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农业生物技术备课本


备 课 本

(2011 年—2011 学年 2 学期)

学 专 课 年 班 教

校 业 程 级 次 师

农业生物技术

云南省农业广播电视学校

编制

日期

201

年 月 日

>
上午 下午

授课 内容

第一章 农业生物 技术概述

教学 时数

12

重点

1、了解生物技术的含义及种类 2、了解农业生物技术发展史 生物技术的特点 4、了解生物技术在农业领域的发展及应用

3、了解

难点

了解农业生物技术发展史

了解生物技术的特点

教学内容及过程设计 1、第一节 农业生物技术的内涵

生物技术的含义:是指人们以生命科学为基础,应用基础学科的科学原理,产用 先进的技术手段,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需 产品或达到某种目的的技术。 2、生物技术的先进技术包含:基因工程,细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质 工程等。 (1)基因工程:基 因 工 程 即 利 用 工 程 技 术 的 方 法 ,把 某 一 生 物 体 内 的 有 用 基 因 分 离 提 取 出 来 在 体 外 进 行 复 制 ,或 者 用 化 学 合 成 法 制 备 出 我 们 所 需 要 的 基 因 ,然 后 把 这 段 基 因 连 接 到 受 体 生 物 的 D N A 上 ,这 样受体生物就有了我们所需要的性状。 (2)细胞工程:是指以细胞为基本单位,利用立体培养细胞进行遗传操作,按照 人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合 性科学技术。 (3)发酵工程:发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机 结合,利用微生物生长和代谢活动的特点,通过现代工程技术手段,运用微生物的 某种特定功能生产出人类所需要的产品的工程技术。 (4)酶工程:酶工程是将酶学理论与化工技术结合起来,按人们的需要研究酶, 改造酶,利用酶和工业化大批量生产酶的一项高新技术。

(5)蛋白质工程:蛋白质工程是指利用生物技术手段,对编码蛋白质的 DNA 序列有目的的进行改造并分离、纯化、 ,从而获取自然界没有的,具有优良 性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的工程。 第二节 农业生物技术的发展史 一、 按照生物技术的发展历程分类, 大致可分三个阶段: 传统生物技术阶段, 近代生物技术阶段和现代生物技术阶段。 第三节 生物技术的特点 一、农业生物技术以生命科学领域的重大理论和技术突破为基础,多学科相 互渗透,呈现明显的高新技术的特点。 1、重大理论和技术突破,推动农业生物技术发展。DNA 双螺旋结构模型的 建立,遗传密码的破译,限制性内切酶和 DNA 连接酶的发现,形成基因工 程技术; 2、动植物细胞培养方法和原生质体融合方法的建立,形成细胞工程技术。 3、生物反应器及传感器的发明自动化控制技术的应用,形成发酵工程技术。 4、没学理论的研究与化工技术应用相结合,形成酶工程技术。 5、蛋白质三维结构的深入研究及化工技术的进步,形成蛋白质工程技术。 二、农业生物技术呈现明显的高新技术特征。 1、农业生物技术具有创新性、综合性、渗透性,只是技术与人才的聚集性、 基本密集性和增值性等高新技术特征。 三、农业生物技术是以基因工程为核心的综合技术。 第四节 生物技术在农业领域的应用及发展

一、生物技术在农业领域的应用 1、提高作物产量,改善农作物品质。 2、植物种苗的工厂化生产。 3、生物农药、生物肥料的应用。 4、决绝能源危机,智力环境污染。 二、生物技术的发展 DNA 重组技术、细胞培养技术、DNA 芯片技术

第二章

生物遗传学基础

第一节 生物遗传学概述 1、 生物体性状的相对稳定——遗传和变异 在生物的繁殖过程中有一个引人注目的现象,即同种生物世代之间性状上的相 对稳定。种瓜得瓜,种豆得豆。这就是生物的遗传。在生物的繁殖过程中还有 另一个引人注目的现象,即同种生物世代之间或同代不同个体之间的性状不会 完全相同。例如,同一个稻穗上的籽粒,长成的植株在性状上也有或多或少的 差异;甚至一卵双生的兄弟也不可能一模一样,这种差异是表现,就是生物的 变异。 遗传和变异是生命活动中的一对矛盾,既对立又统一。遗传是相对的、保守的; 而变异则是绝对的、发展的。没有遗传,不可能保持物种的相对稳定;没有变 异,也就不可能有新的物种的形成,不可能有今天这样一个丰富多彩、形形色 色的生物界。 2、 遗传、变异与生物进化 由于遗传物质的改变所引起的变异是遗传的;由于环境条件的改变所引起的变 异,一般只表现于当代,不能遗传下去。也就是说,变异可分为两大类:遗传 的变异和不遗传的变异。这里要强调指出,这两类变异的划分是相对的。因为 在一定的环境条件下通过长期定向的影响和选择,由量变的积累可以转化为质 变,不遗传的变异就有可能形成为遗传的变异。 生物性状的遗传,以生殖细胞作为桥梁。即在配子形成过程中的减数分裂后, 当配子形成合子时,又恢复了亲代体细胞染色体的数目和内容。而 DNA 恰是染 色体重要的成分,所以,染色体是 DNA 的主要载体,基因是有遗传效应的 DAN 片段。 遗传物质的变化发展规律,直接关系到生命物质运动中的稳定和不稳定。遗传 物质的稳定传递,使生物表现出遗传,这关系到生物种族的稳定发展;遗传物 质的不稳定传递,使生物表现出变异,这关系到生物种族的向前发展进化。这 充分体现了生命物质(主要是核酸、蛋白质)运动和变化发展的一些重要规律。 第二节 遗传细胞学基础

一、细胞的构造 1.细胞膜 细胞最外面的一层很薄的膜就是细胞膜,又称为质膜,它是一切 细胞不可缺少的表面结构,厚度为 70-100 埃。1?=10-4μm=10-7mm 每一个细胞以 这种膜为界,使细胞成为具有一定形状的结构单位。植物的细胞膜的外面还有 一层由果胶和纤维素构成的细胞壁,因为二者皆可溶于盐酸,所以可用盐酸除 掉细胞壁。这层细胞壁是无生命的,只是对细胞起保护作用。膜是由蛋白质, 磷脂组成,其中还有少量的粮类物质,固醇类物质及核酸。在植物的细胞中还

具有特有的构造——胞间连丝,它们是相邻细胞间的通道,植物相邻细胞间的 质膜通过许多胞间连丝穿过细胞壁联结起来。 2.细胞质 是在细胞膜内环绕着细胞核外的原生质, 呈胶体溶液状态。 原生质 是指细胞所含有的全部生活物质;包括细胞质和细胞核两部分,细胞质表现为 粘稠的胶体状态,是由细胞浆和各种细胞器组成。主要的细胞器有内质网,核 糖体,高尔基复合体,线立体,溶酶体,动物及一些蕨类及裸子植物中特有中 心体,植物细胞还有特殊的结构,液泡和质体等。细胞浆:胶体溶液,内有蛋 白质分子,脂肪,氨基酸及电解质组成。 细胞器:是细胞里有生命活动的组成部分。 细胞器有:内质网 线粒体 液泡 质体 溶酶体 中心体 高尔基复合体 核糖体 3.细胞核 一般呈圆球形,大小相差很大,小的 1 微米,大的 600 微米。一 般为 5-25 微米。是由核膜,核液,核仁,染色质构成。 1、核膜 是由两层薄膜所构成的,中间有空腔——核周隙,整个膜的总厚 度为 200-400?,每层膜厚为 60-90 ?,核的周隙为 150-300 ?。核膜的外层附 着有许多的核蛋白体,其形态与粗面内质网相似。 2、核仁:核仁的折光率很强,它可呈现均一的或者分为两相,其中一相 比另一相更致密些,致密部分形成一团紧密集中的致密圆球,而较亮部分的物 质是纤维丝状的,迄今为止还未发现核仁外围有薄膜。 3、核液(核基质)是被包围在核膜内的透明的物质,充满在细胞核内它 含有各种酶和无机盐等,其成分与细胞的质的基质相似。 4.染色质和染色体 染色质:在尚未分裂的细胞核中可以看到一种很容 易被碱性染料染上颜色的网状物质,称染色质。 染色体:在细胞分裂时,染色质浓缩卷曲成具有一定数目和形态的遗传物 质载体染色体。在细胞分裂结束进入间期时,染色体又逐渐松散而回复为染色 质。

总结一下, 从光学显微镜的研究中, 可以把细胞的构造分成下面几个部分: 细胞膜——质膜 内质网 高尔基复合体 线粒体 细胞 细胞质 中心体 溶酶体 基质、质体、核糖体、液泡

核膜 细胞核 核仁 核液 染色质

目前有人把三大部分又归成膜相结构和非膜相结构两大类(根据膜的有 无) 。其中后者的非膜相结构包括质相结构和核相结构两个部分的内容。 细胞膜 2 内质网 1 量 高尔基复合体 1 核膜 2 膜相结构 线粒体 2 溶酶体 1 叶绿体 2 液泡 1 质体 具有遗传功能的细胞器:线粒体,叶绿体,核糖体,内质网 细胞:——生命的基本单位 一切多细胞的生物体,在它的生命刚刚开始的时候,都只是一个细胞—— 合子,合子经过无数次的分裂,最后才成为多细胞的复合体。 二 、染色体 遗传物质是细胞核内的染色体,生物的各种性状是靠染色体世代相传的。 一、染色体的发现与研究简史: 早在 19 世纪中叶(1848 年前后)植物学家 H.fmeister 在研究紫鸭趾草 属(Tredescanticq)的花粉母细胞时,染色体就已经被发现了,并描绘成图形 载于生物学文献中,1873 年又被 Schreder 在茎顶端生长点细胞中了现到了。 1880 年 Waldeyer 把 它 定 名 为 “ 染 色 体 。 Chromosome Chromo=color ” some=bocly 。并把染色体在细胞分裂和受精过程中的行为,作了详细的描述。 二、染色体的形态特征: 染色体是细胞核内的最重要的组成部分,生物中除了病毒和噬菌体之外, 都是由细胞组成的大多数生物的细胞都很小,须借助于显微镜,才能看到细胞 的结构,包括染色体在内,至于噬菌体在光学显微镜或电子显微镜下也可以看 到染色体的存在。染色体在细胞间期一般看不到,必须在细胞分裂期,经过一 定的处理才能看到一些能被碱性染料着色的点状或杆状的小体所以叫做染色 等的外膜 细胞基质 核糖体 中心体 非膜相结构 核仁 质相结构

核基质 染色质 细胞壁 核相结构

体。 在染色体上,有一个相对不被染色的部位叫做“着丝点”着丝点两侧的染 色体,叫“染色体臂” ,长的叫长臂,短的叫短臂,各个染色体的着丝点位置是 恒定的,因而着丝点的位置直接关系染色体的形态表现。 根据着丝点在染色体上的位置可以把它分成三种类型: 1.中间着丝点染色体:着丝眯恰巧位于染色体的中部,由于染色体被分成等长 的两臂,所以又叫等臂染色体,细胞分裂旱,纺锤丝附着在着丝点上,当在细 胞分裂后期,染色体向两极牵引时,表现为 V 形又叫 V 形染色体。 2.近中着丝点染色体: 着丝点的位置偏向染色体的一端,因形成的两臂不等,所以又叫异臂染色体, 又叫 L 染色体。 3.近端着丝点染色体:着丝点靠近染色体的末端,形成一个长臂及一个极短的 臂,短臂有时不易被觉察,又叫棒状染色体。此外某些染色体的形状极其粗短, 状似颗粒,叫粒状染色体,例:水稻第 7、第 5 和第 10 号染色体,长/短臂之 比分别为 1.03,2.05,6.00 判断各层何型染色体 1.03 2.05 6.00 V 型染色体 L 形染色体 棒状染色体 粒状染色体 根据长臂与短臂的比值,可在细胞分裂后期看到染色体形态的不同,凡比值接 近于 1 的,染色体将呈 V 形,比值接近或大于 2 的,将呈 L 形;如比值更大, 将呈棒状。 不同物种染色体的形态不一致,同一物种细胞内各染色体组内的各染色体 的形态也不相同。但每一物种细胞内染色体的形状,大小又是相对稳定的,从 而可以做为鉴定的标准。 三、染色体的细微结构 1.染色丝:每条染色体都有两条平行的染色丝,他们相互盘绕成螺旋形, 这是染色体的最基本的结构。 2.染色粒:在分裂期的染色体上,通过光学显微镜就可以观察到的像念珠 状的由一连串的珠状物构成的染色质,这种珠状物就叫做染色粒。 3.着丝粒:在染色体的两臂之间缢痕即“内缩”内缩的区域内有一个相对 不着色或着色极浅的颗粒称为着丝粒。 4.主缢痕:染色体经过染色后,当两个臂被染色时着丝点不染色,使染色 体在光学显微镜下就象在着丝点部分中断了,于是着丝点区域又称为主缢痕 5.次缢痕(副缢痕) :在某些染色体的一个或两个臂上还有变细的地方, 称为次缢痕。 6. 随体: 在染色体的次缢痕的末端具有一个圆形或长形的突出物叫做随体。 7.核仁组织中心:有的染色体在靠近顶端的随体也就是在次缢痕里有一个 染色很深的核仁组织中心,它的作用是在细胞分裂的末期重新组成一个核仁。

有丝分裂末期核仁总是在职些组织中心地方出现,所以核仁总是与带有核仁组 织中心的染色体相连。 一般每个核中有一对染色体的次缢痕与核仁的形成有关。 染色体的数目, 四、染色体的数目,大小 (一)染色体的数目 不同的生物种群具有不同数目的染色体,同一生物 体细胞中的染色体是性细胞之中染色体的二倍, 如体细胞之中的染色体数用 2n 表示,那么性细胞之中的染色体为几个,也就是说:合子或体细胞之中的染色 体数为 2n,配子或性细胞之中的染色体数为 n,最少的为 2 条 1 对,有的达 400-600 对以上的染色体。 (隐在植物中瓶尔小单层的些物种即是如此) 染色体数目的多少与物种的进化程度一般并无关系。 有些生物的细胞中聊具有正常恒定数目的染色体以外, 还常出现额外的染 色体。 (二)染色体的大小:不同物种,同一物种的不同染色体大小 差异都很大, 而染色体大小主要指染色体长度而言。 (三)同源染色体和异源染色体 染色体在种生物体内的形态结构是相对稳定的, 而且染色体在体细胞内都 是成对存在的。 根据染色体形态,结构是还相同又分为, 同源染色体:在形态结构上相同的一对染色体称为同源染色体。 异源染色体:在形态结构 不相同的染色体称为非同源染色体或异源染色体。 (四)原核生物的染色体形态,结构和数目:原核生物虽然没有一定结构的 细胞核,但是他们同样具有染色体只是染色体的组成十分简单,是简单的 DNA 分子或 RNA 分子,而没有与蛋白质结合在一起。在形态上有些呈线条状,有些 连接成环状(线粒体) 。 五、染色体的性质: 1.染色体的连续性:染色体能在细胞分裂的过程中复制自己,这样保持 上、下代的连续性,代代相传,这样才能保持物种的连续性。 2.染色体的稳定性:染色体在体细胞之中是成对存在的,在生殖细胞之 中是成单存在。受精后又恢复成对,从而保证种的相对稳定。如果形态结构及 数目发生了变化,相应的性状即发生变化。物种的稳定性遭到破坏。 3.染色体的变异性: 交换 数量变异 结构变异 突变 六.染色体的化学组成:DNA:27% RNA:6% 蛋白质:66% 染色体主要是由核酸和蛋白质组成的, 核酸为 DNA, 两种, RNA 主要是 DNA; 蛋白质主要是碱性蛋白质(组蛋白) ,还有部分的酸性蛋白质。 根据着色的深浅不同,又可以把染色质分为两种: 其一:异染色质:在有丝分裂的各阶段都被强烈染色的染色质称为异染色

