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猪粪除臭微生物菌株的氮离子诱变选育


An ma  s a d y& V trn r  d cn   2 0   Vo. 1 No 1   i lHu b n r e ei a Me ii e 0 9 y 14  .  I

猪粪除臭微生物菌株 的氮离子诱 变选 育 
陈丽园,吴  东,夏伦 志,周 芬   
( 安徽 省 农 业 科 学研 究 院畜 牧 兽 医研 究 所 ,安

徽 合 肥 203 ) 3 0 1 

摘 要 :利用低能 N 注入技术对具有除臭作用的菌株 1  G进行诱变选育 ,以进一步提高该菌株 的除臭性能。采用 6x .xO i sc 2 N 注    0M 0 26 l”o /m 的 + n
入剂量进行诱变 ,通过筛选编号为 D 3 6 的菌株对于氨气的降解率达 7. 4 ,比出发菌的降解率提高 了 1.4 ; 6 1% 0 8 % 硫化氢的降解量达 3 .8 ,比 23 %  
出发菌提高 了7 8 % 。变异菌株经传 5代培养 ,其 除臭效果稳定。 .3  

关 键 词 :畜禽养殖废弃物 ;除臭微生物;N 注入 ;   诱变选育 

中 图 分 类 号 :¥ 1  8l

文 献标 识 码 :A  

文 章 编 号 :0 2 -10 20 ) 105 —3 5 95 3 (09 1-0 00 

畜禽养 殖场规 模化 、集 约化 的发 展造 成 了畜牧业  粪便 的集 中排放 ,产生 的恶臭 对周边 大气造 成 了严重  的污染 。 目前 ,有 多种 物理 、生化方 法用 于治理 畜禽  粪便 的恶臭 ,但都 有缺 点 ,或 成本 高 ,或 除臭专 一性  强 ,或牺牲 部 分肥 力 或 者 难 以 大 规模 应 用 ¨ ,因此  J
国内外 有 的研究学 者将粪 便 除臭转移 到微 生物处 理这 


P A培 养 基 _ :马 铃 薯 20g D 5   J 0  ,蔗 糖 2  ,水  0g
10 0mL p 自然 ,1 1℃ 下灭菌 2  i。  0  , H 2 0m n 

粪浆培养液 :新鲜猪粪 20g 水 80m ,混匀  0  , 0  L 后 ,单层 纱布过 滤 ,滤 液于 1 1℃下灭 菌 2   i。 2 0m n 
12 低能 N 离子注 入工艺 与样 品处理  .  

取新 鲜 活化 斜 面 ,用无 菌 水 洗 脱 后 制 成 孢 子悬 
液 ,适 当稀 释后 均匀涂 布于无 菌平皿 ,放置 于超净 工 

方法 。   微生物 除 臭 的关 键 在 于 高 效 的微 生 物 菌 株 的选 

育 。一般菌 株来 自于 自然环境 中 ,但 其发 酵活力 往往 
比较低 。发 酵工业 上常诱 变 自然菌株 以提 高发 酵产物 

作台,用无菌风吹干 ,利用中国科学院等离子体物理  研究 所 的低 能离 子注入 设备进 行离 子注入诱 变 ,选 用 
能量 为 1 e 0kV的 N 离 子 ,束 流强度 为 1    5mA,注 入 
齐 量 为 0 0 0 2 1 i sc   0 0 2 × 0 - 0 ,2 × .6× 0 o / m ,4 × . 6 1  i n  
o s m ,6 n /c 0 ̄0 2 . 6 ̄1  in / m ,8 0 o sc 0x0. 6x1  in / 2 0 o s  c m , 1 0x0. 6×1   in /c 0 2 0 o s m , 1 0x0 2 2   . 6×1   in / 0 o s 

收率 和品质 。但传 统诱 变方法 的多次 诱变往 往导 致负  突变 和抗性 饱和 ,而离 子注入 却能 打破此 瓶颈 ,获得  以 目标产物 为 目的的 高产 、优 良菌株 。因此离 子注入 
法在作 物和 微生 物诱变 育种方 面受 到广泛 关注 。陈丽  娟等  对 产复 合酶 益 生 菌 黑 曲霉 A O N 1进行 多次 N   注入 诱变处 理 ,使 黑 曲霉 出发 菌株 的酸性 蛋 白酶提高 

c  m 。注入 靶 室 的 真 空 度 为 1 P ,采 用 脉 冲 注 入 , 0 a   每个 脉 冲 5S   ,间隔为 5   。注 入 之后 ,分 别用 1m   0S  L 无 菌水洗脱 ,适 当稀 释 ,各取 0 1mL涂 布于 P A 固  .  D

