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动物源性医疗器械的病毒灭活进展


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动物源性医疗器械的病毒灭活进展
史新立 张东刚 陈冰

?综述

动物体感染病毒或传

染性病原体传播到人体而引起人畜共患疾病的出 现,逐渐引起国际社会的广泛关注。据医学科学家研究发现,近年来在世 界范围内爆发的“牛海绵状脑病”(疯牛病,简称BSE)及发生在绵羊和山羊 中的“传染性海绵状脑病”(羊瘙痒病,简称TSE)与人类新型早老性痴呆症 [1] 即新型克雅氏症 (CJD)有密切关联 。在法规层面,各个国家最初对于发生 动物疫情的国家和地区先后采取了禁止疫区动物和相关产品进口的措施。 对于含有牛羊源成分的医疗器械,我国国家药品监督管理局于2002年 3月发 布了《关于禁止从发生疯牛病的国家或地区进口和销售含有牛羊组织细胞 的医疗器械产品的公告》(国药监械[2002]112号),但对于不在禁止范围 内的动物源性医疗器械,因其取自动物体或其衍生物,仍然涉及病毒或传 染性病原体传播以及免疫原性的风险。 欧盟于2000 年 颁 布EN标 准 :EN12442-1:2000 《 医 疗 器 械 生 产 用 动 物 组织及其衍生物 第1部分:风险分析和管理》、EN12442-2:2000《医疗器 械 生 产 用 动 物 组 织 及 其 衍 生 物 第 2部 分 : 来 源 、 收 集 及 其 处 理 》 、 EN12442-3:2000《医疗器械生产用动物组织及其衍生物 第三部分:清除 和/或灭活病毒及传染性病原体的验证原则》。 参照上述标准,2003 年我国开始了对动物源性医疗器械产品技术审评 的探索。同时,为加强对动物源性医疗器械的病毒传播和免疫原性风险的 控制,作为审评部门,国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心在 欧盟系列标准及美国FDA对动物源性医疗器械产品的相关规定的基础上结 合我国对医疗器械产品注册管理现状,制订了《动物源性医疗器械产品补 充规定》,作为对动物源性医疗器械产品技术审评原则。 2006年,国家食品药品监督管理局对国药监械[2002]112号文件进行 修订,更新为《关于含有牛、羊源性材料医疗器械注册有关事宜的公告》 (国食药监械[ 2006]407号),国家食品药品监督管理局医疗器械技术审 评中心依据407号公告,以及欧盟EN12442 :2003系列标准,对《动物源性 医疗器械产品补充规定》进行修订,更新为《动物源性医疗器械产品注册 申报资料撰写指导原则》。
作者单位:100044 北京,国家食品药品监督管理局医疗器械 技术审评中心(史新立); 100190 北京, 中国科学院遗传与发育 生 物学研究所(张东刚、陈冰) 通讯作者:史新立, Email:shixl@cmde.org.cn