质。具有异染色质的染色体区段称为异染色区。 其二:常染色质:在有丝分裂的各阶段都不吻被染色的染色质称为常染色 质。具有常染色质的区段可称为常染色质区。一般认为常染色质区在遗传上起 着更为积极的作用。 七.染色体的结构模型: 染色体主要由 DNA 和蛋白质这两类化学物质组成。 每一条染色体的骨架是 一个连续的 DNA 大分子, 许多蛋白质分子结合在 DNA 大分子的骨架上, 成为 DNA, 蛋白质纤丝。 第三节 细胞分裂 细胞分裂是生物生长、 繁殖和遗传的基础, 是所有生物细胞繁殖的惟一方式。 细胞生长周期包括:间期 分裂期 1、间期 两次联系的细胞分裂之间的一段时间为间期。 2、分裂期 分为有丝分裂和减数分裂。 (1)有丝分裂 多细胞的生物主要靠有丝分裂来增加细胞的数目,从而 成长为配子体的。在有丝分裂的过程中核内的染色体会发生一毓的变化,根据 染色体的变化情况,将 M 期又分为四个时期。 1、前期(prophase) :细胞核内开始出现极小的易于染色的颗粒,染色体 形成,染色子体形成,核膜,核仁消失,纺锤丝形成,之后不但这些颗粒的数 目增加而且彼此结合成为较大的颗粒,较大的颗粒又联合成念珠状的细丝,细 长扭曲,逐渐的变短变粗形成了染色体。在前末期,染色体一分为二个成为染 色单体,但两个单体并不分开。此时核仁,核膜消失,细胞核和细胞质的一部 分混合物中有中心体,中心体分裂为二,并向两极分开,每个中心体周围出现 星射线丝(spindle) ,纺锤丝(spindlefiber)高等植物无中心体只从两极出现 纺锤丝, 2.中期(metaphase): 染色体排列赤道板纺锤体形成计数裂而不分,具有两条染色单体染色体有 规律的排列在中央的赤道板上,特别是着丝点整齐的排列在赤道板上,染色体 的其他的部份可能留在赤道板的两侧。着丝点与纺锤丝相联,即纺锤丝由两极 伸向赤道板并与着丝点相接,此时纺锤丝已汇集成纺锤体。这时所有的染色体 都处于同一个平面,是染色体形态,数目观察的最好时期,虽然染色体分裂成 为两个单体,但仍被着丝点连在一起的。 3.后期(anaphase) 染色单体移向一极,着丝点分裂,由于纺锤丝的收缩和牵引使赤道板上的 成对的染色单体在以着丝点为前导的情况下开始分离并向两极移动,每极有一 组染色单体,其数目和原来的亲本相同。在细胞的分裂的过程中,由于某种原 因而失掉了着丝点的染色体, 在分裂中就可能形成落后的染色体, 或者消失掉, 或者附着于其他的染色体上。 4.末期(telophase)

分向两极的两组染色单体各在两极形成细胞核,由染色单体变成了染色 体,并失去分裂中的浓缩的状态,当然核仁,核膜也就出现了,在纺锤丝逐渐 消失的同时,赤道板处的纺锤丝道逐渐的增粗,膨胀以至彼此融合成细胞板, 细胞板由细胞中央向四周延伸,直到与原来的细胞壁相接,同时胞质也被分成 两份。结果形成两个子细胞。所以有丝分裂结束时, 就形成了两个形态上与母 细胞相似的新细胞。 从电子显微镜对染色体的微细结构的观察中可见到: 有丝分裂过程中染色 线从旋曲到螺旋的消失的过程即是一次有规律的分裂的过程。 四、有丝分裂的意义 1. 由于每条染色体都能准确地复制分裂为二, 然后有规律的平均的分配到两个 子细胞中去,即每个子细胞都得到与母细胞无论从质量上和数量上都是完全相 同的染色质,这样遗传物质准确的从母代传给子代,这不但揭示了遗传变异的 原因,而且也保证了物种的相对稳定性和连续性。 2. 细胞生物的生长主要是通过细胞数目的增加和细胞体积的增大而实现的, 所 以只有植物能进行正常的有丝分裂,才能保证生物进行正常的生长和发育。 染色体有丝分裂过程中所表现出来的运动规律, 也就是遗传物质的运动规 律。 所以这样均等方式的分裂既能维持个体的正常生长和发育, 也保证了物种 的连续性及稳定性。 无丝分裂 无丝分裂也叫直接分裂。无丝分裂的主要特点是: ①细胞的分裂过程不经过染色体的有规律的分裂过程。 ②看不见纺锤丝的作用。 ③经历时间比较短。④需要的能量也很少。⑤在分裂的过程中其它的生命活动 都可正常的进行。 无丝分裂是高等植物某些专化组织中成病变和衰退组织中以及高等植物 中生长迅速的部分的分裂方式。 2、细胞的减数分裂 减数分裂发生在花蕾里,是配子形成过程中进行染色体树木减半的特殊分 裂方式。 减数分裂的过程 减数分裂包括两次分裂,第一次的分裂又分为四个时期,其中前期又分为 五个时期。 1、前期 A 细线期 染色体呈现并且细长如线,由于缺少间质,所以染色粒看得很清,染色 粒的大小及位置极为固定,所以可以做为识别某些特定染色体的樗。 2、B 偶线期 各同源染色体分别进行配对,出现联会现象。

3、C 粗线期(pachytene) 二价体逐渐缩短加粗,每对二价体具有自己的特殊的特征。因为每条染色体在 间期已经复制了,所以每条染色体已含有两个染色单体,但其着丝点是一个, 即每对染色体具有四根染色单体。具有四条染色单体的一对染色体又可叫做四 合体。 D 双线期 四合体继续缩短变粗, (各个联会了的二价体虽因非姊妹染色单体相互排斥而 松解,但仍被一、二个以至几个交叉(chiasmate)联结在一起。 )原来联会的 而又纵裂的染色体因排斥力而相互分开,也就是非姊妹染色体开始分开。由于 发生交换的地方仍然连在一起,因此出现了交叉结。具有一个交叉结的四分体 呈“X”形,有两个交叉结的四分体呈“O”形;有的出现“8”形。交叉结的出 现就是非姊妹染色单体之间某些片断在粗线期发生交换的结果。交叉结现象是 非姊妹染色体之间发生局部交换的最好证明。一般来讲,染色体越长,交叉结 就越多。 E 终变期(diakinesis) (浓缩期) 染色体的周围聚集了许多的染色基质, 螺旋化过程达到最高限度, 整个染色体 变得更短更粗(DNA,蛋白质纤丝的折叠程度不断加强的结果) 。这是前期Ⅰ终 止的标志。因此又叫做浓缩期。 2、中期 (①二价体分散在赤道板两侧②纺锤体形成③准备移向一极④计数⑤裂而不 分)核仁和核膜消失,细胞质里出现纺锤体。纺锤丝与各染色体的着丝点连接。 从纺锤体的侧面观察,各二价体不是象有丝分裂中期各同源染色体的着丝点整 齐地排列在赤道板上,而是分散在赤道板的两侧,即二价体中两个同源染色体 的着丝点是面向相反的两极,并且每个同源染色体的着丝点的排斥力的加强, 每个染色体开始准备向一极移动。从纺锤体的极面观察,各二价体分散排列在 赤道板的近旁。所以此期也是鉴定染色体数目的最妈时期。每个染色体的两条 染色单体虽然分开着,但仍然具有一个共同的着丝点,即裂而不分。 3、后期 由于着丝点的排斥力及纺锤丝的牵动, 使成对的同源染色体以染色体为单 体分别向两极移动,从而联会变成了分裂。每一极的染色体因为着丝眯没有分 开,所以仍然是原来的染色体,而不是染色单体。由于每一极只得到同源染色 体中的一条,故而染色体的总数减半。也就是说,由于是以染色体为单体分别 向两极移动,每极只包括成对同源染色体中的一个染色体,每个子细胞中具有 几个染色体数,从而完成减半的作用。此时每条染色体的两个姊妹染色单体除 着丝点部份外,一般全部散开,因而着丝点的位置若在近端是形成 L 形,有的 呈现 V 形等。 4、末期 两组染色体分别到达两极,组成了含有 N 个染色体的细胞核。与此同时胞

质也开始分裂,胞膜形成,组成两个子细胞,此时又称为二分体时期。这时期 很短,有时和第二次分裂的前期无法分开。接着进行第二次分裂。若只以染色 体数目这一方面来考虑, 使孢子母细胞的染色体由 2n→n 条的工作基本完成了。 在末期Ⅰ后大都有丝分裂的间期; 但有两点显著不同, 一是时间很短, 二是 DNA 不复制,所以中间期的前后 DNA 含量没有变化。这一时期在很多动物中几乎是 没有的,它们在末期Ⅰ后紧接着就进入下一次分裂。

2、第二次分裂 前期Ⅱ 每个染色体有两条染色单体,着丝点仍连接在一起,染色单体联而 不开,但染色单体彼此散得很开。 中期Ⅱ 每个染色体的着丝点整齐地排列在各个分裂细胞的赤道板上。着丝 点开始分裂。 后期Ⅱ 着丝点分裂为二,各个染色单体由纺锤丝分别拉向两极。 末期Ⅱ 拉到两极的染色体形成新的子核,同时细胞质又分为两部分。 三、减数分裂的遗传学意义 1.减数分裂产生具有 n 条染色体的配子,那么配子的结合又形成具有 2n 条染 色体的合子,从而保证了亲代与子代之间染色体数目的恒定性,为后代的正常 发育和性状遗传提供了物质基础;同时保证了物种相对的稳定性。 2.在减数分裂的过程中,同源染色体联会,并在非姊妹染色单体之间发 生交换,交换的结果必然产生新型的配子,从而使配子形成的合子所发育成的 个体产生新的变异。所以交换的结果必然有新的产生变异。减数分裂不但保证 了物种的稳定性还为生物的变异提供了重要的物质基础, 增加了变异的多样性。 有利于生物的适应及进化,并为人工选择提供了丰富的材料。 减数分裂与有丝分裂的异同点(区别) 四、减数分裂与有丝分裂的异同点(区别) 相同之外:同是把遗传物质准确的传递给子细胞的过程。 不同之处: 有丝 减数 1.目的:增大营养体,维持正常的新陈代谢 形成配子,产生母细胞,而且 只有性母细 生物从生→死除了性母细胞之外, 胞成熟时方才可进行的分裂方 式 都在进行有丝分裂,各种器官内都 可进行 2.细胞分裂一次,染色体分裂一次 细胞分裂二,染色体只分裂一

次 3.母细胞产生 2 个子细胞,并且每个子细胞 胞的染色体 中的染色体数为 2n。 4.中期:以染色体为单位排列在赤道板上, 于赤道板两 发生联会,不产生交换。 后期:以染色单体为单位向两极移动,从 极移动,2n 而不出现减半的现象

母细胞产生四个子细胞,子细 数为 n。 中期Ⅰ:以二价体为单位排列 测产生联会,并发生交换。 后期Ⅰ:以染色体为单位向两 →n 根本原因是以染色体移动 还是以染色单体移动, 同源染 色体被分开,出现减半现象。

第三节 遗传的基本规律 (1)单位性状与相对性状 性状是指生物个体所表现出来的形态特征和生理 特征。 (2)一对相对性状的遗传表现 在杂交试验中,F1 表现一致,都只表现了一 个亲本的性状,这种现象称为杂交种一代的一致性。 将 F1 自交,即本株的花 粉受在本株的柱头上, 所得的 F2 出现了分离, 两个亲本的性状有都表现出来了, 这种现象陈伟杂种后代性状的分离现象。 (3)分离规律的解释 孟德尔是用遗传因子解释分离现象的。 (4)基因型、表现型及基因型分析 1、生物细胞内的基因组合成为基因型,如[CC][Cc]等。 2、对一个隐性个体来讲,起基因型只有一种。 (5)显性表现的相对性 相对性状之间都是显隐性的关系,而且显性性状的 表现程度与显性亲本的完全一样,这种显性表现称为完全显性。 不完全显性是指 F1 不表现显性亲本的性状,而表现双亲的中间性状。 共线性是指双亲性状同时在个体上表现出来。 二、独立分配规律 将孟德尔的遗传与细胞学理论结合起来推断的独立分配规律的实质是: 控 制两对或两队以上相对性状的基因分别存在于不同对的染色体上,它们彼此之 间互不融合,互不干扰,各自保持独立;在减数分裂想成配子是,同一对相对 基因所在同源染色体的分离而彼此分开,不同对的基因随所在非同源染色体的 随机组合自由组合,因而形成了带有不同基因组合的配子,不同组合配子的数 量是相等的;自交时,不同的雌雄配子又以同等机会相互自由组合,因而形成 了不同基因型,不同的表现型。 、两对相对性状的基因型分析 (三) 两对相对性状的基因型分析 、 同一对相对性状的遗传一样, 忧郁显性基因的作用, 同一种表现型的个体基 因型不一样。

三、连锁遗传规律 现代遗传学的研究已经证明, 在生物的各个染色体上存在着许许多多个基因 位点,它们就像一串珠子一样,按照一定的顺序排列着。因此,也形象的比喻 为染色体的串珠结构,每一个位点就是一个控制生物性状发育的基因。所以, 就把存在于同一染色体上的这些基因成为一个连锁群或基因群。 出现连锁遗传现象的原因, 从本质上讲是由于这两对基因存在于同源染色体 的不同部位上,在细胞减数分裂形成配子的过程中非姊妹染色体之间发生了片 段交换,上面的基因也随之交换了的缘故。 第四节 多基因控制性状的遗传 一、 质量性状的基因互作 1、 基因互补作用 2、 基因显性上位作用 二、 多基因控制的数量性状遗传 (一) 数量性状的遗传特点 1、 表现性状的遗传特点 2、 容易受化境条件的影响而发生变异 (二) 数量性状的遗传学解释 1、 数量性状遗传所涉及的基因较多,往往是几对,十几对、甚至几 十对。 2、 控制数量性状的多基因之间,通常不存在显隐性的差别,只存在 有效与无效的差别。 3、 数量性状的遗传受独立分配规律支配。 4、 有效基因对环境反应比较敏感,廷议基因型的不同个体之间,往 往因环境的不同而有不同的表现。 第五节 近亲繁殖与杂种优势 近亲繁殖也叫近亲交配, 是指血统或亲缘关系相近的两个个体间 近亲繁殖 的交配方式。 一、自交的遗传效应:1、自交使杂合体分离 2、自交可以导致隐性基因得 到纯和,使有害的隐性性状得以表现 3、自交可以使基因重新组合和稳定 二、回交及其遗传效应 回交是指杂种后代与相亲之一再次交配的过程。 回交的遗传效应可以使基 因型内轮回亲本的遗传组成逐代增加,非轮回亲本的遗传成分逐代减少。 杂种优势 杂种优势是指用两个性状相对不同的纯和亲本进行杂交,杂种 F1 在生长优势、生活力、抗逆性和产量方面比起双亲和互带都优越的现象。 影响杂种优势表现的因素 1、 双亲之间的相对差异大小 2、 双亲基因型纯和 程度的高低 3、环境条件的影响 杂种优势只表现在 F1, F2 开始杂种优势出现严重的 从 杂种优势的衰退现象

衰退现象。 第六节 基因突变和染色体变异 一、 基因突变 染色体的某个位点发生了分子结构的改变, 与 原来的基因形成了相对基因的现象,称为基因突变。 由基因突变而表现突变性的细胞或个体,称为突变体。突 基因突变的频率 变的频率是指在每一个时代中某一基因发生突变的几率。 基因突变的一般特征 1、 突变的重演性和可逆性 位基因 3、突变的有利性和有害性 2、 突变的多方向行和复等