1. 2 6倍 ,纤维素 酶 提高 56倍 ,果 胶 酶 提 高 24倍 , . .  
且产 酶性 能 稳 定 。刘 梅 等  对 产 霉 酚 酸 的短 密 青 霉 

体 培 养 基 ,每 个 稀 释 度 涂 布 3—5个 平 板 ,恒 温  2 8℃ , 倒置 培养 7  2h后进行 菌落计 数 ,计算 存活率 。  
13 猪粪 除臭微 生物 突变菌株 的筛选  .
13 1 初 筛试 验   ..

菌 M 5 进 行 N 注入 诱变 ,在剂 量为 10 26 1B. 一1   4  ̄ .x 0 i   osc  时 ,菌 株变 异率 及 正变 率 均最 高 ,分 别 达到  n/m 8. %和 6. % 。因此 本 研究 利用 N 注 入诱 变 的方  89 34  
式对 从 自然 环境 中分 离的 除臭 微生 物进行 诱变 ,以提  高其 除臭 能力 ,为得 到高效 、稳定 的除臭 微生 物探索 
可行 的途径 。  

以 6  ̄ .6 1 in/m 0 0 2 x 0 osc  的剂 量 进行 离子 注 入 ,  
稀 释培养 出单 菌落后 ,将各 菌 落进 行 编号 ,并接 到 5  

mLP A培养 液 中进 行液体 培养 ,再 以 1% 的接种 量   D 0 接 人至 粪浆 培 养液 中 ,2 8℃恒 温培养 。7d后培 养液   
首先采 用感官 法对诱 变菌株 的除 臭效果 进行判 断 ,对 

1 材 料 与 方 法 
11 菌种 与培养 基  . 出 发 菌 株 为 本 实 验 室 筛 选 并 保 存 的 除 臭 菌 株 
1  0 MG  E  
。 

于臭味 等级较 低 的培养 液 再 取适 量 培养 液 进行 稀 释 ,   稀 释液 用氨氮 试剂盒 ,测 定其 中的氨氮值 ,筛选 其氨  氮含量 低者作 为复筛 试验 菌 。  
13 2 复 筛试 验  ..

收稿 日期 :20 -20 0 90 —3;修 回 日期 :20 —90   0 90 —9 基金项 目:安徽省 自然科学基金资助项 目 ( 74 12 ;安徽省  0 0 107) 20 0 8年度科技攻关计划面上项 目 ( 8 13 26 ) 0 00 0 13 ;合肥市应用技术 研 
究 与 开发 项 目 ( 科 [0 8 2 合 20 ] 6号 -5 。 4 ) 

调节新鲜猪粪含水量至约 7 % ,称取 20g 0 0  灭菌  猪粪 装 入体积 为 2 5L的带 盖 塑料 桶 中 ,按 5 的接  .  %
种 量接 入实验 菌培养 液 ,桶 口以保鲜膜 密封 ,盖 上桶 

盖后上压重物 ,同时以接人 5 %无菌水 的相同处理作 
为 对 照 ,每 组 样 品 均 设 置 6个 重 复 。室 温 培 养 6d   

作者简介 :陈丽园 ( 9 1 ,女 ,助理研究员 ,硕士。 1 .) 8  

畜牧与兽医

20 0 9年

第4 1卷

第 1 1期 

? l? 5  

后 ,用大气 采 样 仪进 行桶 内气 体 的采 集 ,分别 以 1  0 m  %硼酸 溶 液 和 锌 铵 络 盐 吸 收 液 采 集 氨 气 和 硫 化  L2

进 行 氮离 子注入 诱变 ,经 稀释 涂平板 培养 得 到单菌落  19个 ,通 过菌 落形 态 的观察 ,对诱 变 菌 株进 行 分类  7

氢气体,并分别采用酸碱滴定法测定吸收液 中氨气 的   含量 _ ,采用 锌 铵 络 盐 比色 法 测 定 吸 收 液 中的 硫 化  6   J
氢含量  。  

编号 ,进行液体培养后分别接入粪浆液 中进行培养。  
通 过感 官法 初 步判 定 具有 除臭 效 果 的诱 变 菌 株共 3  1 株 ,采 用氨氮 试剂 盒分 别对其 发酵 液进 行氨 氮含量 的  测定 ,选 取 发 酵 液 中 氨 氮 值 较 低 的 8个 菌 株 进 行 
复筛 。  
2 2 2 菌株 复 筛  . . 