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上述法规与指导性文件的制定对于保证动物源性医疗器械产品的应用安 全提供了依据。 目前实际应用的动物源性医疗器械的病毒灭活方法有多种,这里做简要 介绍,其中重点介绍电离辐照灭活方法: 一、有机溶剂/洗涤剂法(S/D法) S/D法是一种比较成熟的方法,其灭活病毒的机制就是用化学试剂破坏 有包膜病毒外膜结构的完整性或靶细胞受体识别位点被破坏, 而使病毒失去 传染性和复制能力 。S/D 法消毒效果受温度影响。温度越高, 分子热运动越 快, 加快了反应, 使得去污剂更易破坏病毒结构, 使其更易被有机溶剂抽提, 达 到灭活效果所需时间越短。有机试剂选择的不同,病毒灭活的效果也不一 样。Horowitz等报道了有机溶剂磷酸三丁酯(TNBP)加表面活性剂吐温80灭
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活病毒的效果明显高于乙醚加吐温80 的灭活效果 。S/D法常用的灭活条件 是 0.3%TNBP和 1%吐温 80,在 24℃ 处 理 至 少 6 h; 0.3%TNBP和 1%Triton X100,在24℃处理至少4 h 。S/D法在灭活病毒全过程中应将温度控制在规定 的 范 围 内 。 S/D法 对 非 脂 质 包 膜 病 毒 无 杀 灭 作 用 , 快 速 变 异 的 病 毒 ( 如 HIV)也可突变为无脂质包膜的形态。要保证灭活脂质包膜病毒和非脂质包 [4] 膜病毒的双保险,需要结合其他病毒灭活方法,如与巴斯德消毒法结合 。 二、热力消毒法 热力消毒的机制是使蛋白质变性,对于不耐热的病毒是极好的灭活方 法,对于部分需要保持生物活性或结构的生物材料来说,应用可能会受到 限制。巴斯德消毒法(60 ℃,10 h)可以保持生物活性,但对某些病毒则灭 活效果不好。有实验以HBV、 HCV为指示病毒,结果仅证明HCV被灭活失 去感染力[5]。 三、烷基化剂灭菌 烷基化剂通过对微生物的蛋白质、DNA 、RNA 产生烷基化作用, 引起微 生 物 的 新 陈 代 谢 失 活 而 将 其 杀 灭 。 液 体 和 气 体 均 有 灭 菌 作 用, 常用气体灭 菌。其作用特点为杀菌谱广, 杀菌力强, 毒副作用低。医学和工业消毒应用最 广泛的烷基化剂为环氧乙烷(Ethylene oxide,EO),环氧乙烷有很强的穿透 能力,能渗透进入物体的孔隙、网状结构内和穿透包装物(布、纸袋)。EO气 体杀菌能力比液体强,对细菌繁殖体及芽胞、真菌和病毒均有良好的杀灭 作用。 四、电离辐照 电离辐照灭活是利用γ射线、X线或电子辐射能 穿透物品、杀灭其中微 生物的性能进行低温消毒灭菌的方法。辐照灭菌分为直接作用和间接作用 , 直接作用是射线激发的电子作用于DNA,使分子键断裂;间接作用是射线

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引起细胞内水的解离,生成H + 、OH -离子及H 、OH自由基,从而生成过氧化 物,作用于核酸、酶和蛋白质。γ射线来自核的转变,由光子组成,在放 射性衰变过程中所形成的子核处于激发和不稳定状态,当由高激发态跃迁 回到低激发态时即释放出γ射线。常用的γ射线放射源有两种: 60钴和1 3 7铯。 目前已有大量实验证实γ射线辐照对各种微生物均有杀灭作用,包括 [6, 7] 有包膜和无包膜病毒及所有的基因型物质 。一般认为,革兰阴性菌比革 兰阳性菌对电离辐射敏感,细菌芽 胞比繁殖体抗力强,病毒对电离辐射的 [8] 抗力一般都比细菌强,在活组织中的病毒抗力最强 。与传统的消毒灭菌方 法相比较,γ射线辐照有其独特的优点:(1) 不使物品升温,适用于忌热物 品的消毒,除某些塑料、活细胞及其制剂外,许多医用物品都可用它进行 消毒灭菌。(2) 穿透力强。射线可穿透被照物品的各个部位,一般不受物品 包 装 、 形 态 的 限 制 。 (3) 被 照 物 品 不 会 产 生 感 生 放 射 性 , 辐 照 后 无 残 留 毒 性。 (4)方法简便; (5) 省能,尤其适于大规模工业化处理 [9]。国际原子能机 构推荐的医疗用品的灭菌剂量为15~25 k G y,大多数国家以平均吸收剂量 25 k G y作为医疗用品灭菌的合适剂量,可保证残存活菌减少至10 -6 , 也可保 证 厚 度5 cm以下的生物材料如皮质骨等完全无菌及乙肝病毒、艾滋病病毒 等病毒的灭活。辐照灭菌对细菌繁殖体、芽 胞 、真菌和病毒等均有良好的 杀灭作用。 对生物材料进行病毒灭活的关键在于彻底进行病毒灭活的同时,尽最 大限度地保留材料的生物活性和结构性质,因而处理方法不能过于剧烈。 60 目前临床上趋向于应用环氧乙烷气体和 Co γ射线辐照杀毒。γ射线照射通 常是消毒胶原类生物材料的最好方法,不但灭活效率高,而且消毒效果不 受一般包装、材料性状的影响,能在严密封装后消毒,对存放和随时应用 带来极大便利;照射后不残留产生毒副作用的物质,简捷安全。桑宏勋等 [10] 60 对 比 了EO和 C oγ照射的病毒灭活效果: EO气体和γ射线均有较强的穿 透能力, 能穿透多层纸张、绷带及各种包装材料如聚乙烯、聚氯乙烯等,实 际应用中可根据包装情况适当增加消毒剂量;用于骨移植材料消毒时,对 多 孔 状 的 松 质 骨 均 较 易 穿 透 , 但 对 致 密 的 皮 质 骨 (如 股 骨 干 )EO仅 能 穿 透 6 mm,而γ射线可达5 cm[11] , 明显优于EO气体 , 这是γ射线在消毒大段异体库 存骨中有广泛应用的原因之一。为了达到对生物材料的消毒灭菌要求,美 国组织库协会(AATB)标准要求γ射线辐照剂量应不低于 15 kGy。对材料的 消毒处理不在于成功地保存其细胞代谢活性,而在于彻底消毒灭菌的同时 尽量减少对移植物的理化性质及生物活性的影响,因而应根据生物材料的 特性及病原微生物污染情况,选择适当的消毒方法和剂量,以期达到最好 的临床应用效果。

