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蝴蝶兰组织培养快繁技术示范应用


扬州大学 硕士学位论文 蝴蝶兰组织培养快繁技术示范应用 姓名:孙莉 申请学位级别:硕士 专业:农业推广·园艺 指导教师:韦军;吴美南 20091201

孙莉:蝴蝶兰组织培养快繁技术示范应用

手两



近年来,随着人民生活水平和生活质量的不断提高,人们对以蝴蝶兰为代表
的高档花卉的需

求不断上升,随之相应的设施栽培面积也逐步发展,种植效益普 遍较高。由于蝴蝶兰用常规的方法繁殖困难,速度很慢;依赖进口种苗成本居高 不下,加上本地区组培技术应用不成熟,这大大限制了种植规模的进一步扩大。

本文研究内容包括两方面:
l、针对蝴蝶兰常规繁殖困难的问题,分别采用无菌播种法和花梗离体培养法 对蝴蝶兰组织培养技术的进行了研究,具体培养方法如下: (1)无菌播种法。蝴蝶兰经人工授粉获得果荚,在无菌条件下将细小如粉尘 的种子接种在培养基上,研究基本培养基对蝴蝶兰种子萌发的影响、激素6-BA浓 度对蝴蝶兰种子萌发的影响以及不同培养基对幼苗生长及生根的影响。结果表明 在花宝培养基中种子萌发率比MS培养基中高;相同基本培养基条件下6-BA浓度 0.3mg/1时萌发率最高;在生根培养基中加入香蕉汁生根较好。 (2)花梗离体培养法。将花梗腋芽节段接种在培养基中萌发后获取花梗苗, 将其切下直接诱导丛生芽,花梗苗的繁殖系数受6.BA和NAA浓度及其组合的影 响,最佳组合是6-BAI.5mg/I+NAA0.5mg/l;6-BA、NAA对叶片诱导类原球茎有 影响,6-BA3
mg/I+NAA0.5

rag/1的培养基上,绝大多数都可诱导出类原球茎;基本

培养基对类原球茎增殖和分化有影响,花宝培养基中类原球茎的成活率最高;不

定芽生根壮苗培养基用I/2MS+NAA0.5mg/l+香蕉10附蔗糖20.Og/l+琼脂7.5酣,
ph=5.6。
2、

蝴蝶兰标准化设施栽培技术的示范应用 (1)高效栽培设施的控制。其中包括对温度的调节、光照的调节和

湿度的调节。 (2)蝴蝶兰的栽培技术。基质选择透气透水的水苔最适合;苗期管 理包括炼苗驯化技术、小苗、中苗、以及大苗管理技术。 (3)蝴蝶兰的催花技术。催花条件为昼夜温差8~1 0。C,同时追加 追加P、K肥,光照要求强光照,适当控水。花梗花芽抽出后及时固定这 样有利于造型。 关键词:组织培养;蝴蝶兰;无菌播种;离体培养;栽培技术;

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Abstract
As the quality of people’S life improved constantly in recent years,the demand of top

grade flowers such culture had
conventional


growing.Consequently,the area of facilities corresponding development and the benefit WaS high.Since the propagation methods of Phalaenopsis WaS difficult and slow,the cost of
aS

Phalaenopsis kept

imported seed remained at a high level,and the domestic application technology of tissue culture was not mature.All of these made restrictions on the further extend of Phalaenopsis cultivation scale.This research included two parts aS follows: 1、Due to the difficulty of conventional propagation in Phalaenopsis,the methods of Aseptic sowing and Pedicel in vitro culture were researched for Phalaenopsis tissue in this study.The specific

techniques were
getting

as

(1)Aseptic

sowing:after

following: the Phalaenopsis

legume

through

artificial
sterile

pollination,the

seeds were implanted into culture

medium under growth and
rate

conditions.The effects of basic Medium

and

6-BA

content on
on

Phalaenopsis
rooting

seed germination,and the effects of different Mediums of the

seedlings were studied.The results showed that:the in
rate

of seed

germination

Was best for rooting. (2)Pedicel in vitro culture:the cutting segments of auxiliary buds of Phalaenopsis pedicel were implanted into mediums,after getting the pedicel buds

germination rooting medium with

Medium Hyponex WaS higher than that in MS;the seed was highest when the content of 6-BA Was 0.3mg/L;the

banana juice

and

seedl ings,2/3 of the pedicel seedlings leaves were cut off,the base of stem were
cut to

induce clustered shoots.The multiple index of pedicel seedlings Was

influenced by the contents and combinations of 6-BA multiplication medium WaS 6-BA 1.5 for promoting seedlings
1 0%+agar

and

NAA.The best

m幽+NAA

0.5mg/l,and the best medium

and

rooting was 1/2 MS+NAA 0.5mg/L+banana juice

7.5∥l,ph5.6.
standardized facilities culture

2.The research
(1)The

on

techniques of Phalaenopsis.

