.试剂: 0.0002mol/L 甲烯蓝溶液:精确称取 74.8mg 甲烯蓝(C16H18N3SCl·3H2O),加水溶 解,定容至 1000ml。此溶液每 ml 含甲烯蓝 0.0748mg。

0.010mg/ml 的甲烯蓝溶液:用刻度吸管吸取 0.0002mol/L 甲烯蓝 13.37ml 定容至 100 ml,摇匀即成。 0.01 mg?mL-1 甲烯蓝溶液; 0.0002 mol?L-1(0.075 mg?mL-1)甲烯蓝溶液。 【方法与步骤】 1. 甲烯蓝标准曲线的制作 按表 2-1 用 0.01 mg?mL-1 甲烯蓝溶液配制系列标准溶液,于 660 nm 处测定吸光度,以甲烯蓝浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。 表 2-1 甲烯蓝系列标准溶液的配制 管号 试剂/mL 0 1 2 3 4 5 7 -1 0.01 mg?mL 甲烯蓝 0 1 2 3 4 5 6 /mL 蒸馏水/mL 10 9 8 7 6 5 4 -1 甲烯蓝浓度/?g?mL 0 1 2 3 4 5 6 2. 将待测的植物根系洗净沥干,浸在装有一定量水的量筒中,用排水法测定根系的体积 (或用体积计测定)。 3. 将 0.0002 mol?L-1 的甲烯蓝溶液(每毫升溶液中应含 0.075 mg 甲烯蓝,为消除溶液配 制和比色误差,其含量需要重新进行比色,查标准曲线确定)分别倒入 3 个小烧杯中,编 号,每个烧杯中溶液体积约 10 倍于根系的体积。准确记下每个烧杯中的溶液量。 4. 将洗净的待测根系,用吸水纸小心吸干,然后依次浸入盛有甲烯蓝溶液的烧杯中,每 杯中浸 1.5 min,注意每次取出时,都要使根上的甲烯蓝溶液流回到原杯中去。 5. 从 3 个小烧杯中各吸取甲烯蓝溶液 1 mL,用去离子水稀释 10 倍后,于 660 nm 处测定 吸光度,根据标准曲线,查得各杯浸根后甲烯蓝的浓度。 【结果与计算】 (1)总吸收面积(m2)=[( c1—c1’)×v1+(c2—c2’)×v2]×1.1 (2)活跃吸收面积(m2)= [(c3—c3’)×v3]×1.1 (3)活跃吸收面积%=根系活跃吸收面积(m2)/根系总吸收面积(m2)×100% (4)比表面积(cm2·cm-3)= 根系总吸收面积(cm2)/根体积(cm3) 式中 c:各杯未浸泡根系前的甲烯蓝浓度(mg?mL-1); c’:各杯浸泡根系后的甲烯蓝浓度(mg?mL-1);

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v:各杯中的溶液量(mL)。
【思考题】 1. 在 TTC 法和甲烯蓝法测定根系活力的过程中哪些环节容易产生误差?如何减少这些误 差? 2. 在 TTC 法中,保温结束后加硫酸与否对实验结果有何影响?
日期:

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