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烟草转GroEL基因抗双生病毒的研究


巍苏农翌学报(,如n萨#亲移蠢势&i≥,2009,25轻>:2鳓一2酪

烟草转铆观基因抗双生病毒的研究


丹啦,

张保龙1,

倪万潮1,

王荣富2,

张云华2

(1.江苏销农业科学院农业生物技术研究所,’疆苏南京21

0014;2.安徽农业大学生命科学院,安徽合肥230061)

摘要:

双生病毒是全球性的重要植物病毒,为提高植物对此病毒的抗憔,分离了烟粉虱体内‰脱基因,将

其连接到棉花韧皮部特异启动子PGHNBs下游,构建到植物表达载体PBll2l上,采用农杆菌分导法转化烟草,获

得撬性营。对抗健檀橡遴符愆蠢、嚣T.茂拄程病毒骚染裣嚣,结果裘鞠:Q移戤基因已经整合蓟娲莘鏊毽缓孛,并菇

在转录水平上表达。病毒侵染检测结果艘示转基因烟草植株中没有检测到病毒,证明韧皮部特异表达‰髓基因
抗双生病毒是可行的。

关键词:鬃粉羲;双生病毒;僦基医;耀摹;转纯
中圈分类鼍:Q78 文献标识码: 文章编号: 10004440(2009)02m260JD5 on

S加dy

G阳差汪Gene
ZHANG Bao.10l塔‘,

a髀i璐t Ge撒i秘iv耋r潞in
Nl’%n.cha01,

Tobacco

Transfo朋翰tion

WU D锰n1”,

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PBIl2l躺d

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under pllloem spec临c pmmoter

by

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l∞ve8 method via

AgrD6nc掰^啪mediation.JI№ t瑚scripli蛳level.Viru8

RT—pCR呻ved&stable integration of the鼠飘gene洫tobacco
h蹈基go碡碟&l as&in8l萨mi迸Vinl氛

genome

and expre鹋ion in

i11fbction experirnent

dem伽献rated geIIIiIliviru¥w鸽not detected in tran89enic plants.Tk墙e re8ults pmved tIlat pllloem sp黔

幽c expressi哑《如毖gene

Key钠柏s:&衲施£赫祗;ge赫niv溉s;G粕睨萨ne;孙妇cco;h弛sf0黼alion
粉虱传双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植 物单链矜NA病毒,分类主属于双生病毒科(Ge耐ni-

势,并且在全球范匿内传播开来,融弓l起热带、耍热
带地区多种作物主的严重病害,给作物生产造成了 重大损失。目前,至少已有39个国家的棉花、木薯、 番茄等作物正在遭受此类病毒的毁灭性危害。 内共生菌一般都存在于昆虫体内,产生细胞质 不棚容现象,影响昆虫的正常生活和繁殖能力。它 产生的G羚E毛蛋自能使进入昆虫体腔的病毒免遭

viridae)中的菜豆金色花叶瘸毒属(№妒,删i圳)。
该属病毒仅侵染双予叶植物,在自然条件下全部漱

烟粉虱(&m蠡泌玩6祗)传播,因而也称作粉虱传双
生病毒…。近年来,双生病毒的危害性有加重趋
狡稿日期:2008.11旬6 基金项目:江苏自然科学基金项目(BK200r7125) 作者简介:煲丹(1982-),女,安徽安痰人,硕士研究:墼,从事农业嫩 耪技零骈究。 通讯作者:张保龙,(E—mail)zhbl2248@hotlllail.com;王荣富.(E—

降解,维持其程昆虫体内的稳定性。烟粉虱内共生

菌‰雎基因编码一种63 000的GroEL蛋白,这种
蛋囱与烟粉虱传播植物癍毒关系密切。对蚜虫的研 究结果表明,GroEL是蚜虫体内最丰富的分子伴侣

mail)Ffk粕P膨柚耻.edu.cn

蛋自睁J,吴云锋等从蚜虫体内分离到了63 000的病

万方数据

吴丹等:烟草转Gr0脱基因抗双生病毒的研究

毒结合蛋白B“曲咖GroELpJ,用蚜虫日wkm

GroEL

表l烟草转化所用培养基
ThbIe


抗血清在携毒之前饲喂烟粉虱,烟粉虱传TYLCV.Is 番茄黄花曲叶病的几率下降了80%以上H】。Morin 等"o用酵母双杂交试验对TYLCV2Is与AbMV2Is衣 壳蛋白(cP)与烟粉虱Gr0EL的互作研究证明,这2 种病毒的cP都能够与GmEL有效联结,但TYL广 CV:Is能被烟粉虱传播,而AbMV:Is则不能被烟粉 虱传播。说明内共生菌产生的GroEL蛋白对病毒 起着保护作用,使病毒在进入昆虫体内的过程中免 遭降解,同时GroEL也在一定程度上影响昆虫传播 病毒的种类。由于内共菌不能人工培养,获得大量 的内共生菌代谢产物也就比较困难,在体外进行蛋 白表达是一条研究基因产物特性与功能的好途径, 蚜虫Blf砌em GroEL的原核表达已有报道p,6“J,烟 粉虱内共生菌GroEL也在酵母菌中进行了表达∞o。 为了进一步研究烟粉虱GmEL蛋白在植物抗双生