第七节 细胞质遗传 由细胞质控制的生物性状遗传的现象称为细胞质遗 一 、 细胞遗传的概念 传。 比较常见的叶绿体所控制的性状遗传。 二、胞质遗传的表现 形成这种现象的根本原因是雌雄两性配子在细胞质上 三、胞质遗传的解释 的差异造成的。 植物雄性不育性是一种特殊的植物类型,指的 四、植物雄性不育性的遗传 是雄蕊发育不正常,没有正常的花粉或花粉败育,接受外来花粉能正常结实的 现状。 植物雄性不育的遗传特征 1、核不育型 2、质、核互作不育型 第八节 遗传学在植物育种上的应用 一、 在常规育种上的应用 1、 遗传的基本过滤是植物杂交育种的理论基础 2、 天然杂交引起的基因重组是自然变异的来源之一 3、 基因突变和染色体变异, 是引起性状变异和创造新物种的有效途径 二、 在杂种优势中的应用 杂种优势在生产实践上具有十分重要的意义,它是提高产量和改进品质的重要 途径之一。 第三章 遗传物质核酸

教学目标: 教学目标: 知识目标: 能说出核酸的种类; 简述核酸的结构和功能; 能力目标: 学会画脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的分子结构式;

比较 DNA 和 RNA 的区别; 教学重点: 教学重点: 理解核酸的结构和功能 教学难点: 教学难点: 脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的分子结构式; 比较 DNA 和 RNA 的区别; 教学用具: 教学用具: 多媒体电子课件; 课时安排: 课时安排: 1 课时; 课前准备: 课前准备: 学生预习课本知识时间 5 分钟; 可以安排学生到商店或超市了解一些核酸保健品及其功效; 教学过程: 教学过程: 引入: 一 引入: 你听说过“DNA 指纹法”吗?利用 DNA 侦破案件、寻找灾难死难者或者亲 子鉴定就是应用了这一方法,那么:1.DNA 是什么?2.为什么 DNA 能比较精 确地定位一个人的身份?3.你还了解哪些关于 DNA 鉴定的应用? 根据课本中的问题探究,讨论并回答相关问题。 核酸的分类: 二 核酸的分类: 阐述核酸的种类:DNA 的中文名称是脱氧核糖核酸,是核酸的一种,还有 一种叫做核糖核酸的物质,简称 RNA。核酸是细胞内携带遗传信息的物质,与 生物的遗传、变异、蛋白质合成有重要的关系(为后面的留下伏笔) 。 核酸在细胞中的分布: 在细胞中的分布 三 核酸在细胞中的分布: 实验: 在细胞中的分布。 学生自己阅读教材 P26~27 实验:观察 DNA 和 RNA 在细胞中的分布。 1.实验原理 实验原理: 1.实验原理: (1)甲基绿 + DNA → 绿色 吡罗红 + RNA → 红色 (2)盐酸能改变细胞膜的通透性,加速染色剂进入细胞,同时使染色体中 的 DNA 与蛋白质分离,有利于 DNA 与染色剂结合。 2.方法步骤 方法步骤: 2.方法步骤: (1)取口腔上皮细胞制片; (2)水解; (3)冲洗涂片;

(4)染色; (5)观察。 3.实验结果 结论: 实验结果、 3.实验结果、结论: (1)实验结果:细胞核呈现绿色,细胞质呈现红色。 (2)结论:DNA 主要分布在细胞核内,RNA 主要分布在细胞质中。 请学生思考:原核细胞的 DNA 位于细胞内的什么部位? 核酸是由核苷酸连接而成的长链: 三 核酸是由核苷酸连接而成的长链: 设问:为什么核酸能携带、储存遗传信息呢?这还得从学习核酸的结构入 手。由此阐述核酸的结构:核酸也象蛋白质一样,是一种大分子,而且也是由 一种叫做核苷酸的小单位组成的。 引导学生观察课本彩图中的两种核苷酸,展示问题:1.核苷酸的化学组成 是什么?2.组成 DNA、RNA 的核苷酸分别是什么,它们的主要差别是什么?3. 核苷酸之间是如何连接的?4.DNA、 RNA 分别还有什么碱基基础?5.尝试作出假 设,为什么核酸能携带、储存遗传信息? 对学生的回答进行更正和总结:1.核苷酸的共同点是一分子核苷酸是由一 份子磷酸、一分子五碳糖还有一份子碱基组成的;2.组成 DNA 的核苷酸是脱氧 核苷酸、组成 RNA 的核苷酸是核糖核苷酸;3.核苷酸之间是通过磷酸与五碳糖 交替连接而成的;4.DNA 还有的碱基是 A、T、G、C(如何去去记忆) ,RNA 中不 还有 T,U 代替了 T;5.DNA 和 RNA 上 4 种碱基就好像 4 个字母,可以记载任意 长度的内容。 用图表比较 DNA、RNA 的差异;理顺 DNA、RNA、核酸、核苷酸、碱基之间 的关系。 特别指出:部分病毒的遗传信息,直接储存在 RNA 中,如 HIV、SARS 病毒、禽 流感病毒等。 本节小结: 四 本节小结: 通过本节的学习,我们知道核酸是遗传信息的携带者,有 DNA 和 RNA 两类,都 由核苷酸组成,但两者在化学组成、分布、功能上都有区别。我们可以通过用 染色剂将细胞染色的方法观察 DNA 和 RNA 在细胞中的分布。 课堂练习: 五 课堂练习:见幻灯;

板书设计: 板书设计: 遗传信息的携带者── ──核酸 第3节 遗传信息的携带者──核酸 DNA(脱氧核糖核酸)

1.核酸的分类

RNA(核糖核酸) 核酸的功能核酸是细胞内携带遗传信息的物质,在生物体的遗传、变异和 2.核酸的功能 蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。 3.核酸在细胞中的分布 真核细胞的 DNA 主要存在于细胞核,但在线粒体和叶绿体中也有少量的分 布。RNA 主要存在于细胞质中,但在细胞核中也有少量分布。 核酸是由连接而成的长链(核酸的结构) 4.核酸是由连接而成的长链(核酸的结构) (1)化学元素组成:C、H、O、N、P 脱氧核苷酸 (2)一分子磷酸
一分子五碳糖 (核糖、脱氧核糖) 一分子含氮碱基 (A、T、G、C、U) DNA

核苷酸

RNA

(3)DNA 储存遗传信息的容量非常大 的比较表 5.DNA 与 RNA 的比较表 类别 DNA RNA 基本单位 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤核糖核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤核糖核苷酸 核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胞嘧啶核糖核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 尿嘧啶核糖核苷酸 腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G) 腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G) 碱基 胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T) 胞嘧啶(C)尿嘧啶(U) 五碳糖 脱氧核糖 C5H10O4 核糖 C5H10O5 磷酸 磷酸 磷酸

备课资源: 备课资源: 核酸在不同生物(细胞) 1.核酸在不同生物(细胞)中的分布状况 所有生物细胞都含有 DNA 和 RNA 这两类核酸。原核细胞 DNA 集中在拟核。 真核细胞 DNA 分布在核内,与蛋白质组成染色体(染色质) 。线粒体、叶绿体等 细胞器也含有 DNA。病毒或只含 DNA,或只含 RNA,从未发现两者兼有的病毒。 原核生物 DNA、质粒 DNA、真核生物细胞器 DNA 都是环状双链 DNA。所谓质粒是 指拟核 DNA 外基因,它能够自主复制,并表现出特定的性状。真核生物染色体 DNA 是线型双链 DNA。病毒 DNA 种类很多,结构各异。动物病毒 DNA 通常是环状 双链或线型双链。植物病毒基因组大多是 RNA,DNA 较少见。少数植物病毒 DNA 或是环状双链,或是环状单链。噬菌体 DNA 多数是线型双链,也有为环状双链

的。 参与蛋白质合成的 RNA 有三类:转移 RNA(tRNA) ,核糖体 RNA(rRNA)和 信使 RNA(mRNA) 。无论是原核生物或是真核生物都有这三类 RNA。20 世纪 80 年代以来,陆续发现许多新的具有特殊功能的 RNA,几乎涉及细胞功能的各个 方面。病毒 RNA 种类很多,结构也是多种多样的。 2.核酸中核苷酸的连接方式 核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子,无分支结构。核酸中的核苷酸以 磷酸二酯键彼此相连。DNA 中的脱氧核糖核苷酸,通过 3′,5′-磷酸二酯键连 接起来,形成直线形或环形多聚体。组成 RNA 的核苷酸也是以 3′,5′-磷酸 二酯键彼此连接起来的。 学生绘制的概念图:
核苷酸 化学键 核苷酸链 1或2条 核酸 种类

DNA

RNA

核苷酸

脱氧核苷酸 化学键 脱氧核苷酸链 2条

核糖核苷酸 化学键 核糖核苷酸链 1条

核酸 种类

主要分布 主要分布 细胞核 DNA RNA 细胞质

脱氧核苷酸 核糖核苷酸 课后反思:通过学生绘制的概念图以及课后与学生交流,学生普遍感受到 知识易理解、易接受。这让我感到采用多种教学方法,调动一切积极因素,让 包括 学生用眼观察,用口描述,用脑思考,用手制作,大幅度提高学生的课堂效率; 脱氧核糖 碱基 磷酸 碱基 核糖 并用概念图总结,使学生达到整体和局部统一,既有整体的框架,又有局部的 细节认识。

A、T、C、G

A、U、C、G

第三章

基因工程

课题: 课题:基因工程简介 教学目标: 教学目标: 1.基因工程的概念。 2.基因操作的工具和基本步骤。 3.基因工程的基本原理 教学重点和难点: 1.教学重点:基因工程的概念 2.教学难点:基因工程的基本原理。 教学方法: 引导法 教学工具: 学工具: 学工具

基因工程的基本步骤。

电子白板、多媒体课件等 教学过程: 教学过程: 一、导入新课 众所周知,对于大多数生物而言, DNA 是主要的遗传物质,有遗传效应的 DNA 片段叫基因,生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果。但是各种生 物间的性状千差万别这是为什么呢? 提出问题,引导学生回答:生物体的不同性状是基因特异性表达的结果。 列举几种生物的不同性状, 如下: 青霉菌能产生对人类有用的抗生素—— 1. 青霉素。2.豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气。3.人的胰岛日细胞能 分泌胰岛素调节血糖的浓度。 以上几种生物各自有其特定的性状, 这些性状都是基因特异性表达的结果, 但是人类能不能改造基因呢?能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定 性状呢?例如,让禾本科植物能够固定空气中的氮气;让微生物生产出人的胰 岛素、干扰素等药物。这样既节省了人力,又简化了生产,同时还不会对环境 造成污染。这种设想能实现吗?回答是可以的。通过科学家们的不断努力,在 20 世纪 70 年代终于创立了一种能定向改造生物的新技术——基因工程。 二、讲授新课 1.基因工程的概念 对于基因工程的概念,教师应在指导学生阅读教材的基础上,让学生理解 基因工程概念的两种不同的表述方式(标准概念和通俗概念),并通过提问的 方式指导学生找出概念中的关键词语, 便于学生的记忆, 最后由教师归纳列表, 引导学生独立完成。 操作环 操作对 基本过程 结果 基因工程的别名 操作水平 境 象 剪切→拼接→ 基因拼接技术或 DNA 重 生物体 DNA 分子水 剪切→拼接→导入 人类需要的基因 基因 组技术 外 平 →表达 产物 2.基因操作的工具 思考题: 在以上的基因工程培育抗虫棉的过程中, 关键步骤或难点是什么? 关键步骤一:抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键步骤二:抗虫基 因与运载体 DNA 连接。关键步骤三:抗虫基因进入棉细胞。 关键步骤一的工具:基因的剪刀——限制性内切酶。关键步骤二的工具:基 因的针线——DNA 连接酶。 关键步骤三的工具:基因的运输工具——运载体。 (1)基因的剪刀——限制性内切酶(简称限制酶)。 ① 分布:主要在微生物中。 ② 作用特点:特异性,即识别特定核苷酸序列,切割特定切点。 ③ 结果:产生黏性未端(碱基互补配对)。 ④ 举例: 大肠杆菌的一种限制酶能识别 GAATTC 序列, 并在 G 和 A 之间切开。

思考题:要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口?可产 生几个黏性未端? (2)基因的针线——DNA 连接酶。 ① 连接的部位:磷酸二酯键(梯子的扶手),不是氢键(梯子的踏板)。 ② 结果:两个相同的黏性未端的连接。 思考题:用 DNA 连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键? 用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键? (3)基因的运输工具——运载体 ①作用:将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件:能在宿主细胞内复制并稳定地保存。 具有多个 限制酶切点。具有某些标记基因。 ③ 种类:质粒、噬菌体和动植物病毒。 思考题:质粒上会存在某些标记基因,这些标记基因有什么用途?要想将 某个特定基因与质粒相连,需要用几种限制性内切酶和几种 DNA 连接酶处理? 3.基因操作的基本步骤。 (1)提取目的基因

(2)目的基因与运载体结合(DNA 连接酶)。 思考题:目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况? 有三种情况:目的基因与目的基因结合,质粒与质粒结合,目的基因与质 粒结合。 (3)将目的基因导入受体细胞。 导入方法:借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。导入过程: (运载体为质粒, 受体细胞为细菌) (4)的目的基因的检测和表达 检测:通过检测标记基因的有无,来判断目的基因是否导入。表达:通 过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。 考点解读: 考点解读:

基因工程是选修 3 中的一个重要命题领域。纵观近几年高考中,命题 主要集中在“基因工程的原理、技术和应用” ,赋分比重较大。本课的重点 就是基因工程的原理,这是高考的重点、热点,也是我们学习的重点。 教后反思: 教后反思:

一、基因工程 我们知道动物、植物、微生物都具有遗传性。在繁殖时, 生 物 把 自 己 的 遗 传 物 质 传 给 自 己 的 后 代 ,现 代 生 物 学 研 究 表 明 , 这 种 遗 传 物 质 叫 做 脱 氧 核 糖 核 酸 , 简 称 DNA, 每 一 个 DNA 上 都 有成千上万个基因片断,不同的基因决定了不同的生物性状。 基因工程即利用工程技术的方法,把某一生物体内的有用 基因分离提取出来在体外进行复制,或者用化学合成法制备出 我 们 所 需 要 的 基 因 ,然 后 把 这 段 基 因 连 接 到 受 体 生 物 的 D N A 上 , 这 样 受 体 生 物 就 有 了 我 们 所 需 要 的 性 状 。 如 ADP-葡 萄 糖 焦 磷 酸 化 酶 是 合 成 淀 粉 的 关 键 物 质 , 把 大 肠 杆 菌 的 ADP-葡 萄 糖 焦 磷 酸 化酶基因导入到马铃薯中, 20%以 上 。 目前农业上基因工程取得的成果主要有: 转 基 因 的 抗 病 植 物 :病 毒 病 是 农 业 生 产 上 的 主 要 病 害 之 一 , 每 年 植 物 病 毒 病 给 我 国 的 粮 食 作 物 、经 济 作 物 造 成 的 损 失 很 大 , 仅烟草番茄两种作物的损失就超过亿元以上,目前还没有有效 的药物来防治病毒病。利用基因工程技术把病毒的外壳蛋白基 因导入到植物细胞中,已成功地获得了抗病毒的植物。在这种 植物体内,病毒侵染之后的繁殖速度大大下降,从而减轻病毒 病的症状,或推迟病毒病的发生时间。目前几年我国已获得的 抗病毒作物种类有烟草、马铃薯、黄瓜、番茄等等,抗细菌、 真菌病害的转基因植物也在积极研究之中。 马铃薯块茎的淀粉含量即可提高