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一般情况下, 20~50 kGy剂量的γ射线辐照几乎能灭活所有的病毒,但 灭活病毒的同时,辐照剂量越大,对材料成分的损伤也越大,如何在灭活 病毒的同时又保留材料有效成分、不破坏材料的生物活性,这将是γ射线 辐照应用于生物材料病毒灭活的关键。 -1 胡蕴玉等 [10]的研究证明,经过20kGy以下γ射线照射或 2500 mg?h-1? L 以 下剂量EO处理的颗粒状骨移植物在植入小鼠肌袋后,可诱导生成大量软骨 及骨小梁状骨,与对照组无明显差异,但消毒剂量进一步增大时,可见诱 导生成骨软骨量减少,时间推后;当γ射线辐照剂量达4 0 k G y以上或 EO消 毒5000 mg?h -1?L -1以上时活性完全丧失,不能诱导骨软骨生成。 雷军等 设计了γ射线辐照对骨生物力学特性影响的实验。骨是骨胶原 纤维和无机晶体的组合物。通常胶原纤维排列成束,弹性模量很高的羟基 磷灰石晶体沿胶原纤维方向排列,可组成力学性质优良的复合材料。骨的 生物力学特性与骨矿成分、胶原成分,及其相互作用有关,矿质化程度影 响骨的弹性模量,胶原成分影响骨的塑性行为。辐照对骨矿成分没有影 响,但可增高骨胶原和聚糖胺的溶解度,使骨基质纤维破坏,从而影响骨 塑性行为[13]。雷军等的实验证明:γ射线辐照对弹性模量没有影响,而使最 大载荷(描述骨的塑性行为)有所下降,且具有剂量依赖关系,剂量越大下降 越明显,但在 25 kGy 以下辐照时,这种下降没有显著性差异,即使机械性 能轻微下降,两次灭菌也是必要的,因为这是防止疾病通过骨移植传播的 50 重要手段,而且在使用范围内载荷不会导致骨折。而30、 kGy 的辐照明 显降低骨环的最大载荷,与对照组比较差异有统计学意义 ( P < 0. 05) 。因 此,γ射线对骨生物力学特性的影响有剂量依赖性,25 kGy的剂量不影响 骨的生物力学特性,且能有效灭活HBV等病毒。 临床使用的病毒灭活方法中还包括使用化学消毒剂进行病毒灭活。化 学消毒剂是应用一些化学试剂杀灭病毒,如醛类(主要是甲醛、聚甲醛 等);含氯消毒剂,如次氯酸钠(消毒效果取决于有效氯的含量,含量越 高,消毒能力越强);碱类制剂(主要有氢氧化钠)。其灭活机制主要是 通过使病毒蛋白或核酸变性而令病毒失去侵染力甚至死亡。根据生物材料 的特性及病原微生物污染情况,选择适当的消毒方法和剂量,以期达到最 好的临床应用效果。在最初的病毒灭活方法中,主要采用化学方法进行, 如医用酒精、硫柳汞或环氧乙烷。酒精和硫柳汞等消毒方法不能达到材料 内深部灭菌,比如骨材料,而环氧乙烷灭菌后残留的有毒物质存在致突和 致癌的危险。目前 , 化学灭活方法已经逐渐被辐照灭活所取代。 动物源性医疗器械的动物来源不同,可能存在并传播的病毒种类也各 有不同。应根据所报道的动物可能携带的潜在病毒制定不同的病毒灭活方
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法。比如,常见的牛源性材料,就要针对牛可能潜在的病毒如口蹄疫病 毒、疯牛病病毒等进行有效地灭活处理。牛的口蹄疫病毒对高温敏感: 60 ℃水中30 min 病毒被杀死, 80℃时病毒立即死亡。病毒对碱的抵抗力较 弱:用20%草木灰水经2 h可杀死病毒,1%~2%氢氧化钠(NaOH)溶液能 在 5~10 min内使病毒灭活。朊病毒是迄今为止对理化因子抵抗力最强的病 原生物因子,煮沸方法、紫外线照射均不能破坏它的感染性,引起疯牛病 ( BSE)的病原体PrPsc即为此类物质。