1 4 诱 变菌株 除臭 性能 稳定性 的研 究  .

为 确保筛 选 出的 目的菌株 有较好 的稳 定性 ,将 所  筛 选 出的突变株 连续 进行 5次传 代试 验 ,测定各 世代  菌株对 于猪粪 中氨气 和硫 化氢 的降解 能力 ,同时 以出 

对初 筛结果 中可 明显 降低 粪浆 液 中氨氮含 量 的诱  变菌 株 及 出发 菌 株 1  0MG进 行 猪 粪臭 味 降解 率 的评  估试 验 ,结果如 图 2 。复筛试 验 结 果基 本 上证 实 了初 

发菌株作为对照,以考察突变株的遗传稳定性。  

2 结 果 与 分 析 
2 I N  .  离子 注入对 孢子 存活 率 的影响 

筛试验 的可行性 ,即在初筛试验 中表现有降低粪浆液 
中氨氮 效果 的诱 变菌 在复 筛 的定 量试 验 中也表 现出 了 

用 1 e 0kV能量 ,不 同剂量 的 N 离 子 注入 1      0MG 的孢 子 中 ,对其各 个剂 量下 的存 活率进 行 了考察 ,结 
果见 图 1 图 1显 示 ,当 N 离 子 注 入 剂 量 低 于 4 × 。   0 

良好的除臭能力 ,所测试的 8 个菌株对氨气的降解率  均 在 4 % 以上 ,硫 化 氢 降 解率 均 大 于 2 % 。其 中编  5 4
号为 D 3的 菌株对 于氨 气 的降解 率 达 7 .4 , 比出  6 6 1% 发 菌 的 降 解 率 提 高 了 1.4 ;硫 化 氢 的 降 解 量 达  0 8%
8   7   6   5   4   3   2  

26 1”i sc  时 ,孢子 的存 活率 随着 注入 剂量 的  .  ̄ 0 o /m n 增 大 而迅速 降低 ,其后 随着 注入剂量 的增 大 ,其存 活 
率呈平 稳而 又 稍 有 上 升 趋 势 ,在 注 入 剂 量 6  2 6   0 .× x 1 "o sc  时呈 现一 个 较小 波 峰值 ;当注 人 剂量 注  0 i /m n

\ 整 逝  黯

O   0   0   O  

O   O   O   O   O  

3 . 8 ,比出发菌 提高 了 7 8 % 。而 C 1对 于硫 化  23 % .3 1 氢 的降解 量 与对 照相 比 ,其 降 解率 可 达 3 . 8 ,比  75 %

0   O   O   O   O   0   O  0  0  O   0   O   O   O   O   0  O   O 

出发 菌提 高 了 1.3 ,但 其 氨 气 降解 量 比出发 菌 降  30 % 低 了 1.5 。 因 此 本 次 试 验 仅 以 D 3 作 为 目 的  57 % 6
菌株 。  

入 大于 8 x . × 0 i sc   ,孢 子 存 活率 又迅 速  0 2 6 1”o / m 时 n 下 降 ,总 体上存 活 曲线呈现 先快 速下 降后 略微平 缓上 
升再 下 降 的 “ 鞍 型 ” 曲线 变 化 ,此 现 象 与 文 献 报  马 道  的情形 基本 相 似 。据 报 道 ,当采 用 小 剂 量 进 行 

诱 变处 理 时 ,致 死 率 约 为 5 % ~8% ,即存 活 率 约  0 0
为 2 % ~ 0 时 ,在 单 位 存 活 细 胞 中正 突 变 株 数 量  0 5% 多 J ,因此本试 验 采用注 入剂 量 为 6  ̄ . × 0 o s  0 2 6 1 in/ c   为诱变 剂量 。 m 作  
10   2% l0 o %  C5  B l   l  A l 8 Cl   D6   0 G C5   D6   2 j C 1 8 3  8 81M   5 3

菌株  

透  
壮 

8 %  O

锝  60   % 磐 
4 %  0 2 %  O
O%  0  50   10 0  1O 5 

图 2 复筛菌株的除臭效果 

2 3 诱变 菌株 的遗传 稳定 性研 究  .