h正e曲Ilsed in由Dha咖n翟地fb哪ati蛐procedure
成 分

培养基
Ms

MS大量元素+Ms微蘑元素+Ms铁盐+Ms钙 盐+MS有机物+蔗糖30 n∥L,pH5.8
MS+IAA 0.2脚哆/L+6?BA O.2

分化培养基

Ing/L+琼脂

0.8%,pH5.8

筛选培养基 生根培养基

Ms+卡那霉素100 In∥L+头孢霉素500 m晷/L+ 琼脂O.8%,pH5.8
l/2 1/2

Ms大量元素+MS微鼍元素+Ms铁盐+ Ms钙盐+MS有机物+蔗糖30 rng/L+琼脂

O.8%,pH5.8

1.2方法
1.2.1

引物

根据文献[10]设计特异引物Gro-

Eu'、GroELR,为了便于PcR产物的克隆,上、下游

引物分别添加1个&m日I和5nc I酶切位点,引物
序列见表2。用无菌去离子水溶解引物至终浓度为 10斗moL/L,保存于一20℃备用。
表2用于PCR扩增的引物序列
Tat’Ie 2 Suquenoe of
priIner

病毒中作用,本试验将Gr0观基因与棉花韧皮部特
异启动子构建载体PBll21一PGHNBS—J,通过农杆菌 介导法转化烟草,获得抗性植株并研究其抗双生病 毒的可行性。

used for PCR

引物
Gr0ELF

序列(5’q’)
CAAGGATCCATGGCAGCTAAAGACTI'A. AAAlT兀1GG

1材料与方法
C∞EUt

CrAGACCT℃1rrACATCATACC^1’rcArrI℃CGCC ATcGCCGCAAAGAG^TGCTACAG ATCATACC^TTCAl’f℃CGCCCAT CGCCCGI℃TCGAAGG7兀℃ GCCATA-rACAATAACAAGGC GCCGACrACAACAl℃CAGAAGG TGCAACACAGCGAGCTrAACC

1.1材料
1.1.1

GmEU瑁57 GmELFll673

昆虫材料2007年10月上旬,直接在江苏

省农业科学院试验地的棉花植株上采集烟粉虱(B. 缸6∞i)种群。
1.1.2

TylcwlF TylcwlR

植物材料

植物转化材料烟草(Ⅳ抛施肥

Tob叭b3F T曲aub3R

船6口c啪)l(326由江苏省农科院农业生物技术研究
所实验室保存。 1.1.3茵株和质粒的获得菌株JMl09、LBA4404、 AGLl、韧皮部特异表达载体PBIl2l—PGHNBs(缩写为 P—42.1)由江苏省农业科学院生物技术研究所实验室 保存。番茄黄化曲叶病毒(,ItYLCV)侵染性克隆菌液 由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。 1.1.4工具酶和主要试剂TA克隆载体pMD20—T

1.2.2

GrD砚基因的克隆与表达载体的构建



CTAB法提取烟粉虱DNA,以DNA为模板进行PCR 扩增。PcR扩增程序:94℃预变性4 lIlin;94℃变 性30 s,55℃退火50 s,72℃延伸2.5 min,共37个 循环;72℃延伸10 min。PCR扩增产物胶回收后 克隆到T载体上,DNA测序由上海生工生物工程有 限公司完成,使用GenBank中的Blast对序列同源性 进行搜索。将分离到的GroEL基因置于棉花韧皮部

载体、限制性内切酶眈m日I及鼢I购自Tak啪公
司,死DNA连接酶购于Promega公司,Marker、Trizol 等购白天根公司,其他试剂为国产分析纯试剂,质粒 提取试剂盒和DNA片段快速纯化和回收试剂盒购 于Axygen公司,PCR引物由上海生工生物工程有限 公司合成。 1.1.5培养基烟草转化试验所用培养基见表l。

特异启动子的下游构建韧皮部特异表达GrD髓基因
的植物表达载体P42-l—GroEL。 1.2.3烟草转化对烟草的转化,采用叶盘共培养 法【l¨。将消毒好的外植体烟草叶片剪成1 cm2大 小,置于含有重组质粒的农杆菌AGLl/P42-l—Gl伊

万方数据

江苏农盈学羧2鼢年篱25卷第2麴
EL(0D枷=0.3~O.4)侵染液中浸泡3 min,放滤纸 上吸于藤,于Ms鳍养基上睦培养2 d,以来浸泡为 对照。将上述共培养叶片转移至含有激素lAA(O.2 mg/L)和6-BA(O.2 mg/L)的分化培养基上,每日光 照16 ll,25℃培养。当愈伤缌织长出灏生芽时,切

2结果

2.1锄E互基因的克隆
在江苏省农业科学院试验地的棉花叶片上捕捉 燧粉虱50头,采』曛cTA转法提取烟粉虱D嚣A。并以

下小芽转入含有硫酸卡那霉索(100 m∥L)及头孢
霉素(200 mg/L)的筛选培养基,每隔lO d左右换1 次培莽基,筛选凄生搬墓,再将筛选到的挠性绿萤转 入生根堵养基中生长。当生根苗长至2—3周时, 移栽于土壤中。