NaOH溶液被广泛应用于灭活 BSE的 PrPsc,在处理医疗器械或动物废物时,WHO建议的BSE PrPsc灭活方法是 在 室 温20℃、2.5%次氯酸钠(NaClO 3) 溶 液 处 理60 min或1 mol/L NaOH溶 液 处 理 60 min。 因 此 , 对 于 来 源 于 动 物 的 生 物 材 料 制 品 , 在 室 温 20℃ 、 2.5% NaClO 3溶液处理60 min 或1 mol/L NaOH溶液处理 60 min将可以保证产 品的安全。在这样的条件下,不仅可以有效灭活疯牛病病原体,同时还可 [14] 以杀灭病毒、细菌等所有病原体 。 生物制品的安全性控制建立在对原材料、生产工艺及产品等各个方面 进行全面严格控制要求的基础上,仅仅依靠病毒灭活工艺步骤本身保证制 品的安全性显然是不够的,而且十分危险。因此应严格控制来源动物的质 量,使用高等级的实验动物和其他符合兽医检验要求的健康动物,从而减 少由于动物源性病毒引起人群感染和致病的危险。目前厂家选择的灭活/ 去 除病毒工艺步骤多是参照血 液制品生产的工艺。由于血液制品可能传播的 对人类危害大的病毒主要是 HCV、 HIV和 HBV,均为脂包膜病毒 ,因此 其灭活工艺针对性较强。在血液制品的几种病毒灭活方法中,国内外均认为 S/ D法对脂包膜病毒灭活效果最好[ 1 6 - 1 7 ] 。而动物源性医疗器械因其来源动物 不同,可能存在并传播的病毒也各有不同,因此应根据病毒污染的可能原 因和环节采取相适应的灭活/ 去除措施,在保证制品活性前提下,研究开发 , 更安全、高效的病毒灭活/去除新方法从而充分保证产品的质量及安全性。
参 考 文 献 1 由少华 . 动物源原料医疗器械病毒和传染因子携带风险的监控 [J].中国医疗器械杂志 ,2004, 28(5): 356358 2 周锡鹏 . S/D 在不同 pH条件下灭活静注丙球中VSV的研究[J]. 中国输血杂志 ,1997, 10(1): 14-17. 3 Horowitz B.Inactivation of virusesfound with plasma protein and cellular components. In: Goldstein J,ed. BiotechnologyofBlood [M].Broston:Butterworth-Heinemenn, 1991: 417-450. 4 周铁群,邱平,王剑锋,等. 对血液制品S/D病毒灭活方法的验证[J]. 中国生物学杂志,1995,8:108. 5 Kilfenhaus J, Groner A, NowakT, et al.Analysis ofhumanplasmaproducts:polymerase chain reaction does notdiscriminatebetween live and inactivatedviruses [J].Transfusion, 1997,37(9):935-940. 6 Sullivan R, Fassolitis AC, Larkin EP, et al. Inactivation of thrity virus by gamma radiation [J]. Appl Microbiol, 1971,22(1):61-65.
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史新立, 张东刚 , 陈 冰 . 动物源性医疗器械的病毒灭活进展 [J/CD]中华损伤与修复杂志:电子版,2009,4(3): . 340-345.


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