转 基 因 的 抗 虫 植 物 : Bt 是 种 常 用 的 生 物 农 药 , 其 重 要 成 分 是苏云金杆菌中的毒蛋白,它可以杀死害虫。当人们把这种毒 蛋白的基因转移到棉花中后,棉花就可在叶子里自己合成毒蛋 白,进而杀死棉铃虫,这就是人们常说的抗虫棉,它不用使用 农 药 , 省 时 省 工 , 而 且 降 低 了 环 境 污 染 。 1998 年 我 国 的 抗 虫 棉 种 植 面 积 已 超 过 1 0 万 亩 ,取 得 了 很 好 的 经 济 和 社 会 效 益 。除 此 之外,美国孟山都公司还用相似的方法育成了抗玉米螟玉米。 转基因的抗虫水稻、抗虫烟草、抗虫番茄也已培育成功,预计 不久的将来这些转基因作物即可在生产中大面积运用。 转基因的耐贮番茄:乙烯是一种植物激素,它可以促进植 物的果实成熟,科学家们通过转基因技术,使番茄在果实中形 成一种抑制乙烯合成的酶,乙烯的合成量大大降低,番茄不能 正常转色软化,大幅度延长了贮存期。华中农业大学利用该项 技术育成的番茄品种已通过品种审定,目前正在生产中推广。 现在人们利用转基因技术育成的转基因植物可说是多种多 样,如抗除草剂的水稻、大豆、棉花、烟草、油菜、番茄、马 铃薯、甜菜、花椰菜,转基因的雄性不育油菜,高氨基酸含量 的马铃薯,抗寒番茄等等。 转基因动物:动物转基因技术目前研究最多的是转生长激 素基因,人们发现,将人的生长激素基因转移到小鼠身上,小 鼠会奇迹般地长大,体重可达到普通小鼠的两倍;科学家们正 试图将人的生长激素基因转移到牛、羊、猪、鱼的身上,以期 它们长得更快更大。药用蛋白是一类十分昂贵的药品,荷兰科 学家把编码人的人乳铁蛋白基因转移到牛的身上,并从牛奶里 提取出了大量的人乳铁蛋白,大大降低了该药物的生产成本, 一头牛就如同一个制药厂。

基 因 工 程 除 直 接 改 良 动 植 物 品 种 外 ,它 对 农 业 还 有 一 些 间 接 起作用的例子,如作物冻害多数是由植物体内的水分结成冰晶 造成的,形成冰晶的一个先决条件就是植物表面要附有大量的 冰核细菌,如丁香假单胞菌、荧光假单胞菌等,假若通过转基 因技术将具有冰核基因的丁香假单胞菌和荧光假单胞菌变为冰 核基因缺失株,将它们喷到作物上即可起到预防冻害的作用。

第四章

细胞工程

一、 教材分析 本节是高中生物选修 3 第二章第一节,是本章的一个概述。本节的内容包 括细胞工程的发展、细胞工程的基本技术以及细胞工程的应用三个部分。 二、教学目标 1、掌握植物细胞与组织培养技术、细胞融合技术、细胞核移植技术、染色体工 程等。 2、了解细胞融合的方法。 3、举例说出细胞工程在遗传育种、生产药品、食品等方面的应用。 三、重点难点 1、重点·落实方案 重点 简述细胞工程的基本技术;举例说出细胞工程的应用 2、难点 难点 简述细胞工程的基本技术 突破方法:以问题作为引导,使学生对相关的概念进行小知识点的分解, 加强理解与记忆。同时配以相关的练习,做到讲练结合,从而突破难点。 教法、 四、教法、学法 在本节的学习中仍遵循“先学后教,当堂训练”的教学方法。 教法 1.指导学生预习教材,列出预习提纲,布置预习作业。 2.指导学生学会思考,根据预习情况提出问题,在教师的诱导下,分析问 题,最终得出结论,培养学生勤于思考的习惯,掌握善于思考的方法。 ●教学建议 2.整个教学过程以问题提纲的形式出现,由学生阅读、讨论后解答,最后

教师总结,体现学生在课堂上的主体地位。 学法 通过必修 1 到必修 3 的学习,学生已具备了细胞的结构、动植物细胞的比 较、花药离体培养技术、克隆及染色体的结构与功能等相关知识,为本节的学 习打下了基础。但是由于学习的时间较长,学生遗忘严重,教师应当在课前提 醒学生对相关知识进行复习。 另外,学生在阅读时要对应教师所提出的问题有目的的去分析,将教材内 容细化。 五、课时安排:2 课时 课时安排: 第一课时:回眸历史、细胞工程的基本技术 第二课时:细胞工程的应用 六、教学过程设计 第一课时 【自学指导一】 2 分钟阅读课本 39 页回眸历史——细胞工程的发展, 结合课本图文信息用 1 分钟时间填写《名师伴你行》17 页预习新起点 一 细胞工程的发展。 【当堂训练一】名师 18 页例 1、即讲即练 1(这一知识点较简单,学生阅 读完后即可掌握,且课本中每个例子配有相应图片,可提高学生学习兴趣) 【自学指导二】 阅读教材 P40 第 1-2 段内容 3 分钟,尝试理解并识记细胞工程的概念和分 类。 并从以下几点进行分析与讨论: 1、操作水平:细胞水平和细胞器水平 2、操作条件(环境) :体外无菌条件 3、操作技术:植物细胞与组织培养、细胞融合技术、细胞核移植技术、染 色体工程等 4、目的:按照人们的意愿改造细胞的生物学特性 5、结果:改良生物品种、创造新品种和加速繁育生物个体,获得某些有用 的细胞代谢产物 6、分类: (此处均为课本知识点, 解答难度较低, 可由学生回答并进行相应的补充。 ) 【自学指导语三】 阅读教材 P40 第 3-4 段及知识海洋 5 分钟,回答下列问题: 1、简述植物细胞与组织培养技术的过程。 2、说出细胞融合技术的概念。 3、常用的促融合方法有哪些?促融合因子有哪些?分别有什么优缺点? 4、动物细胞融合与植物细胞融合有什么差异? 为什么?

后教环节: 后教环节: 1、植物细胞与组织培养技术 (1) 依据原理:植物细胞的全能性(全能性的概念学生在必修 1 第五章 第二节已经学习过,且在第二节中也有介绍,此处可简单回忆) (2) 培养对象:离体的植物组织或细胞 (3) 培养条件:体外无菌条件和必要的生长条件 (4) 培养目的:使离体植物细胞或组织生长、增值、分化,形成新的组 织、器官和个体的技术 2、细胞融合技术 (1) 融合原理:细胞膜的流动性(结构特性) (2) 融合对象:2 个或多个不同细胞 (3) 促融合方法:生物法(病毒诱导融合法) ;化学法(聚乙二醇诱导融 合法、高浓度钙离子等) ;物理法(电场诱导融合法) (4) 融合结果:形成杂种细胞 (5) 融合过程:2 个或多个不同细胞的质膜发生粘连、破裂→细胞质发 生融合→发生核融合→形成杂种细胞 (拓展:融合后的细胞为异源多倍体,具有原融合细胞的全部遗传物质, 其染色体数目为原融合细胞染色体数目之和,且原融合细胞的性状在杂交 细胞培育的后代中均可显现) 【自学指导语四】 阅读教材 P41 3 分钟,说出细胞核移植技术的概念和染色体工程的概 念。 3、细胞核移植技术 (1) 概念:细胞核移植技术是将一个细胞的细胞核转移到另一个去除细 胞核的细胞中去,从而使受体细胞获得新的遗传信息,产生新的生 命现象的技术。 (2) 处理方法:用微吸管把一个细胞中的细胞核吸出后直接转移到另一 个去除细胞核的细胞中 (3) 供体细胞:提供细胞核(常用体细胞) (4) 受体细胞:提供细胞质 (5) 操作仪器:显微操作仪 (拓展:移植后的细胞发育成的个体的基因型与表现型与提供细胞核的个 体一致,但也可能受到基因突变、染色体变异及细胞质遗传的影响) 4、染色体工程 (1) 处理方法:消减、添加或替换同种或异种染色体 (2) 目的:定向改变遗传性状和选育新品种 (3) 应用:用于培育抗病新品种(如多倍体育种) ;也是基因定位和染色 体转移等基础研究的有效手段 【当堂训练二】

一、 细胞工程的概念 应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的试验方法或技术,在细 胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品 或新生物体的有关理论和技术方法的学科。 植物细胞工程原理 1902 年,德国植物学家 Haberlandt 提出了细胞全能性的假想。 1934 年,White 首次定义为: 每个植物活细胞在合适的条件下,都有发 育为胚的能力。 70 年代,扩大了以上定义范围,认为:植物活细胞不但能形成胚状体, 而且能发育为完整植株。 80 年代初,认为:任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植 株的那种合成药用成分的能力,即培养细胞的药物生物合成的能力。 细胞工程是生命科学领域的一个组成部分。 就学科而言, 它是涉及细 胞生物学、发育生物学和遗传学等多门学科的综合科学。 细胞工程以细胞培养技术、细胞融合技术为基础,现已被广泛应用 于多个学科的基础研究工作以及农业、医药与食品等生产中。 近年来细胞工程的开发和应用主要集中在细胞杂交, 快速无性繁殖 和细胞育种等方面。细胞工程在新技术革命的浪潮中对农业、食品等传 统工艺革新有着重大的影响。 二、植物原生质体的培养与融合 1.细胞培养技术 细胞培养技术是指动物和植物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。 即将机体内某一组织取出,使其分散成单个细胞,在体外人工的生长条 件下培养,使细胞生长和不断增殖。 2.细胞融合技术 指两种不同亲株经酶法去除细胞壁得到两个原生质体,并在助融剂作用 下互相凝集并发生细胞间的融合,进而导致基因重组,获得新菌株。 其融合频率明显高于常规杂交数倍至几十倍。对促进基因重组、遗传育 种、选育优良品系,以达到高产优质具有重要实践意义。 三、植物细胞培养与次生代谢产物的生产 1、主要指植物细胞培养技术,以前称之为植物组织培养,是一种将植物 的组织、器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养技术。 最常见的植物细胞培养技术有愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、基

尖分生组织培养、原生质体培养和固体化细胞培养几大类型。 四、植物花粉培养 1、 无菌条件下取出花药或从花药中取出花粉粒→置于人工培养基上→形成花 粉胚或愈伤组织→花粉植株(单倍体); 五、植物胚胎培养 包括成熟胚培养、幼胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养、试管受精 等类型。1904 年 Hanning 最早成功培养萝卜和辣根的胚。 1、 胚培养技术 (一)离体胚培养:包括成熟胚及幼胚的培养。 植物胚胎发生过程: 原胚--球形胚--心型胚--鱼雷胚--子叶胚 2、成熟胚培养: 成熟胚为子叶期以后的胚,其在简单的培 养基上即可萌发生长。对营养条件要求不严格。 主要用来繁殖不易萌发植物,或研究胚和胚 乳及子叶的关系等。 3、幼胚培养: 幼胚(心形胚阶段)对培养条件和营养的要求都较高。 需要多种的营养 和适宜的培养条件。 影响幼胚培养成功的因素主要包括幼胚发育时期、培养基及培养条件等 2、胚珠和子房培养: 胚珠和子房培养 1、胚珠培养: 包括授粉胚珠和未授粉胚珠的培养。 1942 年最早在兰花上获得成功,缩短了授粉到成熟的时间。 1980 年成功培养了未授粉的非洲菊、烟草的胚珠,获得了单倍体植株。 3、胚乳的培养 胚乳在被子植物中是双受精的产物, 由极核和雄配子结合成的三倍体组织。 而裸子植物胚乳在受精前形成,为单倍体。 仅 40 多种植物进行胚乳培养研究,20 种获得再生植株,如猕猴桃等。多存在 混倍现象。 4、植物人工种子 植物人工种子是指通过植物组织培养的方法获得的, 既有正常发育能力的材

料,外面宝贝特定的物质,在适于条件下可以萌发成苗的植物幼体,也成为 合成种子活日细胞种子。

第六章

植物组织培养技术

一、植物组织培养的概念和意义 植物组织培养的概念和意义 植物组织培养(Plant cultre): 植物组织培养(Plant tissue cultre) 在无菌条件下,把植物的 外植体(器官、组织、细胞、原生质体等)接种到培养基(medium)上,在人为控 制的条件下,使其长成完整的植株。 外植体(explant):把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或 外植体(explant): (explant) 器官叫外植体。 初代培养:外植体的第一次培养。 初代培养 继代培养:第二次以上的培养(由转入新的培养基上继续培养) 继代培养 愈伤组织(Callus) 愈伤组织(Callus) 指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。 在组织培养中, 是指在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。

二、植物组织培养的特点 1、生长周期短,繁殖率高 2、培养条件可认为控制,利于工厂化生产 3、培养材料经济,来源广泛 三、细胞分化与形态建成 单细胞的分离 1.愈伤组织诱导 不同的植物彩用不同的方法用不同的外植体诱导形成愈伤组织。愈伤组织 反复继代,使组织不断增殖,提高愈伤组织的松散性。 2.单细胞悬浮液的制备 将愈伤组织在液体培养基中培养,建立悬浮培养物,进而通过振荡培养, 使愈伤组织形成细胞团,小细胞团甚至是单细胞分散培养物,再进一步通过细 胞筛过筛得到单细胞悬液。 二、单细胞培养的方法 (一)看护培养法 指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞,并使其生长和增殖的方法。

可诱导形成单细胞培养系。Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养,诱导花粉形成单倍体细胞系。 基本操作步骤为: (1)在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基,灭菌后备用。 (2)在无菌的条件下,先将一小块(1cm)活跃生长的愈伤组织接种到培 养基上,再在愈伤组织块上放一片(1cm?)已灭菌的滤纸,然后放置一个晚上。 (3)将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 (4)恒温培养。 此法简便易行,效果好,易于成功。但是不能在显微镜下直接观察细胞的 生长过程。 微室培养法 即将细胞培养在很少量的培养基中。在培养过程中可以连续进行显微观察, 将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 (二)微室培养法 (1)微室内不能有气泡。 (2)最好微室的厚度不要超过 20 微米,盖玻片 的厚度要在 0.17~0.18 毫米左右。 (3)观察时要保持温度和培养时的一致。 (三)平板培养法 是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的 培养方法。该方法是 Bergmann(1960 年)首创。用于分离单细胞无性系,研究其 生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、 原生质体及融合产物的培养。该法的特点为:可以定点观察;分离单细胞系容 易;但培养细胞气体交换不畅。平板培养的基本技术: (1)单细胞悬浮液的制备 (2)悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度(即初始植板密度)为 1×10 ?~100×10 ? 个 /ml 。 初始植板密度:单细胞固体平板培养时,细胞悬浮液接种到琼脂培养基上 最初细胞密度。 若悬浮液与培养基以 1:4 混合, 则应把悬浮液的细胞密度调到 5×10 ?- 500 ×10 ? 个/ml。 (3)琼脂培养基配制 1.4% 琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 (4)平板制作

细胞悬浮液与融化状态(35 ℃ )条件培养基按一定比例均匀混合,倒成 平板,盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 (5) 培养 26℃置暗处培养 21 天。低倍显微镜观察, 记数单细胞或小细胞团,计算 置板效率(也称植板率) 。 三、影响单细胞培养的因子 1.条件培养基 条件培养基可有利于单细胞的生长与分裂 2.细胞密度 临界密度:单细胞培养时,初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分 裂和发育成细胞团,则该值就是临界密度。 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变,培养基越复杂则植板细胞 的临界密度越低,反之则相反。一般要求每毫升在 1000 个细胞以上。 3.生长物质 生长激素加 1 种细胞分裂素和几种氨基酸。 临界密度只需 25-30 细胞/毫升。 4.pH 5.CO2 四、植物的再生分化类型 1、 无菌短枝姓 原球菌型 2、 芽增殖性 3、 器官发生型 4、 胚状体发生型 5、