通过 对筛 选 出 的 突变 株 D 3进 行 连续 5代 的传  6
代 试验 ,并 测定 各世 代菌株 对 于猪粪 中氨 气和硫 化氢 

注 入 剂 量 (×26× 1  in /m     0 o sc )

图 1 N 离 子 注 入 1  G 的 存 活 曲线      0M

气体的降解能力 ,结果如表 1 所示 , 5 内硫化氢  其 代 和 氨气 的降 解 能 力 无 明 显 差 异 ,而 与诱 变 出发 菌 1  0
MG有 显著 差异 。由此可 见本 试验通 过 N 注入 的 手段    对具 有 除臭能 力 的微 生 物进行 诱变 所得 到 的菌 株 D 3 6 

2 2 猪 粪除臭 微生 物突变 菌株 的筛选  . 2 2 1 菌株初 筛  . . 

采用 6 x . x 0 osc 。 0 26   in/ m 的剂 量对 1  1 0MG菌株 

在 5代 内除臭性 能稳 定 。  
% 

表 1 I 3除臭性能 的稳定性    ) 6

注:不 同小写字母 问差异显著 ( < .5 ,相 同字母表示差异不显著 ( > .5)  p 00 ) P O0 。

?

5 ? 2  

Anma  s a d y& Veei a y Me ii e 2 0   Vo. 1 No 1  i lHu b n r t r r   dc n   0 9 n 14   .  l

芪 蓝 抗 毒饮 及 其主 要成 分 在 鸡 胚 成 纤 维 细胞 上  最 大 安 全 浓 度 的 测 定 
徐 玉凤 ,刘家 国  ,王德云 ,赵  彪 ,范云鹏 ,胡元 亮 
( 京 农 业 大学 动 物 医 学 院 ,江 苏 南 京 南 2 09 ) 10 5  

摘要 :采用组织细胞培养的方法 , 测试了新兽药 “ 芪蓝抗毒饮”及其主要成分在鸡胚成纤维细胞 (E )体外培养中的最大安全浓度。结果显  CF
示:芪蓝抗毒饮原药 、总多糖和总萜类化合物在高浓度 ( 分别大于 1 0  gmL  0  g m   0 / 、100 / L和50 0 / )时,对 C F细胞表现出毒性 ,在  0  0 g mL E 中、低浓度 ( 分别为 2 0~78  gmL 5 3 .5 / L和 15 / )时对 C F细胞具有促增殖作用。其 中芪蓝抗毒饮原药和总多糖 的毒性  5 . 1 / 、20~ 12  g m 2 g mL E

较低 ,其安全浓度都 为 1 0  g m ;总萜类化合物毒性较高 ,其最大安全 浓度为 5 0 / L   0 /L 0 0  g m 。采用细胞破坏率评价时 ,药物的最高无毒剂量一 
般 比上述最大安全浓度低 1个稀释度 。  

关键 词 :芪蓝抗毒饮 ;鸡胚成纤维细胞 ;安全浓度 

中图分类号:S 5.  8 37

文献标识码 :B  

文章编号 :02 -10 20 ) 10 5 —3 5 95 3 (0 9 1—0 20 

芪 蓝 抗 毒饮 ( 称 芪 蓝饮 ) 是本 组 研 制 的纯 中  简 药抗病 毒药 ( 已获得 国家 发 明专 利 ) 现 ,并 由地 方 标 

的效 果 ] ,刺 激体 外 培养 的鸡 胚成 纤 维 细胞 ( E ) C F 
生 长 J ,增 强 C F抗 I D 感 染 的 能力 J E BV 。经 过 临 

准升 国家标 准成 为新兽 药 。研 究表 明 ,该 新兽药 能刺  激雏鸡 体液 免疫应 答 ,提高雏鸡 对传 染性 法 氏囊 病病 

床 推广应 用 ,芪 蓝 饮 还 对新 城疫 病 毒 ( D N V) 等 其  他病 毒性 疾病有 一定 的防治作 用 。但是 ,芪蓝饮制 剂 
为 初提物 剂型 ,贮藏后 易形 成沉淀 ,需要 在剂 型方 面 