control

of high-efficiency culture facilities.It included regulations of

temperature,light

and

humidity. of Phalaenopsis.It was optimum to choose ventilate seedling management included techniques

(2)The cultivation

techniques
as

and

dank sphagnum

substrate.The
of

of promoting seedlings,young and old seedling

managements.
DIF

(3)Flower forcing

techniques

Phalaenopsis.The

temperature of flower

forcing was 8~10。C,top dressed P、K fertilizer in addition,bright light and proper water control were demanded.After the stalk sprout,it should be bound
in time which is good for shaping.

Key words:tissue culture,Phalaenopsis;aseptic sowing,in vitro culture,cultivation

techniques

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学位论文作者签名:弓卜两
签字日期:丑哆年乜月/z-日 |

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学位论文作者签名:孙莉 签字日期:脚厂年,z月,2,日

导师签名:

签字日期:玉一年几月,。日


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孙莉:蝴蝶兰组织培养快繁技术示范应用

引言
生物技术被誉为21世纪的主导农业技术,已率先在花卉业的科研和生产中得 到验证。它的高投入、高产出、高效益称之为朝阳产业。随着国内外对高档花卉 需求的高速增长,尤其足花卉的品种、品质以及数量都不能与迅速增长的市场需 求相适应。为响应国家农村产业结构调整和行业发展、创新政策,开展高档花卉 育种和组培快繁,开展科研成果转化为适合规模生产所需的关键技术研究,实现 高档花卉生产工艺规范化、产品质量标准化、工艺装置智能化和技术一流、环境 一流、成果一流的战略目标。为在高档花卉生物技术研究和高档花卉产业化的发 展上能够代表地方水平,为本地区花卉生产提供主导技术和示范产品,本试验比 较系统的研究了高档观赏花卉蝴蝶兰的组培快繁技术和设施栽培管理技术等先进 实用的现代农业技术,开创了边研究、边中试、边示范应用的新机制。 近年来,随着人民生活水平的提高,高档花卉在市场上需求不断上升,随之 相应的设旋栽培面积也有了一定的发展,种植效益较高。蝴蝶兰是目前年宵花中 的主流种类,常规的方法繁殖困难,繁殖速度慢,依赖进口成本居高不下,本地 区组培技术应用并不成熟,这一系列原因限制了蝴蝶兰种植规模的进一步扩大。 本文引进筛选优质蝴蝶兰新品种,采用无菌播种和花梗离体培养两种组织培养技 术,开展有关蝴蝶兰组培快繁的研究和配套设施栽培技术示范应用。针对本地区 的气候环境,从蝴蝶兰生长习性出发对生长过程中的生态环境、移栽基 质及设施方面进行讨论,研究了蝴蝶兰各生长发育阶段的栽培管理措施, 使生态环境标准化、栽培技术模式化、栽培设施合理化。最终旨在及时有 效解决常规繁殖困难的蝴蝶兰快繁和大批量繁殖的难题,达到缩短种苗生产周期、 快速扩大生产规模、保证优质种苗质量以及深度利用植物种质资源、提高经济效 益、促进地区农业结构调整的目的。