DNA为模板,通过PCR扩增获得目的基因‰脱,
目的片段Gro脱经胶同收纯化后连接到pMI)20—T 载体上,序列溅定表鞠其长度为l酌s bp,该序残编

码555个氨基酸,与GenBank中之前登录的‰脱
基因核酸序列有4个碱基的差异,同源性均达

1.2.4抗槛植株的分子裣溅

隧撬选取成活j#转

99%,有2个编码氨基酸靛不同。已登录褒氏n-
Bank(FJ009522)中。
2.2

基因(CK)和抗性烟草株,用CTAB法提取叶片基因 组总DNA,重新设计引物GroELFl857和GfoELR673

重组表达载体P-42一l-GroEL的构建

《表2)进行琵嚣扩增,l。2%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物。再从筛选到的转入基因的烟草中提取 RNA,用RT—PcR检测此基因在转录水平上的表达。 l。2。5抗病毒褴检测将瘸毒侵染性克隆酶菌滚 采用农杆菌注射法【l 2l,对对照和RT.PCR检测到的 转基因植株进行免疫接种,定期观察症状。3周后, 提取病毒侵染静对照翻转基因烟草矜N矗,以DNA 为模板用设计好的病毒(番茄黄化曲叶病毒)引物 Tylcvv,F、Tylew,R(表2)进行PCR扩增;1个月羼 观察感病症状。

将榛藐静波部特异接鏖动子能一l插入到黯|12l 表达载体硪以III和眈mH I酶切位点之间,使其替
代35s启动子,构建成棉花韧皮部特昴性表达载体P? 鸵。l。在质粒p—纪.1中,翻用器劝缀l和&e


2个限

制性内切酶切下G嬲报告基因,换上用同样2个限

制性内切酶从pMD20.T载体上切下的铂脱基因 (在设计扩增锄磁基因的弓|物时,弓|物两端加上

眈删I和鼢I酶切位点),用死DNA连接酶连接,
使G幻观基因位于棉花韧皮部特异扇动子的下游,构
建成植物表达载俸P.一轮一l—G∞EL(圈1)。

PBll2I

删Ⅲ

舶棚I

鼬l

N2_lGmEL



||

叠l

N2-l《∞戡。植物表达羧体结构模式灏

魏.1

S扫咖魏稀the P或-l妇oEL饿瞬
檀株。根据戴结果,栗餍强嗣法提取对照穰已转

2。3抗{!耋檀株的分子检测 cTA8法提取对照、卡那霉素抗性烟草株叶片 总DNA,进行PcR检测。结果(图2)显示,与对照

入‰既基因的烟草RNA,反转录为cDNA后,以
cDNA为模板进行RT.PCR检测,结果(图3)显示,

褶院,∞株卡郡霉索抗性烟辈中有15株扩增僦
基因的目的条带,说明锄觇基因已经整合到这15
株转基因烟草中,初步获得了转Gro砚基因的烟荤

在8檬已转入锄戥基因酶抗性烟孳檀株上检测瑙
cro脱基因(圈3),表明这8株烟草在转录水平上
表达。

万方数据

吴丹等:烟草转Gro脱基冈抗双生病毒的研究

1:非转基冈植株;2—2l:转基因植株。 圈2转基因烟草的PCR检测结果

盹.2

m阳姒№0ftllm靴tob蝴byPCR

l、2、3:非转基因植株;4—13:转基因植株。 图3转基因烟草I汀?PCR检测结果

隐.3
2.4病毒检测

m嘲怕oftra啦薛njctDb蝴by盯-PcR
现对照感病发病表征明显,但转基因烟草无明显带

将上述8株在转录水平上表达的烟草幼苗以及 3株对照幼苗送江苏省农业科学院植物保护研究所 用病毒侵染性克隆的农杆菌菌液注射侵染。对注射 侵染植株的基因组总DNA用病毒特异引物进行 PCR扩增,2次重复验证结果:3株对照植株和2株 转基因植株有病毒特异扩增条带,另外6株转基因 烟草没有任何PCR扩增产物(图4B)。说明转基因 烟草中有2株烟草感染病毒,其他6株未感染病毒。

毒表征(图5)。证明棉花韧皮部特异表达Gro髓基
因抗双生病毒是可行的。

在检测病毒的过程中,设计烟草内参引物协
b锄b3F、Tobaub3R(表2)来调整被检测样品的模板
A:内参引物的PCR结果;B:病毒侵染的PcR结果;l一3为非转

浓度(图4A),使其尽可能达到一致。另外,利用内 参引物进行PCR扩增还能保证样品DNA的质量, 不会因为样品DNA浓度的问题而导致无特异性扩 增产物。注射侵染后1个月观察植株带毒情况,发

基因植株;4一ll为转基因植株。 图4病毒侵染后的烟草PCR检测结果 F肇.4

M蚰蛐q幽Ⅱ0f纠l咖a№r n砷vir啦i曲目c廿on by PCR

图5转基因烟草的抗病毒性

№?5

R吲i曲m∞of

tr舢嘲reI吐c幻ba。oo艇阚群m锄vl嘣

万方数据

江苏农业学报

2009年第25卷第2期

3讨论
昆虫体内与传毒有关的GroEL蛋白是由内共
生菌产生的,对昆虫传播病毒起着非常重要的作用。

致谢:衷心感谢江苏省农业科学院植物保护研究所 周益军研究员和季英华老师提供的番茄黄花曲叶病

毒菌液以及在接种病毒方法上的支持和帮助!
参考文献:
[1]

GrD觇基因对抑制烟粉虱传播病毒作用显著¨.1

31,

通过物理或化学方法消除或抑制内共生菌、分子生 物学方法改造内共生菌等手段,都有可能防治病虫

谭周进.谢丙炎。肖启明,等.烟粉虱内共生菌觚基因的
PcR扩增与测序[J].核农学报,2005,19(1):68-71. 吴云锋,林林,崔晓峰.麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基冈的