毒 (B V ID )强毒攻击 的抵抗力 ,显著降低雏鸡死亡  率 ¨ ,提 高传染 性 法 氏囊病 (B   ID) 弱毒 疫 苗免 疫 
收稿 日期 :20 —4 0 ;修 回 日期 :20 —9 1  0 90 -l 0 90 -0
基金 项 目 :江 苏 省 自然 科 学 基 金 ( K 0 76 )  B 2 0 15 。

进一步优化;其处方也需进一步改进,以提高其对新  城 疫 ( D) 等疾病 的 临床 防治 效 果 。因 此 ,本 试 验  N 初 步 提 取 了 芪 蓝 饮 的 主 要 成 分 ,并 采 用 四 唑 盐 
( r )法 测定其 细 胞最 大安 全 浓 度 ,以期 为 进一 步  M r
研 究奠定 基础 。  

作者简介 :徐玉凤 ( 93 ,女 ,硕士研究生 。 18 一)  
通讯 作 者 。  

3 讨 论 
离 子注 入 法 诱 变 育 种 研 究 起 步 晚 ( 于 18   始 96

参考文献 :  
贾华 清.畜禽粪便的除臭技 术研 究进展 [ ] J .安徽农 学通报 ,  
2 0 ,1 ( ) 9 5 . 0 7 3 5 :4 - 1  

年) ,作 用机理 、离 子种 类 和诱 变 规律 需 要进 一 步论  证 。但无 可置 否 ,离 子注 入微生 物育种 具有更 多 的优  点和发 展潜 力 。N 注 入过 程 中与 生 物 体 产 生 复 杂 的    物理 、化学 和 生 物 学 效 应 。 注入 的 离 子 通 过 动 量 传  递 、质 量沉积 、动 能沉积 和 电荷 交换效 应联 合作用 而  对遗传 物质产 生直 接或 间接 的损伤 ,同时 生物体 内各  种修复 机制被 激 活 ,对操 作进行 修 复 ,在修 复过程 中  可能 出错或 者损 伤超过 了生 物体 的修复能 力 ,就会 引  

[ ] 陈丽娟 ,张云华 ,王宝玉 ,等.高产复合酶益生菌的氮离子注  2 
放诱变选育 [ ] J .中国农学通报 ,20 ,2 (2 :2 -4 0 6 2 1 ) 12 .  

[] 刘 3 

梅,张

鹏 ,崔晓兰 , 等.离子注入选育霉酚酸高产菌株 

及 其 发 酵 条 件 研 究 [ . 微 生 物 学 报 , 20 , 4 ( : J] 0 6 6 5) 
8 6. l   1 8 9.

陈丽园 ,吴

东 ,夏伦志 ,等.畜禽粪便除臭微生物的分离与 

筛选 [] J .畜牧与兽医 ,2 0 ,4 (2 0 8 0 1 ):5 —1 96 .  

起突变和致死 ,突变就可能被稳定遗传下来 。   本 试验 首次 通过 N 注 入 的手 段 对 具 有 除臭 能 力    的微生物进行诱变,通过筛选得到菌株 D 3 6 ,该菌株  对 于氨气 的降解 率达 7.4 ,比出发 菌 的降 解率 提  6 1%
高 了 1.4 ;硫 化 氢 的 降 解 量 达 3 .8 , 比 1  0 8% 23% 0 MG提高 了 7 8% ,具 在 5代 内除臭 性 能稳 定 。本试  .3 验结果 表 明 ,利 用低能 离子束 注入 技术来 诱变选 育高  效除 臭 诱 变 菌 株 来 说 确 实 是 一 种 比较 理 想 的试 验 
手段 。  

周德庆.微生物学实验手册 [ .上海 :上海科学技 术出版  M]
社 ,19 :16  99 7 .

赵晨羲 ,兰时乐 ,禹逸君 ,等.鸡粪除臭微生物菌群 的筛选和 
应用 [] J .湖 南 农 业 科 学 ,20 05,( ) 87 . 1 :6 -0 

陈书安 ,黄为一 , 赵
宫春波 ,刘

兵.除臭微生物分离和筛选方法 的改进 

与应用 [] J .生物技术通报,20 06,( ) 2 -2 . 5 :1619   鹭 ,谢丽源 ,等.离子注入微生物诱变育种研究 

进 展 [ ] 生物 技 术 ,2 0 ,1 ( ) 74 . J. 0 3 3 2 :4 —9 

章名 春.工 业微 生 物诱 变 育种 [ .北 京 :科 学 出版社 , M]  
1 8 9 4. 】 6 】 9. O .0  


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