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1.植物组织培养的研究进展
1.1植物组织培养的定义及生理依据
植物组织培养是本世纪初开始,以植物生理学为基础发展起来的一项新兴技 术和手段。植物组织培养按其原始意义指愈伤组织培养。但发展到今天,其范围 日益扩大,己包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体,应用无 菌操作方法,在适宜的培养基上培养增殖并逐步分化出器官(芽和根)和形成小 植株的方法。植物各类组织培养操作技术可以统称为植物组织培养技术¨1。 根据材料的来源和特性,可以将植物的组织培养分为植物培养、胚胎培养、 器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养等‘11。 植物组织培养的生理依据有植物细胞全能性和植物生长调节剂。细胞的全能 性学说指植物的幼龄体细胞,含有全套遗传基因,具有形成完整植株的能力。近 几年来,植物组织培养正在植物科学各个领域蓬勃发展。无论是植物器官、组织 和细胞的培养,还是原生质体的分离、融合和培养均取得了显著成效,通过对各 种植物材料的无菌培养,研究了愈伤组织诱导、器官分化和离体培养条件下培养 材料(外植体)的生长发育规律,以及影响这些过程的各种因素‘21。

1.2植物组织培养的发展简史
1938~1939年Schwann和Schleiden创立细胞学说D’,认为植物和动物是由 细胞构成的,并且由细胞分裂而增多,并组建生物体。1902年G.Haberlandt发表 植物细胞培养第一篇论文,认为:在某种情况下,采用培养基培养植物细胞的方 法,可以培养单个细胞或“人工胚",提出了细胞全能性的设想。到1904年E.hanning 培养萝b和辣菜根的胚,发现在离体培养下胚胎可以发育成熟,这是有关胚培养 的第一篇论文。1908年S.simon白杨嫩茎在培养过程中观察到愈伤组织分化出根 和芽。1922年W.Kott用稀释的Knop溶液加入复杂的有机物,培养豌豆和玉米的 根尖获得成功。1933年我国李继侗在培养银杏胚胎是将胚乳提取物加入培养基中 培养获得成功。1934年荷兰植物学家F.W.Went发现了生长素吲哚乙酸。这是人们 首次认识生长调节物质。White发现了首先建立了人工合成综合培养基,证明根尖

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在培养过程中需补充维生素才能存活生长。1941年,J.van Overbeek试用椰乳置于 培养基中培养使曼陀罗的心形期的幼胚培养成功。1943年,White重新提出细胞 全能性学说,撰写《植物组织培养手册》。1949年,Camus将植物芽嫁接在培养 的组织上,诱导出维管组织,开创试管嫁接技术首例。1956年,Steward和Shantz 用胡萝卜根外植体愈伤组织进行液体培养,成功进行了继代培养。1958年,Steward 等人用胡萝卜进行组织培养,诱导分化出完整小植株。 上个世纪60年代后,植物组织培养进入大规模应用阶段。1960年G.Morel‘21 采用兰属的茎尖培养,实现了去病毒和快速繁殖两个目的,这是经过茎尖诱导原 球茎,再通过原球茎分化出小植株的方式而再生。按照这种方式,1年内可从一个 兰花茎尖繁殖出几百万具有相同遗传基因的植株。这一技术导致很多国家兴起兰 花工业革命,开创了组织培养在生产上的应用。1 960年,E.C.Cocking采用纤维素 酶、果胶酶等酶制剂分离番茄幼根,获得大量原生质体。1971年,I.Takebe等首 次报道烟草原生质体通过细胞壁再生、细胞分裂等过程再生除了完整的植株,确 认了原生质体的全能性。1972年,P.S.Carlson完成了粉蓝烟草和长花烟草的原生 质体融合,实现了体细胞杂交。1962年,K.Kallta完善了试管内传粉受精技术,、克 服花粉与柱头间的两性不亲和现象。1962年,Murashige和Skoog发表了有关促进 烟草组织快速生长的培养基成分的文章,这就是目前普遍适用的MS培养基。1964 年印度印度德里大学的S.Guha和S.C.Maheshwari培养南洋金花未成熟花药时,发 现了有大量胚状体形成的小植株,证明源于花粉粒,是单倍体植株。这一发现掀 起了超越单倍体育种的技术,以加快杂交育种工作速度。

上个世纪70年代后组织培养大量应用于生产进入高潮。我国应用花药培养育
成第一个烟草品种,随后育成了水稻、小麦的新品种。马铃薯脱毒苗、葡萄脱毒 苗、康乃馨脱毒苗等大量的无性繁殖脱毒苗均相继应用于生产。20世纪80年代后

大量经济作物的组培快繁相继也获得成功,如甘蔗、花卉、草莓、柑橘等。植物
组织培养发展历程从提出细胞学说开始,经历漫长的道路发展至今。植物组织培 养的历史就是对植物细胞全能性理论的证明和得到广泛应用的历史。植物组织培