第二节, 第二节,植物组织培养的设施设备 一、设计 一个标准的组织培养实验室应当包括:洗涤室、配置室、无菌室、培养室、 观察室等。在实际中可结合可行条件,合并一部分。 (一)洗涤室(cleaning room) 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水 槽,最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿,可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 备有塑料筐,用于运输培养器皿。备有干燥架,用于放置干燥涮净的培养器皿。 (二)准备室(repairing room) 准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、 清洗与整理工作。如果房间较多,可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗

涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作; 配置室则负责培养基的配制、 分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)缓冲室 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋,戴上口罩。应 当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。 (四)无菌操作室(transfering room) 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无 菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。 在工作方便的前提下,接种室宜小不宜大,一般 7~8m2,要求地面、天花 板及四壁尽可能密闭光滑,易于清洁和消毒。配置拉动门,以减少开关门时的 空气扰动。 接种室要求干爽安静,清洁明亮。在适当位置吊装 1-2 盏紫外线灭菌灯,用 以照射灭菌。最好安装一小型空调,使室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与 外界空气对流。 (五)培养室(culturing room) 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培 养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源 为原则。高度比培养架略高为宜,周围墙壁要求有绝热防火的性能。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成,一般 设 5 层,最低 一层离地高约 l0cm,其他每层间隔 30cm 左右,培养架即高 1.7m 左右。培养 架长度都是根据日光灯的长度而设计,如采用 40W 日光灯,则长 1.3m,30W 的长 lm,宽度一般为 60cm。 培养室最重要的因子是温度,一般保持在 20~27℃左右,具备产热装置, 并安装窗式或立式空调机。 由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度, 最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在 70%~80%为好,可安装加湿器。 控制日光照时间可安装定时开关钟,一般需要每天光照 10~16h 也有的需 要连续照明。短日照植物需要短日照条件,长日照 植物需要长日照条件。现代 组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能 源,而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。 (六)驯化室 驯化室要求清洁无菌,配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、 光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。 (七)温室

应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调 节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。

二、仪器设备和器皿用具 (一)仪器设备(见实验室设计) 1.超净台,优点是操作方便自如,比较舒适,工作效率高,准备时间短。 开机 10 分钟即可操作, 可进行长时间使用。 在工厂化生产中, 接种工作量很大, 需要经常长久地工作时, 超净台是很理想的设备。 超净台功率在 145~260W 左 右,它装有小型鼓风机,使空气穿过一个前置过滤器,在这里把大部分空气尘 埃先过滤掉,然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器,它除去了大于 0.3um 的尘埃、细菌和真菌孢子等,最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的 流速为每分钟 24~30m,这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染,这样的流 速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作,就 可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。超净台分水平式和垂直式二种 型号。 2.无菌箱,在投资少的情况下,可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠 密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制,准备 时间长,工作效率低。 3.空调机,保证室内温度,一般为 25±2℃,应安置在室内较高的位置。 以便于排热散凉。 4.除湿机,培养室的湿度应为 70~80%,湿度过高易长杂菌,湿度过低培 养器皿内的培养基会失水变干,影响培养物的生长。 5.恒温箱,用于植物材料的培养,可以控制温度、湿度及光照等。 6.烘箱,用于干燥洗净的玻璃器皿,也可用于干热灭菌和测定干物重。用 于干燥需保持 80~100℃;进行干热灭菌需保持 150℃,达 1~3h;若测定干物 重,则温度应控制在 80℃烘干至完全干燥为止。 7.高压灭菌锅,用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用 小型手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产,应选用大型立式的或卧式 的高压灭菌锅。通常以电作能源。 8.冰箱,主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材 料等。 9.电子分析天平和托盘天平,电子分析天平,用于称取大量元素、微量元 素、维生素、激素等微量药品精确度为 0.0001g;托盘天平用于称取用量较大 的糖和琼脂等,其精确度为 0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台 上。

10.显微镜及解剖镜,种类较多,用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。 双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时,便于观察、操作,通常放大 5-80 倍。放 大 40 倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。 为进行操作, 要有照明 装置。解剖镜上带有照相装置,根据需要随时对所需材料进行摄影记录。 11.水浴锅,用于溶解难溶药品和熔化琼脂条 12.摇床与转床、用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体 的解离。一般在液体培养中转速为每分钟 100 次左右,在解离原生质体时为每 分钟 80 左右。 13.磁力搅拌器,磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质,如各种化学物质、 琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热,使之更利于溶解。 14.电蒸馏水器,电蒸馏水器,采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配 制母液或培养基,配制培养基可用自来水来代替,若实验要求严格的话,则须 用蒸馏水。 15.酸度计,组织培养中培养基 pH 值的准确度是十分重要的,应当使用酸 度计,若无酸度计,也可使用 pH 试纸进行粗测。 首次使用酸度计前,应用标准液调节定位,然后固定。测量 pH 值时,待测 液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高,测量时要调整 pH 值计上的温度 扭使之和培养基温度相当。 注意保护好玻璃电极, 用后电极应用蒸馏水冲洗净, 盖上电极帽。 16、离心机,用于收集原生质体,转速要求较低。一般为 1000~4000rpm 即可。 (二)各类器皿 1.培养器皿:在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要 求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成,以保证长期贮存药品及培养的效果;培养 用的还要求透光度好,能耐高压高温,能方便放人培养基和培养材料的器皿, 根据培养的目的和要求,可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、 三角瓶、培养皿等使用较多。 最常使用的是三角瓶,规格有 l00ml,250ml,500ml 等,一般使用 l00ml 三角瓶,无论静止或振荡培养皆适用。其培养面积大,利于组织生长,受光也 比试管好。由于瓶口较小,亦不易污染。 培养皿常用 9、12cm 直径等规格,要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、 原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离 等都需采用。 试管常用 18mmXl80mm 或 20mmX200mm 规格。 可用于培养较高的试管苗, 另外也不易污染。

培养器皿还可就地取材, 采用一些代用品。 工厂化生产可采用广口的 200ml 罐头瓶,加盖半透明的塑料盖,由于瓶口大,所以大量繁殖时操作方便、工作 效率高,也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。 目前,培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑 料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点,如培养容器多为平底方盒 形,可提高培养空间利用率的植株数,并能一层层地叠摞起来,从而节约空间。 这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成,能耐高温,可进行高压灭菌。有些产 品为一次性消耗品,不但可节省洗涤人工,还可节省时间,提高效率。一次性 塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶,无须另外配盖,使用时比较方便。 瓶口封塞可用多种方法,要具有一定的通气性和密闭性,以防止培养基干 燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染,且不易保 持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,以线绳结扎或橡皮圈 箍扎。为了增加通气性,可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便,且 通气好。也可采用专用的封口膜。 2.分注器,小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用“下 口杯”作为分装工具,在“下口杯”的下口管上套一段软胶管,加一弹簧止水 夹,使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时,可考虑采用液体自动定量 灌注设备。 3.离心管,用于离心收集原生质体,一般用 5ml、10ml 规格。 4.刻度移液管,常用的有 0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml。用于 配制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支,分开使用。 5.细菌过滤器,用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用 0.22um 微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头,注射器或采用抽滤装置:真空泵、 吸滤瓶、滤气玻璃管等。 6.实验器皿,在组织培养中配制培养基,贮藏母液,材料的消毒等需要各 种化学实验用的玻璃器皿,包括 100ml、250ml、500ml、1000ml 烧杯;l0ml、 l00ml、1000ml 量筒;l00ml、1000ml 试剂瓶(棕色)等等。 (三)器械用具 1.镊子类(forceps) 常应用医疗上的镊子。 根据操作需要有各种类型, 若用 l00ml 的三角瓶作为 培养瓶,可用 20em 长的镊子。镊子过短.容易使手接触瓶口,造成污染。镊 子太长,使用起来不灵活。如在分离茎尖幼叶时,则用钟表镊子。 2.剪刀类(scissors) 可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用 弯形剪刀,由于其头部弯曲,可以深入到瓶口中进行剪切。

3.解剖刀 切割较小材料和分离茎尖分生组织时,可用解剖刀。刀片要经常调换,使 之保持锋利状态,否则切割时会造成挤压,引起周围细胞组织大量死亡,影响 培养效果。 4.解剖针 解剖针可深入到培养瓶中,转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的 幼叶,可以自制。 5.接种工具 包括接种针、接种钩及接种铲,由白金丝或镍丝制成 6.钻孔器 用于取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时采用。一般为 T 字型。口径有 各种规格。 7.其它 包括酒精灯,电炉,试管架,搪瓷盘等多种。 第三节 培养基 目的要求: 目的要求: (1)一般掌握培养基的种类、特点; (2)掌握基本培养基的配方; (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量; (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤; (5)熟练掌握培养基的灭菌方法; (6)一般掌握培养基的筛选办法。 培养基(culture medium)是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下, 不同种植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对营 养的要求也不相同,只有满足了它们各自的特殊要求,它们才能很好地生长。 因此,没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官,在建立一项新的 培养系统时,首先必须找到一合适的培养基,培养才有可能成功。在植物组织 培养历史进程中,事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求 的不断认识,对已有培养基的改进,或者将新发现的植物激素、新的有益成分 应用于培养基之中,都大大促进了组织培养研究的迅速发展,取得越来越多的 成功。 一、培养基的成分

培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支 持材料等五大类。 1.水 水是植物原生质体的组成成分,也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生 命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水,以保持母液及 培养基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变质'大规模生产时可用自来水。但在 少量研究上尽量用蒸馏水,以防成分的变化引起不良效果。 2.无机元素(inorganicelement) 大量元素,指浓度大于 0.5mmol/L 的元素,有 N,P,K,Ca,Mg,S 等。其作用是: (1) N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成 分,是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以 N03-N 和 NH4-N 两种形式供 应。大多数培养基既含有 NO,-N 又含 NH4-N。NH4-N 对植物生长较为有利。 供应的物质有 KN03、NH4NO3 等。有时,也添加氨基酸来补充氮素。 (2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷 也是 ATP、ADP 等的组成成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷, 不仅增加养分、提供能量,而且也促进对 N 的吸收,增加蛋白质在植物体中的 积累。常用的物质有 KH2P04 或 NaH2P04 等。 (3) K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K 增加时, 蛋白质合成增加,维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不 易过大,一般为 1-3mg/L 为好。制备培养基时,常以 KCl、KNO,等盐类提 供。 (4) Mg、S 和 Ca、Mg 是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S 是含 S 氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以 MgS04·7H20 提供。用量为 1~3mg/L 较为适宜;Ca 是构成细胞壁的一种成分,Ca 对细胞分裂、保护质膜不受破坏 有显著作用,常以 CaCl2·2H20 提供。 (5) 微量元素 指小于 0.5mmol/L 的元素,Fe,B,Mn,Cu,Mo,Co 等。 铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时,它又是 叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促 进作用。 在制做培养基时不用 Fe2(S04)3 和 FeCl3(因其在 pH 值 5.2 以上, 易形 成 Fe(OH), 的不溶性沉淀), 而用 FeS04·7H20 和 Na2-EDTA 结合成螯合物使用。 B,Mn,Zn,Cu,Mo,Co 等,也是植物组织培养中不可缺少的元素,缺少这 些物质会导致生长,发育异常现象。 总之,植物必需营养元素可组成结构物质,也可是具有生理活性的物质, 如酶、辅酶以及作为酶的活化剂,参与活跃的新陈代谢。此外,在维持离子浓

度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供 应不足时,愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮,会表现出一种花色素苷 的颜色,不能形成导管;缺铁,细胞停止分裂;缺硫,表现出非常明显的褪绿; 缺锰或钼,则影响细胞的伸长。 3.有机化合物(organic compound) 培养基中若只含有大量元素与微量元素,常称为基本培养基。为不同的培 养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下 几类: (1) 碳水化合物:最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可 支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有 应用。蔗糖使用浓度在 2%~3%,常用 3%,即配制 1L 培养基称取 30g 蔗糖, 有时可用 2.5%, 但在胚培养时采用 4%~15%的高浓度, 因蔗糖对胚状体的发 育起重要作用。不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来 看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些。不同植物不同组织 的糖类需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。高压 灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生产时,可用食 用的绵白糖代替。 (2) 维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参 与多种代谢活动,对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞 在培养中都能合成所必需的维生素,但在数量上还明显不足,通常需加入一至 数种维生素,以便获得最良好的生长。主要有 Vsl(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡 哆醇)、Vpp(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB2 等。一般 用量为 0.1~1.0mg/L。有时用量较高。Vm 对愈伤组织的产生和生活力有重 要作用,VB6 能促进根的生长,Vpp 与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc 有防止组织变褐的作用。 (3) 肌醇 (myo-inosit0l)又叫环己六醇,在糖类的相互转化中起重要作用。 通常可由磷酸葡萄糖转化而成,还可进一步生成果胶物质,用于构建细胞壁。 肌醇与 6 分子磷酸残基相结合形成植酸,植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙 镁,植酸可进一步形成磷脂,参与细胞膜的构建。使用浓度一般为 l00mg/L, 适当使用肌醇,能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞 的繁殖、分化有促进作用,对细胞壁的形成也有作用。 (4) 氨基酸(aminoacide) 是很好的有机氮源,可直接被细胞吸收利用。培养 基中最常用的氨基酸是甘氨酸,其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白,它们是牛乳 用酶法等加工的水解产物, 是含有约 20 种氨基酸的混合物, 用量在 10~1000mg

/L 之间。由于它们营养丰富,极易引起污染。如在培养中无特别需要,以不 用为宜。 (5) 天然复合物 其成分比较复杂,大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化 合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用,但对器官的分化作用 不明显。它的成分大多不清楚,所以一般应尽量避免使用。 1) 椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。 一般使用浓度在 10%~20%,与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组 织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明 显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过 1mm 时,椰乳就不发生作用。 2) 香蕉 用量为 150~200ml/l。用黄熟的小香蕉,加入培养基后变为紫色。 对 pH 值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用,对发育有促进作用。 3) 马铃薯(potato) 去掉皮和芽后,加水煮 30min,再经过过滤,取其滤液使 用。用量为 150~200g/L。对 pH 值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 4) 水解酪蛋白 为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度为 100~ 200mg/L。受酸和酶的作用易分解,使用时要注意。 5) 其他 酵母提取液(YE)(0.01%~0.05%),主要成分为氨基酸和维生素 类;麦芽提取液(0.01%-0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的 胚乳等。·遇热较稳定,大多在培养困难时使用,有时有效。 4.植物激素(hormone) 是植物新陈代谢中产生的天然化合物,它能以极微小的量影响到植物的细 胞分化、分裂、发育,影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰 老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动,在培养基的各成分中,植物激 素是培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用。 (1)生长素类 (auxin) 在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成, 诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面,根对生长素最敏 感。在极低的浓度下,(10-5~10-8mg/L)就可促进生长,其次是茎和芽。天然 的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体 内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。 IAA (indoaceticacid,吲哚乙酸) 是天然存在的生长素,亦可人工合成,其 活力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小,高温高压易 被破坏,也易被细胞中的 IAA 分解酶降解,受光也易分解。 IBA (indolebutyric acid,吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 NAA (naphthaleneaceticacid,萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比 IAA 高 出 3~4 倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所以应