害。鉴于此点,本研究利用转基因植物表达Gr0眈
基因,希望达到持久的防治效果。 由于烟粉虱是通过植物的韧皮部传播双生病毒 的,本试验使用韧皮部特异启动子PGHNBS,使Gro. EL蛋白在韧皮部特异表达,病毒粒子被包裹在Gro- EL蛋白中,抑制病毒的复制和移动,结果表明转基 因植物对病毒的侵染表现出一定程度的抗性,这与 Akad等¨叫的报道是一致的。另一方面,42.1是一 种病原菌响应的韧皮部特异启动子,在DC3000(丁 香假单胞菌番茄变种)、枯萎病等植物病原菌侵染 或用水杨酸、茉莉酸甲脂和乙烯处理时,能使目的基 因表达量增加3~5倍一J,而Akad等¨叫采用的是非 病原菌响应的拟南芥韧皮部特异启动子SuC:,因 此,虽然42一l启动子使GmEL本底表达量较低,但 仍表现出很好的抗病毒效果。 在农杆菌转化的过程中,为了得到适合本试验 的高效转化菌种,用2种不同的农杆菌(LBA4404、 AGLl)进行转化,研究发现使用相同的液体培养基

[2]

克隆和原核表达[J].病毒学报,2002,18(3):275-278. [3]吴云锋,周广和,树斌.蚜传病毒专化性与病毒附着蛋白的
关系[J].西北农业学报,1999,8(4):5-7. [4]
MORIN
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h咖olog:Ile
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in

bac铆妇0f

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tomato

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tlle circulaive

mm删鹪ion

yeUow leaf cur量vim8

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MoRIN s,GHANIM M,s0BOL
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nont糟n锄issble

begomo“mus

in

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[8]

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(1):69.72.
zHANG B L.YANG Y w,N1 w c,et

81.cl叩ing and chalacteriza.

LB扩繁时,AGLl的活力明显高于LBA4404,并且得
到抗性苗的几率较高。另外,在实际操作过程中,由 于AGLl的活力较高,会导致共培养时难以控制菌 的生长,使培养基污染严重。通过多次改变试验条 件,初步表明缩短共培养时间可有效减少污染。 病毒检测的结果说明,在转录水平上表达的转 基因烟草在病毒侵染后并非全部抗病,这可能与

ti佣of粕org觚specific彻d pathogen陀sp0鹏ive pr蛳oter f面n

cotton(咖f肼l^如础姗L.)[J].cott帅science,2006,18
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Groel gend如m tIle

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curl

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pI觚ts conf毫rs r∞is劬ce

yeUow

leaf

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L.^si埘ple锄d gene忸l

[1I]HORscH

J E,HOFFMAN N

Gro脱基因在烟草中表达蛋白量的多少有关,因此
还需要进一步进行蛋白分析。 此外,该基因是否在转基因植物中表现出一定 的稳定性,还有待于对这些转基因材料进行T。代乃 至T2代的抗病鉴定和遗传分析。综上所述,利用韧 皮部特异表达GroEL蛋白,为烟草、番茄、南瓜等植 物抗双生病毒提供了新的育种途径。

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测[J].西南农业学报,2007,20(3):417.420.

万方数据

烟草转GroEL基因抗双生病毒的研究
作者: 作者单位: 吴丹, 张保龙, 倪万潮, 王荣富, 张云华, WU Dan, ZHANG Bao-long, NI Wan-chao , WANG Rong-fu, ZHANG Yun-hua 吴丹,WU Dan(江苏省农业科学院农业生物技术研究所,江苏南京210014;安徽农业大学生命科 学院,安徽合肥230061), 张保龙,倪万潮,ZHANG Bao-long,NI Wan-chao(江苏省农业科学院 农业生物技术研究所,江苏南京,210014), 王荣富,张云华,WANG Rong-fu,ZHANG Yunhua(安徽农业大学生命科学院,安徽合肥,230061) 江苏农业学报 JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES 2009,25(2) 1次

刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 被引用次数:

参考文献(13条) 1.谭周进.谢丙炎.肖启明 烟粉虱内共生菌GroEL基因的PCR扩增与测序[期刊论文]-核农学报 2005(01) 2.吴云锋.林林.崔晓峰 麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达[期刊论文]-病毒学报 2002(03) 3.吴云锋.周广和.树斌 蚜传病毒专化性与病毒附着蛋白的关系[期刊论文]-西北农业学报 1999(04) 4.MORIN S.GHANIM M.ZEIDAN M A GroEL homologue from endosymbiotic bacteria of the whitefly Bemisia tabaci is implicated in the circulaive transmission of tomato yellow leaf curl virus 1999(01) 5.MORIN S.GHANIM M.SOBOL I The Groel Protein of the whitefly Bemisia tabaci interacts with the coat protein of transmissible and nontransmissble begomovirous in the yeast two-hybird system 2000 6.吴云锋.崔晓峰.林林 禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达[期刊论文]-微生物学报 2002(04) 7.林林.吴云锋.崔晓峰 玉米蚜体内参与传毒的内共生菌groel基因的克隆和原核表达[期刊论文]-中国病毒学 2003(01) 8.崔晓峰.吴云锋.林林 桃蚜体内与病毒结合的共生菌Buchnera groel基因的克隆序列分析[期刊论文]-中国病毒学 2001(01) 9.ZHANG B L.YANG Y W.NI W C Cloning and characterization of an organ specific and pathogen responsive promoter from cotton,(Gossypium hirsutum L)[期刊论文]-Cotton Science 2006(06) 10.AKAD F.EYBISHTZ A.EDEIBAUM D Making a friend from a foe:expressing a Groel genefrom the whitefly Bemisia tabaci in the phloem of tomato plants confers resistance to tomato yellow leaf curl virus 2007 11.HORSCH R B.FRY J E.HOFFMAN N L A simple and general method for transferring genes into plants 1985(4691) 12.ZHOU X P.XIE Y.TAO X R Characterization of DNA β associated with begomoviruses in China and evidence for co-evolution with their cognate viral DNA-A 2003 13.董家红.李光西.罗延青 香料烟粉虱传双生病毒的分子检测[期刊论文]-西南农业学报 2007(03)