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6 一

养技术把植物的细胞、组织、器官等在无菌条件下置于培养基上,培养基中有植 物所需的各种营养成分和控制植物生长的生长调节物质,在适宜的环境条件下, 植物的一个细胞或很小的一块组织就可以长成一株幼苗。培育出的幼苗可以继续 切割,再次培养,这样就可繁殖出大量的植物幼苗。由于植物组织培养的快速繁 殖比常规方法的繁殖速度快数万倍到数百万倍,且不受地区和气候的影响,可以 及时提供大量优质种苗。 因此对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的名优品种可

以实现快速繁殖。己建成的一套完整的植物组织培养技术在不断向纵深方向发展: 一是扩大在各重要经济植物上的研究;二是加强了细胞的生长、生理生化机理和 遗传学研究;三是在细胞分子水平上,开拓新的研究内容,如DNA导入、基因工 程等。

1.3植物组织培养的优点
1.3.1研究材料来源单一,无性系遗传背景一致 在生物学研究中,试验材料的遗传性是否单一一致,是至关重要的,否则试 验结果没有意义。在组织培养中由于植物细胞具有全能性,因此单个或小块组织 细胞进行培养可获得各水平的无性系,即克隆‘41。 1.3.2经济方便效益高 植物组织培养试验微型化、精密化,节约人力、物力、土地。管理方便,植 物组织培养比田间试验、盆栽、水培、沙培试验都经济精细,还避免了其他生物 特别是微生物的干扰,工作效率大幅度提高¨1。 1.3.3培养条件可控,可周年循环生产 植物组织培养的材料是在人为提供的培养基和小气候环境条件下生长,温度、 光照强度、光周期等等都是可控的,不受季节限制,可全年循环试验生产¨1。 1.3.4生长周期短重复性强 因为组织培养过程中营养条件都是根据植物的生长要求提供的优良条件,所 以生长快,大大缩短了试验周期,同时加上前三个优点,试验结果重现性很高, 提高了试验结果的可信程度‘41。

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1.3.5管理方便,利于自动化控制 植物组织培养的场所的认为提供的温度、光照、湿度、营养、激素等,进行 高度集约化、高密度的科学培养,省去田问的中耕除草、浇水施肥,病虫防治等 繁杂劳动,节省人力、物力。通过仪表自动化控制,有利于工厂化生产。

1.4组织快繁技术在花卉生产上的应用研究及展望
花卉狭义的概念,即植物学上所指的有花植物的繁殖器官,而广义的花卉概 念,即:具有观赏价值,经一定技艺进行栽培和养护的植物及其一部分。观赏部 位不限于花,可以是根、茎、叶、花、果实、种子任何部位。广义的花卉指切花、 切叶、盆花、盆景、观叶植物、草坪、绿化苗木、干花等‘51。20世纪末,全球花 卉总产值超过2000亿美元,其中参与统计的79个国家和地区仅切花、切叶的销 售额近100亿美元,盆花、盆景、观叶植物等鲜活植物的贸易额达40多亿美元。 由草坪、绿化苗木等园林植物产生的产值更大。这是人类要求改善生态环境和保 护地球的呼声,也是人类热爱自然、热爱绿化、热爱园艺产品的必然结果。 花卉产业是随着国民经济的迅速发展和人民生活水平的大幅度提高而新兴的 “朝阳产业”。随着经济的全球化以及我国经济的迅猛发展,花卉的需求量日益 上升,花卉业成了全球性的工业。我国政府也将花卉产业作为今后调整农业结构、 增加农民收入、加快农业现代化建设的重要产业加以扶持。20世纪90年代中后期, 以蝴蝶兰为代表的洋兰在我国市场上日益走俏,深受市场追捧。据统计,洋兰的 年销量约占国际花卉市场的三分之一,是当今世界现代花卉的。 1.4.1组培快繁技术应用于花卉新品种选育 在花卉植物生产中,经常会出现芽变,但由于一般变异部位较小,很难用传 统的扦插嫁接方法保存繁殖,因此这类种质资源无法保存下来。而将组织培养技 术应用在该芽变组织,就可以培育成小苗植株,形成试管形态的繁殖体系,利用