用较普遍。NAA 和 IBA 广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和 生长。 2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸) 起动能力比 IAA 高 10 倍,特别在促进愈伤组 织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育。适宜的用量 范围较狭窄,过量常有毒效应。 生长素配制时可先用少量 95%酒精助溶。2,4-D 可用 0.1mol/L 的 NaOH 或 KOH 助溶。生长素常配成 1mgdml 的溶液贮于冰箱中备用。 (2) GA (gibberellicacid, 赤霉素) 有 20 多种, 生理活性及作用的种类、 部位、 效应等各有不同、培养基中添加的是 GA3,主要用于促进幼苗茎的伸长生长, 促进不定胚发育成小植株; 赤霉素和生长素协同作用, 对形成层的分化有影响, 当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化,比值低时有利于韧皮部分化; 此外,赤霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器 官形成后,添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。 赤霉素溶于酒精,配制时可用少量 95%酒精助溶。赤霉素不耐热,高压灭 菌后将有 70%~100%失效,应当采用过滤灭菌法加入。 (3)细胞分裂素类 (cytokinin) 这类激素是腺嘌呤的衍生物,包括 6-BA(6-苄 基氨基嘌呤)、Kt(kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中 Zt 活性最强,但 非常昂贵,常用的是 6-BA。 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:①诱导芽的分化促进侧芽萌发生 长, 细胞分裂素与生长素相互作用, 当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时, 诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。 ②促进细胞分裂与扩大。 ③抑制根的分化。 因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖,而避免在生根培 养时使用。 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织、是长根还是 长芽。如为了促进芽器官的分化,应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养 基中生长素与细胞分裂素的比例。 生长调节物质的使用甚微,一般用 mg/L 表示浓度。在组织培养中生长调 节物质的使用浓度,因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异,一 般生长素浓度的使用为 0.05~5mg/L,细胞分裂素 0.05~10mg/L。 5.培养材料的支持物 (1) 琼脂 (agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中 提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中,成 为溶胶,冷却至 40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的"煮化"培养基,就是使 琼脂溶解于 90℃以上的热水。琼脂的用量在 6~10g/L 之间,若浓度太高,培 养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固

性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度 好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外,还与 高压灭菌时的温度、 时间、 值等因素有关, pH 长时间的高温会使凝固能力下降, 过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐, 也会逐渐丧失凝固能力。 加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便,通气问题易 于解决, 便于经常观察研究等, 但它也有不少缺点, 如培养物与培养基的接触(即 吸收)面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,同时培养物 排出的一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用。市售的各种琼 脂几乎都含有杂质,特别是 Ca、Mg 及其他微量元素。因此在研究植物组织或 细胞的营养问题时,则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤 纸制成的滤纸桥,然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。 (2) 其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等,总的要求是排出的有害物质对培 养材料没有影响或影响较小。 6.抗生物质 (antibiotic) 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在 5~20mg/L 之间。添 加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,尤其是快速繁殖中,常 因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和 时间。尤其对大量通气长期培养,效果更好。对于刚感染的组织材料,可向培 养基中注入 5%~10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也 可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,可 能某些植物适宜用青霉素,而另一些植物却不大适应。值得提醒的是,在工作 中不能以为有了抗菌素,而放松灭菌措施。此外,在停止抗生素使用后,往往 污染率显著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成的。 7.抗氧化物 (antioxide) 植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质,接触空气中的氧气后,自动氧化 或由酶类催化氧化为相应的醌类,产生可见的茶色、褐色以致黑色,这就是酚 污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒,使培养的材料生长停顿,失去分 化能力,最终变褐死亡。在木本,尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。 目前还没有彻底完善的办法,只能按不同的实际情况,加用一些药物,并适当 降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法,使之有不同程度的缓解,当 然像严格选择外植体部位、 加大接种数量等也应一并考虑。 抗酚类氧化常用的 药剂有半胱氨酸及 Vc, 可用 50~200mg/L 的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表 面,或过滤灭菌后加入固体培

养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫 氨基甲酸酯等。 8. 活性炭 (active carbon) 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,它结构疏松,孔隙大,吸水力 强,有很强的吸附作用,它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小,吸附能力 越大。 温度低吸附力强, 温度高吸附力减弱, 甚至解吸附。 通常使用浓度为 0.5~ 0.8/L。 它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质, 包括琼脂中所含的杂质, 培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的 5-羟甲基糖醛及激素 等。茎尖初代培养,加入适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物; 其效力优于 Vc 和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成 和伸长,但其作用有一个阀值,一般为 0.1%~0.2%,不能超过 0.2%。 活性炭在生根时有明显的促进作用,其机理一般认为与活性碳减弱光照有 关,可能是由于根顶端产生促进根生长的 IAA,但 IAA 易受可见光的光氧化而 破坏,因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了 IAA,从而间接促进 了根的生长,由于根的生长加快,吸收能力增强,反过来又促进了茎、叶的生 长。此外,在培养基中加入 0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防 止产生玻璃苗有良好作用。 活性炭在胚胎培养中也有一定作用,如在葡萄胚珠培养时向培养基加入 0.1%的活性炭,可减少组织变褐和培养基变色,产生较少的愈伤组织。但是, 活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附 100ng 左右的生长调节 物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大 量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂。很细的活性炭 也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培养瓶。总之,那种随意抓一撮 活性碳放入培养基,会带来不良的后果。因此,在使用时要有其量的意识,使活 性炭发挥其积极作用。 第四节 植物组织培养的操作技术

一、外植体的选择 外植体是组织培养中的各种接种材料。包括植物体的各种器官、组织、细 胞和原生质等。 1.选择优良品种 对材料的选择要有明确目的,具有一定的代表性,以提高成功的几率,增 加其实用价值。 2.选择健壮植株 从生长健壮的无病虫的植株上,选取发育正常的器官或组织。

3.选择最适时期 组织培养选择材料时,要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。 4.选择适宜的大小 选取培养材料的大小一般在 0.5~1.0cm 之间。 外植体的灭菌( 二、外植体的灭菌(sterilization) ) 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。 有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表 面都是有菌的。依此观点,无菌室等未处理的地方、超净台表面、简单煮沸的 培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连 的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干 净等等都是有菌的。 这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点 是:极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐 力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或 化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的),高层大 气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学 元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出:在地球表面无菌 世界要比有菌世界小得多。 灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生 物体,即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、 消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细 菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上 还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使 用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下 进行的操作,就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的,甚至超过微生物的培养要 求,这是因为培养基含有丰富的营养,稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底 灭菌的目的,必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌,才能保证 培养时不受杂菌的影响,使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和 灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清 洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸 钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药 剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。

1.培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸 锅内,其中的蒸气不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内 温度也随之增加。在 0.1MPa 的压力下,锅内温度达 121℃。在此蒸气温度下, 可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气,使锅内 全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是 要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通 电后,待压力上升到 0.05MPa 时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零 后,再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到 0.1MPa 时,开始计时, 维持压力 0.1~0.15MPa, 20min。 按容器大小不同, 保压时间有所不同见表 4-1。 该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字,如果容器体积较大,但是放置的数量 很少, 也可以减少时间。 到达保压时间后, 即可切断电源, 在压力降到 0.5MPa, 可缓慢放出蒸气,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使 容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上, 以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面。一 旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入, 内外压力平衡,盖子便易开了。对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培 介质、接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时 间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长 时间。对于一些布制品,如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐 高压塑料袋装好,高压灭菌 20~30min。高压灭菌前后的培养基,其 pH 值下 降 0.2~0.3 单位。高压后培养基 pH 值的变化方向和幅度取决于多种因素。在 高压灭菌前用碱调高 pH 值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基 中含有高或较高浓度物质时, 高压灭菌后的 pH 值变化幅度较大, 甚至可大于 2 个 pH 值单位。环境 pH 值的变化大于 0.5 单位就有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。在 8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高 0.43 倍。培养基中的铁在高 压灭菌时会催化蔗糖水解,可使 15%~25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养 基值小于 5.5,其水解量更多,培养基中添加 0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解 大大增强,添加 1%活性炭,蔗糖水解率可达 5%。为防止高压灭菌产生的上述 一些变化可用下列方法 (1) 经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料, 以便及时采取有效 措施。

(2) 设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。 如避 免使用果糖和山梨醇而用甘露醇, IBA 代替 IAA, 以 控制活性炭的用量(在 0. 1% 以下)注意 pH 值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。 (3) 配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。 如将磷、 钙和铁放 在最后加入。 (4) 注意高压灭菌后培养基 pH 值的变化及回复动态。如高压灭菌后的 pH 值常由 5.80 升高至 6.48。而 96h 后又回降至 5.8 左右。这样在实验中就可以 根据这一规律加以掌握。 2.用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精中,使用之前取 出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用 250 或 500ml 的广口瓶,放人 95%的酒精,以便插入工具。 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到 160~180℃的温度来杀死微生物。由于在干热 条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用 170℃持续 90min 来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为 包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升 温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍 热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷 而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。 4.不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的, 不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为 0.45um 以下,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直 径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用 注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液 体装入注射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无 菌溶液。 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌 (1) 紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭 菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引 起细菌的染色体变异, 造成死亡。 紫外线的波长为 200-300nm, 其中以 260nm. 的 杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物 体表面的灭菌;而且要求距照射物以不超过 1.2m 为宜。

(2) 熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到 空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空 间关闭紧密即可。 化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统, 或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说 来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于 水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓 度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。 常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按 5~8m1/m3 用量,将甲 醛置于广口容器中,加 5g/m3 高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿 以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。 6. 一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料 表面等, 可用 70%的酒精反复涂擦灭菌, 1%~2%的来苏儿溶液以及 0.25%~ 1%的新洁尔灭也可以。 7.植物材料表面用消毒剂灭菌 三、外植体的接种和培养 从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染 源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面 灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物 材料叫做外植体(explant)。 首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如 用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自 来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮 或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时 可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在 植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想 的清洗物质是表面活性物质-吐温 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消 毒的烧杯、 玻璃棒、 70%酒精、 消毒液、 无菌水、 手表等。 70%酒精浸 10-30s。 用 由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之 70%酒精穿透力强,也很易 杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、 包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料, 则可只用 70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发 后再剥除外层,取用内部材料

第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取 1~2 种 使用见表1-3 表 1-3 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 持续时间/ 灭菌剂 使用浓度 去除的难易 效果 min 次氯酸钙 9%~10% 5~30 易 很好 次氯酸钠 2% 5~30 易 很好 氯化汞 0.1%,1% 5~8 较难 最好 抗菌素 4~50mg/L 30-60 中 较好 上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯 酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由 重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种 药剂残留的影响较小, 灭菌后用无菌水涮洗 3~4 次即可; 由于用升汞液灭菌的 材料,难以对升汞残毒较难去除,所以应当用无菌水涮洗 8~10 次,每次不少 于 3min,以尽量去除残毒。 灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消 毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱 除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前 1~2min,开始把消毒液倾人一备好的 大烧杯内,要注意勿使材料倒出,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗。灭菌时 间是从倒入消毒液开始, 至倒人无菌水时为止。 记录时间还便于比较消毒效果, 以便改正。灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积 偏小的容器中使用很多材料灭菌。 在灭菌溶液中加吐温-80 或 Triton X 效果较好,这些表面活性剂主要作用是 使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤 害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的 0.5%,即在 100ml 加入 15 滴。 最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次 3min 左右,视采用的消毒液种类, 涮洗 3~10 次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。 (一)外植体的接种——无菌操作 1.无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主 要由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。接种室 内保持定期用 1%~3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了 使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在使用期间用 70%的酒精或 3%的来苏儿 喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行:

(1) 在接种 4h 前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外灯进行灭菌; (2) 在接种前 20rain,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯; (3) 接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿托鞋等; (4) 上工作台后, 用酒精棉球擦拭双手, 特别是指甲处。 然后擦拭工作台面; (5) 先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子从头至尾过火一遍,然后 反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干; (6) 接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等; (7) 接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌 30rain。若连续接种, 每 5 天要大强度灭菌一次。

第五节, 第五节,植物脱毒技术 一、 茎尖培养脱毒 (一)通过茎尖培养脱毒的原理 1.病毒在植物体内的分布 感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,病毒的数量随植株部位及年龄 而异, 越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低, 生长点(约 0.1~1.0mm 区域) 则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间 连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。 2.茎尖大小与脱毒效果 在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大又不能保证完全除去病 毒。茎尖培养脱毒,由于其脱毒效果好,后代稳定,所以是目前培育无病毒苗 最广泛和最重要的一个途径。 (二)方法 1.取样与消毒 剪取顶芽梢段 3~5cm,削去大叶片,用自来水冲干净,在 75%酒精中浸泡 30s,用 1%-3%次氯酸钠溶液消毒 10~20min,最后用无菌水材料冲洗 4-5 次 2.剥取茎尖与接种 3.培养 接种后材料置 25±2℃,光照度 1500~5000lx,每日光照 10~16h 条件下培 养.光照对茎尖培养的影响更大 4.生根诱导 一些植物茎尖培养形成绿芽后,基部很快发生不定根.而另一些植物茎尖不 产生不定根,需经再诱导、生根才能成为完整植株 (三)培养基与培养方式

1.培养基 MS 培养基适于多种植物茎尖培养。 2.培养方式 在进行脱毒培养时,由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作,因而需要一台 带有适当光源的简单解剖镜(8~40 倍)。除了在进行植物组织无菌培养一般工 具外,还需要一套解剖刀。剥离茎尖时,应尽快接种,茎尖暴露的时间应当越 短越好,以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作,有助 于防止茎尖变干。和其他器官的培养一样,在进行茎尖培养时,首要是获得表 面不带病原菌的外植体。因此,一般来说,茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶 原基的严密保护,只要仔细解剖,无须表面消毒就可以得到无菌的外植体。有 时消毒处理还会增加培养物的污染率,所以选取茎尖前,可把供试植株种在无 菌的盆土中,放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片 上。 另外, 最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂, 可用多菌灵 0.1%和抗生素(如 0.1%链霉素)。 对于某些田间种植的材料, 可以切取插条插入 Knop 溶液中令其 长大,由这些插条的腋芽长成的枝条,要比由田间植株上直接取来的枝条污染 小得多。 为了保险起见,在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包 被严紧的芽,如菊花、兰花,只须在 75%酒精中浸蘸一下,而叶片包被松散的 芽,如香石竹,蒜和马铃薯等,则要用 0.1%次氯酸钠表面消毒 l0min。对于这 些消毒方法,在工作中应灵活运用,如在大蒜茎尖培养时,可将小鳞茎在 75% 酒精中浸蘸一下,再用灯火烧掉酒精,然后解剖出无菌茎芽。在剖取茎尖时, 把茎芽置于解剖镜下,一只手用细镊子将其按住,另一只手用解剖针将叶片和 叶原基剥掉,解剖针要常常蘸入 90%酒精,并用火焰灼烧以进行消毒。但要注 意解剖针的冷却,可蘸人无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织 充分暴露出来之后, 用解剖刀片将分生组织切下来, 为了提高成活率, 可带 1~ 2 枚幼叶,然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触,只 用解剖针接种即可。 将接种好的茎尖置于 22℃左右的温度下。 每天以 16h 2000~ 3000Lx 的光照条件下培养。由于在低温和短日照下,茎尖有可能进入休眠;所 以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。茎尖 培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同,这里不再叙述。

第六节

主要经济植物组织培养技术

一、 马铃薯的组织培养

马铃薯(Solanum.tuberosum)是一种全球性的重要经济作物。适应性广, 营养价值高,耐贮藏适运输,既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应 的重要蔬菜。 马铃薯原产于拉丁美洲,当被发现可以食用后,很快传到世界各地,成为 栽培很广的一种作物。但是,当发现从外地引种栽培 1~2 个周期后,明显发现 产量降低,植株变矮,并有卷叶的现象产生,经检测证明这是由于病毒引起的 退化现象。 危害马铃薯的病毒有 17 种之多,如 X 病毒、S 病毒、Y 病毒、M 病毒、A 病毒、奥古巴花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。由于马铃薯是无性繁殖作物,病 毒逐代积累,日益严重,引起严重退化。马铃薯卷叶病毒和马铃薯养病度的一 些株系,可使块茎产量减少 50%~80%。法国 Morel 和他的同时们,1955 年从患 病马铃薯植株中选取到了无病植株,为治疗作物病毒开辟了进途径。 ( 一)、特性和生物学习性 1、马铃薯的形态特性 (1) 根 马铃薯的根系由出生根和匍匐根两部分组成。 出生根在块茎发芽后 基部发生,构成其只要吸收根系。水者芽的伸长,陆续在芽的各个叶节处匍匐 茎的两侧及下方发生匍匐根,水平生长。 (2) 马铃薯分地上部分和地下部分, 茎 地上茎的主茎在形成 16 片叶子后, 由花芽封顶,并在花的下部发生两个侧枝,从而构成马铃薯的主要同化系统。 地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。块茎与匍匐茎相连的一端叫薯尾 或脐部,另一端叫薯顶,块茎表面分布着芽眼。薯顶压延分布较密,发芽早, 发芽势强,即具有顶芽优势。生产上的整薯播种、带着顶部芽眼切块,都是发 挥顶芽优势的有效措施。 (3)叶 马铃薯先出土的叶是初生叶,全缘,心脏形。以后发生的叶奇数 羽壮全裂单叶,在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。 (4)花 马铃薯的话为聚伞花序,第一或第二花序开放,恰是块茎强盛膨 大之时,此时是需要不断浇水的形态标志。 (5)果实、种子 马铃薯果实为球星或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。 中指可用来繁殖,但后代性状分离大。 2、生物学习性