相似文献(10条) 1.期刊论文 纠敏.周雪平.刘树生.JIU Min.ZHOU Xue-Ping.LIU Shu-Sheng 烟粉虱传播双生病毒研究进展 -昆虫学 报2006,49(3)
综述了烟粉虱Bemisia tabaci对双生病毒的获取、传播及存留等方面的特性.烟粉虱最短的获毒和接种时间为15~30 min;双生病毒在烟粉虱体内可 存留1至数周,有的终身存在.烟粉虱对双生病毒的传毒效率除了随其获毒及传毒时间的延长、传毒烟粉虱个体数量的增加以及病毒体浓度的增加而提高外 ,还与烟粉虱的龄期及性别有关.双生病毒除了在植物与粉虱之间直接传播外,还可通过烟粉虱交配及经卵携带的途径在烟粉虱个体和代别间进行传播.寄 主植物、双生病毒的一些特殊蛋白以及烟粉虱内共生菌产生的GroEL蛋白,都可影响烟粉虱携带的双生病毒种类及传毒的可能性.双生病毒可对烟粉虱的发 育、存活和生殖产生不利或有利的影响.雌成虫携带番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)后,存活力和生殖力均下降;而携带番茄 斑驳病毒(tomatomottle virus,ToMoV)后,生殖力提高.此外,植物感染双生病毒后,其对烟粉虱的适合性可能提高.

2.学位论文 童琳 烟粉虱—寄主植物—植物双生病毒互作的生理机制初探 2007
烟草对于入侵我国的B型烟粉虱和我国本地的ZHJ1烟粉虱均是一种适合度较低的寄主植物,但B型烟粉虱在中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)和烟草曲 茎病毒(TbCSV)两种双生病毒侵染的烟草上取食,产卵量显著增加,寿命显著延长,而ZHJ1烟粉虱在感病烟草上取食,并未对其生殖和存活产生有利影响 。为了探讨这两个生物型烟粉虱之间在与其所传病毒及寄主植物相互关系方面出现这些差异的生理机制,本文测定了取食健康烟草、TYLCCNV和TbCSV侵 染的烟草的B型、ZHJ1烟粉虱体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)三种保护酶活性;测定了健康烟草和双生病毒侵染后的烟 草韧皮部汁液中各游离氨基酸的含量和组成,以及取食不同处理烟草后B型和ZHJ1烟粉虱分泌的蜜露中的氨基酸含量和组成。结果如下: (1)保护酶活性测定结果表明,B型烟粉虱从棉花转移到健康或被病毒感染的烟草上后,体内SOD活性均显著上升,而且取食TYLCCNV、TbCSV感病烟草 的烟粉虱酶活在1d时比取食健康烟草的显著高。而ZHJ1烟粉虱从棉花转移到健康或被病毒感染的烟草上后,体内SOD活性均显著下降,取食TYLCCNV、 TbCSV感病烟草的烟粉虱酶活显著高于取食健康烟草的,但仍显著低于取食棉花的酶活。B型烟粉虱转移到烟草上取食诱导了其体内CAt活性,且双生病毒 对植株感染进一步增强了这种诱导作用;POD也在双生病毒的影响下受到激活,而健康植株上没有这种情况出现。在ZHJ1烟粉虱中,虽然CAT活性的变化 与B型的类似,双生病毒对其呈现有利作用,且双生病毒对POD的激活作用在转移1d后就明显地表现出来,但是可能由于SOD的低活性水平,使这两种酶活 性变化的有利作用未能表现出来。SOD、CAT和POD活性的差异可能是B型烟粉虱在感病植株上取食后寿命增长、生殖力增加,而ZHJl烟粉虱没有这种情况 出现的一个原因。 (2)TYLCCNV侵染的植株韧皮部汁液中氨基酸总量显著高于健康烟草,TbCSV侵染的植株中氨基酸总量显著低于健康烟草,并且各种游离氨基酸的变化 也不一致,不过,这两种双生病毒对植物中氨基酸的组成比例的影响大多一致,因此,氨基酸的组成比例对烟粉虱的影响可能比氨基酸含量的大。VaI、 Met和Lys三种必需氨基酸在两种感病植株中的含量显著上升,它们可能是有利于烟粉虱生长发育的游离氨基酸。 (3)TYLCCNV感病植株中氨基酸总量高于健康烟草,取食后的B型烟粉虱所分泌的蜜露中氨基酸总量较取食健康烟草的低,ZHJ1烟粉虱蜜露中氨基酸总 量没有显著改变: TbCSV感病植株中氨基酸总量低于健康烟草,取食后的B型与ZHJ1烟粉虱蜜露中氨基酸总量均较健康烟草上的低,且ZHJ1烟粉虱蜜露的氨基酸总量降 低幅度显著小于B型烟粉虱。这可能是由于双生病毒的存在使B型烟粉虱能够更好地吸收利用食物中的氨基酸,但对ZHJl烟粉虱作用不明显。在双生病毒 侵染的植株上取食的B型烟粉虱能更好地利用食物中的氨基酸,而ZHJ1烟粉虱没有这种机制存在,它所吸收的营养更多地以蜜露的形式排出体外而没有得 到很好的利用。本研究的创新之处: (1)首次以比较研究入侵的B型烟粉虱和土著ZHJ1烟粉虱在“媒介昆虫一病毒一寄主植物”互作中生理反应的异同为切入点,探讨B型烟粉虱与所传病 毒间出现互惠共生的生理机制。 (2)比较了B型烟粉虱和ZHJl烟粉虱取食TYLCCNV或TbCSV病毒侵染的植株后体内保护酶活性的动态变化,发现各处理中B型烟粉虱体内SOD活性均比 ZHJ1的显著高,这可能是B型烟粉虱寄主适应能力高于本地ZHJ1烟粉虱的一个重要因素。 (3)测定了TYLCCNV和TbCSV两种双生病毒对植物体内氨基酸的组成及含量影响,比较了B型烟粉虱和ZHJ1烟粉虱取食健康植株与感病植株后所分泌的 蜜露中氨基酸含量和比例,结果初步表明,B型烟粉虱在被病毒感染的植株上取食,对氨基酸的利用能力比在健康植株上取食的高,而ZHJ1烟粉虱没有这 种情况存在,这有助于解释B型烟粉虱入侵并取代本地ZHJ1烟粉虱的机制。

