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教学1.2《基因工程的基本操作程序》ppt


基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定

基因操作的基本步骤
一、目的基因的获取——
将需要的基因从供体生物 的细胞内提取出来。 目前被较广泛提取 使用的目的基因有:苏 云金杆菌抗虫基因、人 胰岛素基因、人干扰素 基因、种子贮藏蛋白基 因、植物抗

病基因等。
供体生物细胞

取出DNA

用限制酶剪 去多余部分

限制酶

目的基因

一、目的基因的获取
编码蛋白质的结构基因 1、目的基因主要是指______________________ 请举出三个以上的例子 2、获取目的基因的常用方法 (1)从基因文库中获取

(2)利用PCR技术扩增 (3)人工合成

(1)从基因文库中获取目的基因
什么是基因文库? 什么是基因组文库? 什么是部分基因文库?

怎样从基因文库中得到我们所需的目 的基因?
目的基因的有关信息与什么相联系?

概念:基因文库 (gene library) 部分基因文库(如cDNA文库)

基因组文库

将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌 分别含有这种生物的不同的基因,称为基因 文库(gene library)

基因组文库:
基因文库中包含了一种生物所有的基 因,这种基因文库叫做基因组文库.

部分基因文库:
基因文库中包含了一种生物的一部分 基因,这种基因文库叫做部分基因文库.

基因组文 库与部分 基因文库 的关系

原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
不同点 编码区是 连续 的 _____

真核细胞
编码区是间隔的、 不连续 _____的

编码区和具 都由能够编码蛋白质的______ 相同点 有调控作用的非编码 ______区组成的

思考:部分基因文库如何构建?
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA(也叫cDNA)片段,与载体连 接后储存在一个受体菌群中,那么,这个受 体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库。这 种方法称——反转录法

cDNA文库的构建
②反转录法:
mRNA
反转录 cDNA (互补DNA) DNA聚合酶

mRNA 反转录酶

cDNA
基因重组

双链DNA

基因组DNA文库与cDNA文库的比较

基因组DNA文库

cDNA文库

(3)如何从基因文库中得到所需要的基因? 依据:目的基因的有关信息。
如:根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。

1、构建基因组DNA文库时,首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA A C、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得,下列有关基因文库 的描述正确的是 C A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段,导入某个 生物 体内,则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文 库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文 库

(2)利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应

是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术。通过此技术,可 获取大量的目的基因。

PCR技术
? 原理: DNA复制 ? 前提:
一段已知目的基因的核苷酸序列 ? 原料
模板DNA;DNA引物;四种脱氧 核苷酸;热稳定DNA聚合酶 (Taq酶);离子

? 方式:以_____ 指数 方式扩增, PCR扩增仪 2n (n为扩增循环的次数) 即____

?

过程 变性、退火、延伸三步曲

?变性:加热至90~95℃ 双链DNA解链成为单链 DNA ?退火:冷却至55~60℃ 变性 部分引物与模板的单链 DNA的特定互补部位相配 对和结合 ?延伸:加热至70~75℃ 以目的基因为模板,合 成互补的新DNA链 退火 延伸

1、在遗传工程中,若有一个控制有利性状的DNA 分子片段为ATGTG/TACAC,要使其数量增多,可 用PCR技术进行人工复制,复制时应给予的条件是 D ①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热 稳定DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温 A.①③④⑦⑨ B.①④⑥⑦⑧ C.②⑤⑥⑦⑨ D.①③⑥⑦⑧ 2、在基因工程中,把选出的目的基因(共1000个脱氧 核苷酸对,其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个)放入DNA 扩增仪中扩增4代,那么,在扩增仪中应放入胞嘧啶脱 B 氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个

? (3) 人工合成
——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因

1、在已知序列信息的情况下,获取目的基因的最 方便方法是 A A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术 扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利 D 用化学方法人工合成 A.①②③④ B.①②③ C.②③④ D.②③

3、目的基因主要是指_______________ 的结构基因。 编码蛋白质 获得目的基因的常见方法有三种:(1)从基因文库中 核苷酸 序列,基因在 获取目的基因,根据基因的_________ 染色体 上的位置,基因的________ 转录 产物mRNA,基 ________ 因的_______ 表达 产物蛋白质等获取目的基因。(2)利用 PCR技术扩增目的基因,该技术是一项在________ 体外 完 成的核酸合成技术,前提条件是有一段已知目的基因的 ________ 核苷酸 序列,以便于合成_________ 引物 。(3)如果基 因较小且核苷酸序列已知,可以通过____________ 人工合成 方 法。

二、基因表达载体的构建——核心 1.过程:
(1)用一定的_________ 限制酶 切 割质粒,使其出现一个切口, 黏性末端 露出____________ 。 (2)用同一种限制酶 ___________切断目 的基因,使其产生相同 _____ 的黏性末端 ____________。

切口 (3)将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ,形成了一个重组 处,再加入适量___________ DNA分子(重组质粒)

1.过程:
质粒
目的基因
同种 限制酶处理

一个切口 两个黏性末端
两个切口 获得目的基因

表 DNA连接酶 达 载 体

2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用

思考:作为基因工程表达载体,只需含有目的基
因就可以完成任务吗?