马铃薯性喜冷气候,不耐高温和霜冻,解除休眠的块茎 4℃下发芽,发 芽适温为 12~18℃。地上茎叶生长温度为 17~21℃,25℃以上时生长不良,叶 变小, 超过 30℃和 7℃以下茎叶停止生长, -1℃时受冻。 块茎形成要求昼温 14~ 24℃,夜温 12~14℃,土温 16~18℃。土温 20℃以上时块茎形成缓慢,而且 容易引起退化,高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎,25~30℃时 已经长成的块茎也会小时而变成细长茎, 结薯期要求 12h 左右的短日照和疏松、 湿润、 肥活以及通气良好的土壤条件。 土壤板结, 薯块表面粗糙和薯形不整。 马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题, 表现为植株长势衰弱, 株形矮化, 分枝变少,薯块变小,产量逐降低,造成退化的原因和学说多种,综合而言, 主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老饿导致种性退化,而病毒和细菌病害的 浸染,以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度。 (二)、 栽培管理 种须经催芽处理,方法是播种前 30~40d,将选好的健康种薯装入袋或筐 中,放在 15~18℃和相对湿度 60%~70%的火炕上或室外,厚度以 2~3 层种薯 为易,保持 15~18℃和 7%~80%空相对湿度,晚间收回。经 15~20d,能形成 0.5~1.5cm 长、紫绿色粗壮的芽,芽基部已发生根尖和兢的原始体。 将催芽种薯纵切成 4~5 块, 每块 25g 左右, 1~2 个芽。 带 切口抹草木灰; , 放 20℃和 80~90%空气相对湿度下,促进伤口愈合,防块茎腐烂。3 月中旬左 右播种,密度为 60~70×15~30cm,开沟 10cm 深,播后覆土平均,增强 保墒。 干旱时,播前或播后浇水。播后覆盖地膜,可早出苗和增加产量。春薯可和棉 花或玉米间作。 春薯管理的重点在于促进早出苗 、早发棵、早结薯。80%出苗时中耕松土, 提高地温。奇苗后半月左右,行间撒硫酸铵 10~12kg,后浇水中耕,促发苗和 长棵迅速形成茎叶和地下匍匐茎。发棵初期施肥,以后适当控制肥水,地不汉 不浇水,多次浅耕保墒,防植株旺长面延长结薯。封垄前大培土一次,培土高 12~15cm,不埋没主茎的功能叶。开花后地下块茎膨大,要求湿润疏松的土壤, 在初花、盛花和终花期连浇三水。,这时期缺水会明显减产,后期可减少浇水, 更不能大水漫灌。收前 5~7d 停水,促薯皮老化,以利贮藏。 (三)、马铃薯脱毒技术 马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染,当条件适合时,病毒就会在植株内 增殖,转运和积累于所结块茎中,随着世代传递,病毒危害逐年加重,一般可

造成减产 50%以上。经科技人员研究发现,有 30 多种病毒易感染马铃薯,并 引起品种退化,严重影响到马铃薯的生产。通过微茎尖组织培养技术能从马铃 薯体内脱除 PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW 等病毒。 因此,采用组织培养技术,通过一定良种繁殖体系,生产优质种薯,是保 证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。 1.脱毒种薯生产程序 采用微茎尖组织培养的方法,诱导出苗,采用联免疫吸附试验法或指示植 物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒,经鉴定后,无主要病毒及类病毒的试管苗可 定为脱毒试管基础苗。试管基础苗在无菌条件下,采用固体、液体培养基相结 合的方法,进行扩繁基础苗,在防虫网室栽植或封闭温室扦插,生产出原原种 (或称脱毒小薯)。用原原种在一定隔离条件下产生原种 1 代,以后逐级称为 原种 2 代、良种 1 代、良种 2 代。 2.茎尖培养脱毒 (1) 取材和培养 一般多采用在室内发芽,芽经热处理(38℃)2 周。然后取顶芽或侧芽 1 厘米的茎尖,在自来水下冲洗 1h 左右,无菌条件下先用 95%的酒精浸润组织, 在用 5%的漂白粉溶液浸泡 5~10min, 然后用无菌水冲洗 2~3 次。 为了减少污 染机会,可将块茎彻底消除后,放在无菌容器中培养,然后在去取茎尖。分离 茎尖时,把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离,逐层剥去幼叶,露出圆滑的生 长点,可以留 2 个叶原基,随即接种于 MS 液体培养基上,每升加 0.1mgIAA 、 0.1mgGA3、p H 值 5.8。也可 White 培养基,附加 0.1~1mg/L 的 NAA 和 0.05 mg /L 的 BA。培养条件:21~25℃、3000 lx、16h/d。 (2) 继代和生根 培养成功的马铃薯脱毒苗,经鉴定后,采用固体、液体培养基相结合方法 括繁。取试管苗单节切段扦插在固体培养基上,每瓶可插 20 个左右茎段,经 20d 左右使可发育成 5~10cm 高小植株,可在进行切段繁殖,此法速度快,每 月可繁殖 5~8 倍,试管苗多节接种在液体培养基上,进行浅层静止液体培 养。 (3) 驯化 为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力, 移植前对试管苗要 进行光、温锻炼。炼苗期温室内的温度:白天 23~27℃,夜间不低于 14℃。

炼苗的具体方法是:移植前 7d 左右,将长有 3~5 片叶、高 2~3cm 的试管 苗,在不开瓶口的状态下,从培养室移至温室排好。移植时,将装好基质的营 养钵紧密的排放于温室内,已经整好的阳畦内,可采用珍珠岩作为基质,有条 件的话,也可采用灭过菌的疏松土壤。每 1m2 排放营养钵 300 个左右。排好后 用喷壶浇透水,将经光、温锻炼好的试管苗从瓶内用镊子轻轻取出,放到 15℃ 的水中洗去培养基,放入盛水的容器中,随时取随时扦插,防止幼苗失水。大 的幼苗可截为 2 段,每个营养钵插一个茎段,上部茎段和下部茎段分别扦插到 不同的钵内。一般情况,扦插后最初几天,每天上午喷一次水,保持幼苗及基 质湿润。 但喷水量要少, 避免因喷水过多造成地温偏低而影响幼苗生长和成活。 切忌暴热时间凉水浇苗。为提高水温,可提前用桶存水于温室中。随幼苗生长 逐渐减少浇水次数, 但每次用水量逐渐加大。 此外为保持温室中有较高的湿度, 以防幼苗茎皮硬化,影响切繁效果,在育苗不需要浇水的时候应将温室内所有 空地全都浇上水,在幼苗生长及整个切繁期,温室内的相对湿度保持正在 85% 以上,气温白天控制杂 25~28,夜间保持在 15 以上。基础苗切繁前和培育大 田定植苗,一般不在追肥。但基础苗开始切繁后2~3d 要喷一次营养液,此 后每隔10d 一次,直至切繁终止。 3. 脱毒苗切繁 基础苗成活进入正常后便可切繁, 但切繁量的多少和质量的高低, 除与 前边提到的水与温湿度条件有关外,能否掌握正确的切繁方法和适宜的切繁苗 龄也是非常重要的。 脱毒苗切繁主要是剪取顶部芽尖茎段(主茎芽尖和腋芽芽尖)直接扦插。正确 的切繁原则是:保证每次剪切后,基础苗仍能保持交好的株型和营养面积与较 多的茎节,不仅生长正常,而且又能萌发出多个腋芽供下次剪切,具体方法是: 扦插后 15 天左右,当基础苗长有4~5个展出叶、苗高 3.5~4厘米时进行首 次切繁。从基础苗茎基部上数2~3个茎芽上方,用锋利刀片将上部茎芽切下 (茎段不小于1厘米),扦插到浇透水的营养钵内。培育供大田定植的脱毒苗, 也可以作为供切繁的基础苗。如生产脱毒小整薯,可直接扦插到用营养土做好 作为的畦床上或备好的专用的无土培养盘中,扦插方法与扦插后的管理同试管 苗扦插方法与管理。 第一次剪切后 10 天左右, 基础苗上萌发的腋芽长大时进行 第二次切繁, 同第一次一样, 将剪切腋芽基部的第一个叶片留下继续萌发腋芽, 将上部茎尖芽段剪下扦插。如基础苗上出剪取的腋芽外,仍有多个未萌发或未

长大的腋芽时,可将牙牙全部切下。如果是高位腋芽,要连同着生腋芽的茎段 一起剪下,以便基础苗始终保持较好、有利于继续切繁的株型,延长切繁期, 以后无论切繁多少次,其方法和原则相同。在生产需要时间允许,所有切繁培 育成的脱毒苗均可作为基础苗进行切繁。 (四)、马铃薯无病毒苗的鉴定材料 1、指示植物鉴定 在马铃薯的病毒鉴定中,汁液鉴定中是最常用的方法,X病毒、S病毒和纺 锤块状病毒很容易通过汁液来接种。Y病毒、M病毒和A病毒等也可用此法来 接种。 2、鉴定寄生的准备 马铃薯病毒的寄生范围狭窄不一, 如卷野病毒只能感染茄科少数病毒。 而X 病毒除茄科外,还能感染笕科的千日红,藜科的笕色藜等。马铃薯常用的鉴定 寄生植物有笕科的千日红,茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等。寄生植物应在无虫网 室中培养,温度控制在 15~25℃,提供充足的肥、水、光等条件,保证幼苗健 壮生长。系统发病来鉴定寄生,一般用3~5片真叶的幼苗,局部发病的寄主 利用充分展开的真叶。每个病毒样品可接种3株,并做好标记。 3.接种液制备及接种 一般以表现病状明显的叶作为接种材料。叶片洗净后。在消毒的研钵中研 成糊状,用纱布滤出汁液,在意蒸馏水稀释 10 倍作为接种物,以防过浓的汁液 对鉴定寄生产生伤害作用。 在鉴定寄生植物的叶面,均匀的喷布 600 目的金刚砂,也可将金刚砂少许混入 接种物中,然后用左手心紧靠在寄主的背面,以右手实指蘸取接种液,均匀的 在叶背面擦过,以不造成叶片产生伤痕为度,最后把叶面上多余的接种物用清 水冲洗干净,放置在 15~24 的防虫室中,一般 5~10 天可发病。 (五)、马铃薯无病毒株的繁殖和保存 1.无病毒株的繁殖 通过茎尖培养只能得到很少的无病毒植株,而生产上需要数以万计的健康 种薯。 同时无病毒植株并没有对该病毒获得免疫能力, 仍会在繁殖中再次侵染。 如何在以后繁殖中防止受病毒再侵染是很关键的一环。目前在生产上来用的方 法很多,下面介绍主要的几种。 (1) 直接块茎繁殖

这是常用的方法,把少量无病毒小苗直接移入无虫网室的土壤中,利用产 生的块茎继续繁殖,并进行严格的病毒鉴定,一旦发现病毒再侵染,即行淘汰, 将经过5~6次繁殖的无病毒块作为一级原种,提供大田繁育体系作进一步扩 大繁殖。 (2) 扦插繁殖 把无病毒植株栽于无虫室的营养钵中,1~2个月以后切顶芽做插枝。切 去顶芽后,又处进侧芽发生,很快长成侧枝。扦插时,将扦插最下面的叶除去, 插入经过消毒的砂壤中,插入深度为两个节间。在插后1周时间内,维持土壤 湿润,插枝就能产生新根。有些插枝地下部分会结出块茎,应及时除去,否则 这些插枝不能生根,最后会枯死。经过 2 周多的生长时间,插枝就可以多移栽, 或供作进一步切取插枝的母株,或让其块茎提供一级原种。母株应经常更新, 防止因太老导致生根很困难。 (3) 组织培养切段繁殖利用试管保存无病毒植株资源是一有效途径。试 管植株体积小,占用的空间少,可大量地保存植株。长期保存马铃薯无病毒试 管植株的方法有两种: 继代培养: 对保存的无毒不断地继代培养,每个品种可以接种 2~10 瓶。 为便于保存可选用较大的 150ml 三角瓶,内加入一半以上体积的培养基。基琼 脂含量要高于一般培养基,可用不含激素牟基本培养基,以延缓小苗生长。每 瓶接种 2~3 个切段。 培养温度可在 5~25℃, 在较低温度下, 保存的时间更长。 用不含激素的基本培养基。光照度为 1000lx。为样每隔 2~3 个月继代培养一 次,达到保存的目的。 低温保存:当试管的植株长至 2cm 左右进,放入温度为 4℃的冰箱中,并放 在暗处保存,可达 1 年左右。

第七章 发酵工程

第一节 发酵工程概述 一、 发酵工程的概念和意义 发酵是指微生物讲有机物氧化释放的

电子直接交给底物,本身未完全氧化的某种中间产物,同时释放能

量并产生各种不同的代谢产物的工程。 二、发酵工程的种类 1、微生物菌体发酵 2、微生物酶发酵 5、生物工程

3、微生物代谢产物发酵 细胞的发酵 三、发酵的工艺过程

4、微生物的转化发酵

基本上包括菌种的选育、纯化培养、种子的

扩大培养、发酵和下游产品的处理等技术环节。 第二节 发酵常用微生物 1、工业生产常用的细菌 细菌有: 细菌 短杆菌、枯草芽孢杆菌、梭状杆菌、醋酸杆菌等。 用于生产味精、谷氨酸、肌苷酸,淀粉酶、蛋白酶,丙酮、丁醇, 乳酸、醋酸等等。 2、 工业上用的酵母菌 酵母菌有:酒精酵母、啤酒酵母、类酵母、假丝 酵母菌

酵母等。 分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶(lipase)以及生产可食 用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。 3、工业上常用的霉菌 霉菌有:曲霉、青霉、犁头霉等 霉菌 [藻状菌纲的根霉、毛霉犁头霉,子囊菌纲的红曲霉,半知菌类的曲 霉、青霉等。]它们可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体 激素(steriod hormone)等。

4、放线菌 放线菌 它的最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotic) 。 从微生物中发现的抗生素,有 60%以上是放线菌产生的,如链 霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。 常用的放线菌主要来自以下几个属:链霉菌属、小单孢菌属和 诺卡菌属等。 补: 5、担子菌 担子菌 所 谓 担 子 菌 ( basidiomycetes ) 就 是 人 们 通 常 所 说 的 菇 类 (mushroom)微生物。担子菌资源的利用正引起人们的重视,如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的开发。近几年来,日本、美国的一些科学家 对香菇的抗癌作用进行了深入的研究,发现香菇中 1,2 -β- 葡萄 糖苷酶及两种糖类物质具有抗癌作用。 6、藻类 藻类(alga) 藻类 藻类(alga)是自然界分布极广的一类自养微生物资源,许多 国家已把它用作人类保健食品和饲料,如培养螺旋藻。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道,大量培养藻类, 利用其光合放氢来获取氢能。