3.期刊论文 董迪.何自福.柴兆祥.Dung Di.He Zifu.Chai Zhaoxiang 广东黄秋葵黄脉曲叶病样中检测到烟粉虱传 双生病毒 -植物保护2010,36(1)
黄秋葵是近几年来从日本和我国台湾引进的一种蔬菜作物.近期,广东的黄秋葵上发生了黄脉曲叶病.病株的典型症状表现为叶脉黄化,在叶片正面形 成网络状,在叶背面叶脉肿大突起明显,病株幼叶小且向下卷曲,甚至整片幼叶黄化.植株早期被感染表现矮化.在发生黄脉曲叶病的黄秋葵田阃,其病株率 高达60%以上.用烟粉虱传双生病毒简并引物对随机采集的病样进行PCR检测,从这些病样中均能扩增出1条预期大小为570 bp的特异片段;基因克隆及测序 分析结果表明,与该特异片段同源的均属双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒DNA,其中与木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Muhan virus,CLCuMV)分离物G6相似性最高,为99%.这些研究结果表明,广东黄秋葵黄脉曲叶病中存在烟粉虱传双生病毒,该病害可能也是由CLCuMV侵染引起的.

4.期刊论文 何自福.虞皓.罗方芳 番茄烟粉虱传双生病毒PCR检测 -中国病毒学2004,19(1)
烟粉虱传双生病毒(Whitefly-transmitted Gemini- viruses,WTGV)病是世界番茄生产上重要病害之一,已给美国、以色列、埃及、澳大利亚等国的 番茄生产造成了严重损失,病原是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA植物病毒,属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus),其 基因组由2个组分(DNA-A和DNA-B)组成,每个组分的大小为2.5~2.8kb,少数病毒为单组分;由烟粉虱(Bemisia tabaci)以持久方式传播[1].

5.学位论文 赵华 两种双生病毒经烟粉虱个体间水平传播和代别间垂直传播的研究 2010
近10年来,B型烟粉虱Bemisia tabaci入侵到全球许多国家和地区,已成为世界性的重要害虫。最近几年,另一种入侵型烟粉虱—Q型烟粉虱也正从 起源地迅速扩散世界其他一些地方,并在很多地区与B型烟粉虱混合发生,严重危害作物生产。烟粉虱可以传播多种植物双生病毒,B型烟粉虱和Q型烟粉 虱在许多地区的大暴发,往往伴随着双生病毒病的蔓延成灾。通常认为,烟粉虱是以持久、循环、非繁殖的方式传播双生病毒。然而,双生病毒经交配 和卵在烟粉虱个体间和代别间传播也有报道,但研究结果之间存在差异。明确烟粉虱能否经交配传毒及经卵传毒,对于了解双生病毒的传播和发病规律 、控制我国双生病毒病的流行具有重要意义。本研究以B型烟粉虱和Q型烟粉虱以及近年来对我国烟草和番茄造成严重危害的两种双生病毒—中国番茄黄 曲叶病毒(TYLCCNV)和番茄黄曲叶病毒(TYLCV)为研究对象,在温度26~31℃,相对湿度40~60%,光周期L:D=14h:10h的条件下,检测二种双生病毒能 否经烟粉虱的交配传播及经卵传播。研究结果如下:<br>   (1)TYLCCNV或TYLCV经烟粉虱交配在个体间水平传播的检测<br>   通过摄像系统观察表明,带毒烟粉虱雌虫与无毒烟粉虱雄虫以及带毒烟粉虱雄虫与无毒烟粉虱雌虫之间在72h内可交配10次左右;带毒的未交配的烟粉 虱雌虫与无毒雄虫在棉花上共同取食72h后能够产生60~70%的雌性后代。上述结果表明,带毒烟粉虱与无毒烟粉虱在72h之内是可以进行交配的。利用 PCR结合滚环扩增技术对已与带毒烟粉虱交配过的无毒烟粉虱进行病毒DNA检测,结果表明:TYLCCNV或TYLCV可以经B型烟粉虱、Q型烟粉虱的交配途径在 烟粉虱个体之间水平传播,但传播频率很低(3%左右)。病毒种类和烟粉虱的生物型对病毒水平传播的频率没有显著影响。不论是B型烟粉虱还是Q型烟粉 虱,带毒雄虫将病毒水平传播给无毒雌虫与带毒雌虫将病毒水平传播给无毒雄虫的频率没有显著差异。<br>   (2)TYLCCNV或TYLCV经烟粉虱的卵垂直传播的检测<br>   利用PCR结合滚环扩增技术对带毒烟粉虱雌虫各发育阶段的子代进行病毒DNA检测,结果表明:TYLCCNV或TYLCV可以经B型烟粉虱、Q型烟粉虱的卵低频率 (1~28%)地垂直传播至子代,但只在Q型烟粉虱—TYLCV组合的子代成虫中检测到了病毒DNA,检出率为2.7%,其他组合中病毒DNA只能传至子代伪蛹。 B型烟粉虱经卵传播TYLCCNV的频率与传播TYLCV的频率差异不显著,而Q型烟粉虱经卵传播TYLCCNV的频率显著低于传播TYLCV的频率;B型烟粉虱经卵传播 TYLCCNV的频率显著高于Q型烟粉虱,而两种烟粉虱经卵传播TYLCV的频率无显著差异。对带毒烟粉虱子代成虫侵染能力的检测结果表明,携带TYLCCNV的 B型烟粉虱和携带TYLCV的Q型烟粉虱的子代成虫均不具备侵染健康植株的能力。<br>   本研究表明,双生病毒TYLCCNV、TYLCV可以经交配和卵在烟粉虱个体间和代别间传播,但传播频率低,而且经卵传播所发育的子代带毒成虫不具备侵染 寄主植物的能力,所以这两种传播方式对这两种双生病毒病的流行不会有明显作用。这些结果也提示,在不同作物或季节之间,彻底清除发病植株,可 切断病毒流行链,是控制双生病毒流行的有效措施。