3.基因表达载体的组成:
a、目的基因
b、启动子 c、终止子 位于基因的首端,是 mRNA结合位点 位于基因的末端,终 止转录

d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞

它们有什么作用?

1、(多选)一个基因表达载体的构建应包括 ABCD A.目的基因 B.启动子 C.终止子 D.标记基因 2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位,是起 始密码 B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段,对 mRNA的转录起调控作用 C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别 C 3、目前转基因工程可以 A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离

三、将目的基因导入受体细胞

? 常用的受体细胞: 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 ? 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

1、将目的基因导入植物细胞 特点: (1)农杆菌 转化法
能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上

转化过程:

表 植 农 Ti质粒 构建 达 转入 插入 植物细胞 表达 新 导入 物 杆 性 染色 DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞

(2)基因枪法

基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的动力, 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目 的基因与其整合并表达的方法。

(3)花粉通道法

植物花粉在柱头上萌发后,花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合 前,剪去柱头,然后,滴加DNA(含目的基因),使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。

2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序:
提纯含目的基 因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物

3、将目的基因导入微生物细胞
常用法:Ca2+处理 常用菌:大肠杆菌 微生物作受体细胞原因: 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程:

Ca2+处理
大肠杆菌

感受态 细胞

表达载体 与感受态 细胞混合

感受态细 胞吸收 DNA

1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作 B 为受体细胞,原因是 A.结构简单、操作方便 B.繁殖速度快 C.遗传物质含量少、简单 D.性状稳定、变异少 D 2、基因工程常用的受体细胞有 ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A.①②③④ B.①②③ C.②③④ D.①②④
3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在 基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达

4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因 的做法正确的是 C ①将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 ②将编码毒素蛋白 的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的 DNA序列与细菌质粒重组,注射到棉的子房并进入受精 卵中 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组,导入 细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养 A.①② B.②③ C.③④ D.①④ 5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 C ①农杆菌转化法 ②基因枪法 ③花粉管道法 ④显微注 射法 ⑤胚胎移植 ⑥DNA分子杂交法 A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤ C.①②③④ D.①③④⑤⑥

(四)目的基因的检测与鉴定 ①导入检测:目的基因是否导入受体细胞 方法—— DNA分子杂交 分 检测 转录检测——分子杂交 子 检 ②表达检测 测 翻译检测——抗原抗体杂交 法 抗虫鉴定 鉴定 抗病鉴定
个体水平的鉴定

活性鉴定等

知识延伸——DNA分子杂交技术
该方法是根据碱基互补配对原则,把互补的双链 DNA解开,把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或 化学发光催化剂等进行标记,之后同被检测的DNA中的 同源互补序列杂交,从而检出所要查明的DNA或基因。

返 回

1、用β-珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是 A A.镰刀状细胞贫血症 B.白血病 C.坏血病 D.苯丙酮尿症 2 、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基 因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 B A.用于检测疾病的医疗器械 B.用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C.合成β-珠蛋白的DNA D.合成苯丙羟化酶的DNA片段

思考与探究:
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分 析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导 入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株,因为不是所有的农杆菌菌株都 可以侵染单子叶植物;②要加趋化和诱导的物质,一般为乙 酰丁香酮等,目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 (趋化性)和激活农杆菌的Vir区(诱导)的基因,使T-DNA 转移并插入到染色体DNA上。

3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素,联系前面有关细胞器 功能的知识,结合基因工程操作程序的基本思路,思考一下,若 要生产人的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗?
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网 和高尔基复合体上加工完成的,内质网和高尔基复合体存在 于真核细胞中,大肠杆菌不存在这两种细胞器,因此,在大 肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

4.β -珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异 常时,动物有可能患某种疾病,如镰刀形细胞贫血症。假如 让你用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的β -珠蛋白, 想一想,应如何进行设计?
(1)从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。 (2)将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外 加上抗四环素的基因,构建成一个表达载体。 (3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在 含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入 大肠杆菌中,大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉;如果 培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明β-珠蛋白基因已进入 其中。

(4)培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破 碎后从中提取β-珠蛋白。

复习题
1)将目的基因导入受体细胞有哪些方 法?(试举例说明) 2)简述农杆菌转化法

3)有关基因工程的叙述中,错误的是( A ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶 4)有关基因工程的叙述正确的是 ( D ) A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料

5)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基 因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 C A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合

6)(多选)人们利用基因工程的方法,用大肠杆菌生产 人类胰岛素,这一过程涉及到( ABCD ) A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接 B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增 C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状 D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”
7)下列哪项不属于基因工程技术的步骤 ( A.基因转移 B.基因扩增 C.基因检测 D.基因表达

B




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