[微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种, 而大规模生产 的不超过一百多种; 微生物酶有近千种,而工业利用的不过四五十种。可见潜力是很 大的。

第三节 菌种培养技术 一、 培养基 培养基是人工配制的, 适合微生物生长繁殖活生产代 谢的营养基质。 二、培养基的种类 三、培养基的制备 浓度及配比适合 易得 固体培养基 液体培养基 2、营养物质

原则 1、选择适宜的营养物质 3、 控制 PH 条件

4、 原料来源的选择要廉价、

5、灭菌处理

四、接种和培养 (一)接种环境消毒 成。 (二) 接种 接种的方法一般有 固体斜面接种法 种 (三)培养 培养时一定要放入适宜温度,一般细菌 37 摄氏度, 液体接种法两 接种要求在无菌环境中,用无菌操作方法完

酵母菌 28 摄氏度。环境要通气良好,清洁、光线暗。 五、菌种的保藏与复壮

保藏工作就是是菌种的变异降低至最小水平,是菌种在较长期的保 藏之后任然保持着原有生命力,优良生产性能、形态特征以及不污 染杂菌和发生虫害。保藏方法有:斜面保藏法 沙土管保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液体石蜡保藏法

液氮超低温保藏法。

第四节 发酵工艺 一、发酵设备 进行微生物深层培养的设备统称发酵罐。由于微生

物有好氧与厌氧之分,所以其培养装置也相应第分为好氧发酵设备 和厌氧发酵设备。 二、发酵方式 根据发酵过程的持续性,可分为分批发酵、连续发

酵、补料分批发酵 三、发酵生产 起全过程包括培养基的制备 、空罐灭菌、加入灭菌 培养基、接种与培养、放罐和洗罐。 固体发酵 又称固态发酵,只微生物在没有或几乎没有游离水

的固态和湿培养基上的发酵过程。

第五节 发酵工程的应用技术

1、生物菌肥

2、生物农药

第八章 酶工程

第一节 酶工程的概述

指没得大批量生产和应用的技术过程。

酶工程技术的主要内容包括:酶的生产技术、酶的固定化 技术、酶的分子改造和修饰技术以及酶制剂的应用。

第二节酶的生产方法 第二节酶的生产方法 1、提取分离法包括细胞破碎、酶的抽提、酶 的分离等技术环节,其中细胞破碎的方法分 机械破碎 物理破碎

化学破碎 酶溶法。 酶的抽提方法有: 稀盐法 稀酸法 稀碱法 有 机溶剂法 。酶的分离方法有:沉淀分离法 有机溶剂沉淀法。

2、

微生物发酵法

只在人工控制条件下,利用微生物发酵培养 细菌、真菌和酵母

细胞生产酶的过程。 常用的产酶微生物有 菌。 3、 酶的发酵生产工艺 包括菌种活化

菌种扩大培养、培养基

制备、发酵、分离纯化。

酶与细胞固定化:借助各种物理或化学方法, 酶与细胞固定化: 将酶或细胞固定于水不 溶性载体上的过程,称为酶与细胞固定化。 (固定化酶又叫水 不溶性酶) 天然酶在应用中的一些缺陷(为什么需进行固定化 天然酶在应用中的一些缺陷(为什么需进行固定化):1、酶稳定性 差,易变性失活 2、酶和底物只能反应一次,难于回收利用, 不仅成本高, 而且难于连续化生产。 反应液中混入酶蛋白, 3、 使产品的分离纯化复杂化。

固定化酶特点: 固定化酶特点:1、不溶于水:反应完成后,经过滤或离心等简单分 离,就可以回收,以重复使用,降低酶制剂成本。2、具有一 定的机械强度: 可将其装成酶柱,当底物溶液缓缓流经酶柱 时,就能发生酶促反应,流出液中,即含有酶促反应产物, 其产物不易带杂质,收率高,易精制。3、稳定性提高:一根

酶柱往往可以连续使用数十次,而酶活力并无明显下降。 固定化酶:固定在载体上,并在一定空间范围内进行催化反应的酶 固定化酶: 称为固定化酶。 固定化菌体:固定于载体上的菌体或菌体碎片,称为固定化菌体, 固定化菌体 它是固定化酶的一种形式

酶和菌体固定化方法:1.吸附法 2.包埋法 3.结合法 4.交联法 5.热 酶和菌体固定化方法:1.吸附法 2.包埋法 3.结合法 4.交联法 5.热 :1. 处理法 吸附法( 吸附法(1)原理:通过载体表面和酶分子表面之间的氢键、疏水键和 电子亲和力等物理作用力,将酶固定于不溶性载体的方法, 称为物理吸附法,简称吸附法。2) 常用吸附剂:a. 无机吸 附剂:硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微孔玻璃、羟基磷灰石, 活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般很低,多在 1mg 蛋白 /g 吸附剂。b. 有机吸附剂:纤维素、胶原、火棉胶等。有 机吸附剂的吸附容量一般较高,如火棉胶膜吸附木瓜蛋白 酶、碱性磷酸酯酶等,吸附容量为 70mg 蛋白/cm2 膜。 包埋法:(1) 基本概念:将酶或含酶菌体包埋于各种多孔载体中, 包埋法: 使酶固定化的方法,称为包埋法。 (2) 包埋常用载体: 琼脂、聚丙烯酰胺、琼脂糖、角叉菜

胶等。 (3) 包埋法的类型:主要有胶格包埋、微囊型包埋、脂质体 包埋。 结合法: 结合法:(1) 基本概念:选择适宜的载体,使之通过共价键或离子 键, 与酶结合在一起的固定化方法, 称为结合法。 (2) 类型: 根据酶与载体结合的化学键不同, 结合法分为离子键结合法 和共价键结合法。载体活化的方法很多,分述如下:① 重 氮法② 叠氮法:③ 溴化氰法④ 烷基化法 交联法: 交联法:(1) 基本概念:利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间, 或酶分子与载体间进行交联反应, 以共价键制备固定化酶的 方法。 (2) 常用双功能和多功能试剂: 双功能试剂: 戊二醛、 双重氮联苯胺-2-2’-二磺酸;多功能试剂: 甲苯-2-异氰-4异硫氰;其中最常用的是戊二醛 热处理法: 热处理法:将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定 在菌体内,而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些 热稳定性较好的酶的固定化,在加热处理时,要严格控制好 加热温度和时间,以免引起酶的变性失活。 第三节 酶的固定化技术 固定化酶的性质: 4、 固定化酶的性质: 1. 稳定性 2. 最适温度 3、最适 pH 4、底物特

异性 稳定性:固相酶的稳定性比游离酶高,主要表现在以下几个方面。 稳定性: (1)热稳定性:固定化酶热稳定性较之天然酶提高。如氨基酸酰 化酶 (2) 对蛋白酶水解作用稳定性: 固相酶比天然酶有更强的抵抗蛋 白酶水解作用的能力。 (3) 对变性试剂作用的稳定性:固相酶对各种蛋白变性剂的稳

定性,一般都比天然酶强。 (4) 保藏稳定性:固相酶比天然酶保存的时间更长。 最适温度: 最适温度: (1) 固相酶的最适温度一般比天然酶高,个别会有所 降低 (2) 同种酶,采用不同的方法或不同载体固定化后,其 最适温度可能不同 pH: 最适 pH:酶经固定化后,其作用的最适 pH 常会发生偏移,影响固 定化酶最适 PH 的因素主要有两个: (1) 载体性质对最适 影响(2) pH 影响(2) 产物性质对最适 pH 影响 载体性质对最适 pH 影响: 用带负电荷载体制备的固定化酶, 最适 pH 比游离酶最适 pH 高。 用带正电荷载体制备的固定化酶, 最适 pH 比游离酶最适 pH 低。用不带电荷载体制备的固定

化酶,最适 pH 一般不改变。 影响的原因:因为固相酶颗粒在水溶液中,是被一层几乎不流动 影响的原因: 的液体包围着,这层不流动液体叫做扩散层,扩散层与其 周围外部溶液之间存在着杜南(Donnan)平衡效应,即若 是多阴离子载体就会吸引溶液中的阳离(如 H+) ,使其附 着于载体表面, 导致扩散层的 H+浓度比其周围外部溶液高, 于是扩散层 pH 值就比外部溶液 pH 值低。因此,外部溶液 的 pH 必须向碱侧偏移,才能抵消微环境作用,使固相酶达 到最大效率,因此使用带负电荷的载体制备的固相酶,其 最适 pH 比游离酶高。反之,亦然。 (见示意图) 影响:若酶催化反应产物为酸性时,固定化酶 产物性质对最适 pH 影响 最适 pH 比游离酶的最适 pH 要高。若酶催化反应产物为碱 性时,固定化酶最适 pH 比游离酶的最适 PH 要低。若酶催 化反应产物为中性时,固定化酶最适 pH 不变。 影响的原因: 影响的原因:由于微环境扩散限制影响,嵌在载体中的酶,当其 催化反应产生酸性产物时,产物的扩散活动受到微环境的 约束和限制,使产物不易扩散出去,以致在微环境中,出 现局部 pH 浓度梯度,越靠近微环境表面的地方 pH 越低。 这时, 外部环境的 pH 就要提高一点, 才能抵消微环境的这

种作用,使酶达到最适 pH。 底物特异性:固定化酶底物特异性与游离酶相比,有一定变化,一 底物特异性: 般为:作用于小分子底物的酶类经固定化后,专一性基本不 变。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶类经固定化 后专一性会发生变化。 影响原因:固定化酶底物特异性的改变,是由于载体的空 间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后,使大分子底物难于 接近酶分子而使催化速度大大降低,而分子量较小的底物受空 间位阻作用的影响较小或不受影响,故与游离酶的作用没有显 著不同。

第四节 酶的改造与修饰技术 酶化学修饰的目的: 酶化学修饰的目的:1. 研究酶的结构与功能的关系(50 年代末) 2. 人为改变天然酶的某些性质,扩大酶的应用范围(70 年 代末之后)1)提高酶的生物活性(酶活力)2)增强酶的稳 定性(热稳定性、体内半衰期)3)消除抗原性(针对特异性 反应降低生物识别能力)4)产生新的催化能力 化学修饰原理: 化学修饰原理: 凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构 发生改变(侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或

分子间的交联) ,都可称为蛋白质的化学修饰。达到:改造酶 的作用特性(包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性、 对辅助因子的要求)提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性 (防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医 疗应用). 化学修饰效果举例: 化学修饰效果举例: 用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶,使其溶血栓性提 高了 100 倍;用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶,该酶对 60℃热处理 的稳定性增高了 1000 倍。超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰 胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用 PEG 修饰后,完全消除 了酶的抗原性和免疫原性,减慢了它们在动物血液循环中被清 除的速度。

化学修饰分类: 化学修饰分类:a 金属离子置换修饰 b 大分子结合修饰 c 肽链有限 水解修饰 d 酶蛋白侧链基团修饰 金属离子置换修饰: 金属离子置换修饰: 1、概念:通过改变酶分子中所含金属离子,使酶的特性和功能发生 改变的方法。 2、作用范围:含有金属离子的酶.

金属酶特点:金属离子往往是酶活性中心的组成部分,对酶的活 性起重要作用。 ( 1 )若除去酶活性中心的金属离子,酶会失活,重新加入原 离子则酶复活。 ( 2 )加入不同的金属离子(即金属离子置换)则可使酶呈现 不同特性。 酶的必需基团(essential group):与酶活性有关的基团 酶的活性中心(active center):由必需基团构成的与酶催化活 性有关的特定区域. 3、常用金属离子: (往往是二价离子):Ca2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+, Co2+,Cu2+,Fe2+等。 4、 方法步骤: 酶的分离纯化; 除去原有的金属离子; 加入置换离子; 除去原有的金属离子; 经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合 剂,如 EDTA 等,使酶分子中的金属离子与 EDTA 等形成螯合物。 然后通过透析、超滤、分子筛层析等方法,将 EDTA-金属螯合物 从酶液中除去。加入置换离子:上述已去离子的酶液中加入一定 量的另一种金属离子,酶蛋白与新加入的金属离子结合,就可得 到经过金属离子置换的酶。 通过金属离子置换修饰可以达到下列目的:

a.阐明金属离子对酶催化作用的影响 b.提高酶活力 c.增强酶的稳定性 d.改变酶的动力学特性

大分子结合修饰 1、概念:是目前应用最广的酶分子修饰方法。利用水溶性大分子与 酶结合,使酶的空间结构发生精细的改变,从而改变酶的特性与 功能的方法。 2、通常使用的水溶性大分子修饰剂:聚乙二醇(PEG) 、右旋糖酐 (dextran) 、肝素(heparin) 、蔗糖聚合物(Ficoll)等。 3、修饰方法:修饰剂活化与酶分子结合;修饰剂活化水溶性大分子 修饰剂一般需要经过活化后才能与酶的某侧链基团进行反应。 根 据选用的修饰剂的不同,采用不同的试剂进行活化。 4、大分子修饰后酶性质的变化:a 提高酶活力 b 增加酶的稳定性 c 降低抗原抗体反应

肽链有限水解修饰 1、概念:利用肽链有限水解,使酶的空间结构发生精细的改变,从 而改变酶的特性与功能的方法。 2、修饰后酶性质的变化:(1)提高酶活力(水解后,主链的断裂有

利于酶活性中心的形成, 使酶分子显示其催化功能或是酶活力提 高) (2)降低或无抗原性(肽链的一部分水解后,仍然可以维持 酶活性中心的空间结构,催化功能不变,但其抗原性等特性发生 改变,从而提高药用酶的使用价值) 3、修饰剂:专一性较强的蛋白酶或肽酶

酶蛋白侧链基团修饰:通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子 酶蛋白侧链基团修饰 侧链上特定的功能基团发生化学反应。 侧链基团:组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。 主要有:氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 侧链基团修饰的主要作用: a.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性质和数目 b.用于酶蛋 白的纯度的分析与鉴定 c.探索酶蛋白作用的化学机理 d.用于酶 蛋白分子的固定化

化学修饰方法的几个问题:决定化学修饰成败的关键是修饰的专一 化学修饰方法的几个问题 性,尽量少破坏必需基团,得到高的酶活力回收。为此,有 时需要通过反复试验来确定。其中:对酶性质的了解:活性 部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等

选择修饰剂考虑: 选择修饰剂考虑:1)分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性 2)修饰 剂上反应基团的数目及位置 3)修饰剂上反应基团的活化方 法和条件 选择酶反应条件要注意: 选择酶反应条件要注意:1)反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温 度、时间 2)酶与修饰剂的比例

在医药方面: 酶化学修饰的应用 a 在医药方面:化学修饰可以提高医用酶的稳定 性,延长它在体内半衰期,抑制免疫球蛋白的产生,降低免 疫原性和抗原性。b 在生物技术领域:化学修饰酶能够提高 酶对热,酸,碱和有机溶剂的耐性,改变酶的底物专一性和 最适 pH 等酶学性质。

变性、诱导与构象重建(对酶高级结构调整即高级修饰)原理 变性、诱导与构象重建(对酶高级结构调整即高级修饰)原理:酶 肽链变性松散后,使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天 然条件下复性,酶将折叠成所需要的特殊结构,产生新的性 状,此即变性诱导构象重建的原理。

酶蛋白化学修饰的局限性(缺点):1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链 酶蛋白化学修饰的局限性(缺点)

的化学修饰专一性是相对的,很少有对某一氨基酸侧链绝对 专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一 些改变,因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的显示。3. 酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行,目 前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构 与功能关系中的作用。4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构 与功能的关系能提供一些信息, 如某一氨基酸残基被修饰后, 酶活力完全丧失,说明该残基是酶活性所“必需”的,为什 么是必需的,还得用 X 射线和其他方法来确定。因此化学修 饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。


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