6.会议论文 何自福.毛明杰.虞皓.佘小漫 朱槿曲叶病样中烟粉虱传双生病毒的分子检测 2007
朱槿曲叶病在广东部分地区发生严重,病株表现为全株性叶片向上卷曲、叶脉肿大、有耳突、叶质脆硬,病叶从叶缘开始褪绿黄化。应用烟粉虱传双 生病毒特异简并引物AV494和DeP3对各地采集的病样进行PCR检测。结果发现,从这些病样中均能扩增出570bp特异片段;对分离物G6的570bp特异片段进行 克隆与序列测定。BLAST结果表明,与该序列有较高同源率的均属菜豆金色花叶病毒属病毒,其中与木尔坦棉花曲叶病毒Okra分离物同源率最高,为97%。 因此,广东朱槿曲叶病样中存在烟粉虱传双生病毒。

7.学位论文 纠敏 烟粉虱、二种植物双生病毒(TYLCCNV、TbCSV)和寄主植物三者之间的互作 2006
B型烟粉虱Bemisia tabaci近20年来入侵到世界许多国家和地区,已成世界性的重要作物害虫,不仅直接吸食危害,还可传播多种植物双生病毒,导 致植物病毒病流行。定量研究烟粉虱-双生病毒-寄主植物之间的互作,将有助于揭示B型烟粉虱入侵和植物双生病毒病大发生流行的过程及其机理。本文

以采自浙江的B型烟粉虱与本地-非B型ZHJ-1烟粉虱为研究对象,选取两种在我国发生的双生病毒-中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus.TYLCCNV)和烟草曲茎病毒(Tobacco curly shootvirus,TbCSV),研究了TYLCCNV、TbCSV-烟粉虱-寄主植物之间的互作。结果如下: (1)烟粉虱对TYLCCNV及TbCSV的获取、存留及传播B型烟粉虱在TYLCCNV或TbCSV侵染的普通烟植株上饲毒30 min时,就有40%的个体携带 TYLCCNVDNA或TbCSVDNA。当饲毒12h时,B型烟粉虱个体的带毒率即达100%并趋于稳定。而在ZHJ-1烟粉虱个体中,其带毒率达100%的饲毒时间为48 h。 无论是B型烟粉虱或ZHJ-1烟粉虱,一旦获毒,TYLCCNVDNA可在体内终身存留。TbCSVDNA可在带毒的ZHJ-1烟粉虱体内终身存留,但在B型烟粉虱体内却不 能。单头的B型烟粉虱或ZHJ-1烟粉虱均可从TYLCCNV侵染的普通烟植株上取食获毒并传于健康普通烟或番茄植株上,传毒效率随烟粉虱个体数量的增加而 增加,当虫口密度由每株1头增加到每株10头时,其传毒效率即达100%。无论是B型烟粉虱或ZHJ-1烟粉虱,对TYLCCNV的传毒效率均显著高于对TbCSV的 传毒效率。 (2)TYLCCNV及TbCSV经烟粉虱交配传播及经卵传播应用PCR技术,检测了TYLCCNV及TbCSV两种双生病毒是否可经B型烟粉虱交配传播及经卵传播。两种 病毒均未能经交配进行互传,也不能经携带病毒的雌成虫产卵传于后代:带毒雌成虫所产卵在棉花上发育而成的第一代成虫也不具有侵染性。 (3)烟粉虱在健康及TYLCCNV或TbCSV侵染的普通烟上的生物学特性当无毒B型烟粉虱成虫在TYLCCNV或TbCSV侵染的普通烟植株上持续取食,与在健康 普通烟上取食的成虫相比,产卵量均达到2.2倍,寿命分别达3.2倍和1.8倍。ZHJ-1烟粉虱在三个类型植株之间的产卵量和寿命差异均不显著。 在TYLCCNV侵染的普通烟上发育羽化的B型烟粉虱雌成虫,与在健康普通烟植株上发育羽化的个体相比,前者在其原寄主上的产卵量是后者的17.9倍 ,寿命延长25d:在TbCSV侵染的普通烟上发育羽化的B型烟粉虱雌成虫,与在健康普通烟植株上发育羽化的个体相比,前者在其原寄主上的产卵量是后者 的11.9倍,寿命延长20.8 d。 (4)烟粉虱带毒与否对其生物学特性的影响携带TYLCCNV的B型烟粉虱和ZHJ-1烟粉虱雌成虫在健康棉花植株上的产卵量分别较无毒个体的降低 23.2%和33.1%,平均寿命分别缩短11.2d和10.5d;携带TbCSV的B型烟粉虱雌成虫的产卵量较无毒雌成虫的升高29.5%,携带TbCSV的ZHJ-1烟粉虱成虫 的产卵量与无毒雌成虫的差异不显著;携带TbCSV的B型烟粉虱和ZHJ-1烟粉虱雌成虫的平均寿命与无毒个体的差异均不显著。 (5)烟粉虱在病毒侵染的普通烟植株上取食后的羧酸酯酶酶活性变化无论是B型烟粉虱或ZHJ-1烟粉虱,在健康普通烟植株上,其羧酸酯酶酶活性均随 取食时间的延长而降低,而在TYLCCNV或TbCSV侵染的普通烟植株上,其羧酸酯酶活性均随取食时间的延长而升高。 本研究创新之处: (1)首次以详细的试验证据证明B型烟粉虱和ZHJ-1烟粉虱是TY-LCCNV和TbCSV二种双生病毒的传播媒介,并发现二个生物型烟粉虱对TYLCCNV和 TbCSV的获取、存留及传播能力等特性存在差异。 (2)首次证明B型烟粉虱在TYLCCNV或TbCSV侵染的普通烟植株上持续取食,可使其产卵量显著增加,寿命显著延长,而且随着在毒株上续代取食,这 种有利作用迅速增大,而非B型ZHJ-1烟粉虱在TYLCCNV或TbCSV侵染的普通烟植株上取食,并未对其生殖和存活产生有利影响,说明寄主植物中双生病毒 的感染有利于B型烟粉虱种群的繁衍,这可能是近年来B型烟粉虱在许多地区大发生、竞争取代非B型烟粉虱、并大量传播双生病毒导致病毒病大发生的一 个重要机制。 (3)首次研究了双生病毒对烟粉虱羧酸酯酶活性的影响。无论是B型烟粉虱或ZHJ-1烟粉虱个体,其羧酸酯酶酶活性均随在TYLCCNV或TbCSV侵染的普通 烟植株上取食时间的延长而增加,这可能是其在植株上取食适应性增加的一个重要反应。

8.期刊论文 张永平.朱为民.崔辉梅.ZHANG Yong-ping.ZHU Wei-min.CUI Hui-mei 上海地区番茄烟粉虱传双生病毒 PCR检测 -上海农业学报2007,23(4)
番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒,根据其基因序列设计引物COPR、AV494和COPR、COPL,进行PCR检测,结果发现:从感病的DNA中扩增出了356 bp和570 bp目的片段,而健康植株和抗原材料DNA中无此扩增带,表明上海地区番茄黄化曲叶病毒属于烟粉虱传双生病毒.

9.期刊论文 何自福.虞皓.毛明杰.佘小漫.HE Zi-fu.YU Hao.Mao Ming-jie.SHE Xiao-man 鲤肠黄脉病样中烟粉虱 传双生病毒的检测 -西北农林科技大学学报(自然科学版)2005,33(z1)
在严重发生番茄曲叶病的田间,发现主要杂草鲤肠表现出叶脉褪绿黄化、叶片皱缩或卷曲等症状,田间病株率达63%;用烟粉虱传双生病毒兼并引物对 随机采集的20个鲤肠病样进行PCR检测,结果发现,从这些病样中均能扩增出1条356 bp的特异片段;室内人工接种试验结果显示,鲤肠分离物可以侵染番茄 而引起曲叶症状.因此,鲤肠可能是广东番茄曲叶病毒的自然中间寄主.

10.会议论文 何自福.虞皓.罗方芳 广东番茄上烟粉虱传双生病毒的PCR检测 2003
根据已报道的烟粉虱传双生病毒DNA序列保守区,设计了用于扩增该保守区片段的简并引物,用该引物对广东番茄上似双生病毒病样本进行PCR检测 ,可以扩增出预期大小的356bp特异片段;利用NCBI中的BLAST程序对该特异片段序列进行比较分析,结果表明,该特异片段是双生病毒DNA片段。因此 ,可以用该引物来检测广东番茄上烟粉虱传双生病毒。 试验结果还显示,广东番茄上烟粉虱传双生病毒该特异片段与已报道的双生病毒及广西番茄上双生病毒问的同源率均小于82%,说明广东番茄上烟 粉虱传双生病毒与它们可能存在较大的差异。

引证文献(1条) 1.曹卿.杨杰.王军.范方军.仲维功.张玉琼.张云华 灰飞虱共生菌groEL基因的克隆、生物信息学分析及其植物双元 表达载体构建[期刊论文]-分子植物育种 2010(1)

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