快繁技术就可以很快培育成一个有价值的新品种。据报道应用菊花花瓣培养选育 出了紫花品种“1,兰花分生组织培养发现白化叶和斑叶植株新品种,百合组织培
养过程中加入秋水仙碱诱变出多倍体百合‘71,表现出花朵大花期早等特点,这样

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生产上可以提前上市时间。 1.4.2利用组织培养技术生产脱毒种苗 采用传统的扦插、嫁接及分株的方法繁殖的后代,由于昆虫媒介,绝大多数 感染一种或数种病毒或者类病毒。长期运用传统的无性繁殖方法繁殖下去病毒会 积累起来,危害逐年加重,花朵变小,花朵数量变少,色泽变淡,严重影响观赏 品质,对生产上造成严重损失,应用组培脱毒可以解决这一问题。在兰花“1、大 丽花‘91、菊花n盯、香石竹n嵋上都有应用组培脱毒的例子。脱毒后的种苗植株生长 势强,花朵大,花朵数量增加,色泽鲜艳。目前还没有其他更好的方法能使花卉 脱毒提高品质的效果。 植物脱毒和离体快速繁殖是目前植物组织培养应用最多、最有效的一项技术。 很多农作物都带有病毒,特别是无性繁殖植物如马铃薯、甘薯、草莓、大蒜等。 但是,感病植株并非所有部位都带有病毒。White早在1943年就发现植物生长点 附近的病毒浓度很低甚至无病毒。利用植物茎尖组织培养方法,取一定大小的茎 尖进行培养,可获得脱病毒苗,再用脱毒苗快速繁殖,生产大量脱毒种苗应用于 农业生产,能极大地提高产量和改善品质‘31。目前组培脱毒快繁技术在马铃薯、 甘薯、甘蔗、菠萝、香蕉、草莓等主要经济作物上已成功应用。一些繁殖系数低、 不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇"作物品种以及脱毒苗、新育成的品种、 新引进品种、稀缺育种材料、优良单株、濒危植物和基因工程植株等都可通过离 体快速繁殖,获得比常规方法快数万倍至数百万倍的繁殖效果。另外,在观赏植 物、园艺作物、经济林木上也大量利用了离体快繁技术,如华南植物园、上海园 林科研所等单位利用组培快繁方法繁殖兰花、非洲紫罗兰,中国农科院花卉所成 功培育出的香石竹、白鹤芋、火鹤等组培苗已在北京地区的鲜花生产企业进行了 大规模的推广应用。组培试管苗生产已在国际国内市场形成产业化“1。 通常采用茎尖培养脱毒,原理是:病毒是通过维管柬传导的,运用植物的营 养器官繁殖会把病毒带到新的植株上而发生病害。但是感病植株病毒分布不均,

不是每个部位都带有病毒,茎尖生长点尚未分化维管束的部分可能就不带病毒或

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者是含毒量很最低,病毒扩散慢,加上植物细胞不断分裂增生,所以病毒含量很 少,在茎尖生长点几乎检测不出病毒。利用茎尖培养,切取很小的茎尖,越小越 好,但太小了不容易成活,太大了不能去毒,难度较高,所以选取的材料要多, 才能选出无病毒幼苗,再用脱毒苗进行繁殖,最终出来的植株就不会或者极少带 毒121。所获得的脱毒苗一定要经过鉴定,证明确实不带病毒后才能扩大生产。实 践证明,通过这种方法可以除去马铃薯带有的x、YY、A、M等病毒,脱毒植株产 量比不脱毒的增产30%以上。 1.4.3组织培养为种质资源保存提供了保障 有入断言:谁掌握了种质资源,谁就掌握了农业的未来。这句话强调了种质 资源的重要性。种质资源有很多作用,如用于繁育的亲本、用于改造环境、建立 生态平衡;用于各种各样的科学研究等等。农业生产是在现有种质资源的基础上 进行的,由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类活动对大自然的影响,已有相 当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。具有独特遗传性状的生物物种的绝 迹是不可挽回的损失。种质资源的收集保存贮藏是一个耗时耗资的繁琐工作,现 在可以借助试管低温保存,利用植物组织和细胞低温保存种质n羽,每年转接1~2 次即可,可大大节约人力、物力和土地,还可挽救濒危物种。同时,离体保存的 材料不受各种病虫害侵染、不受季节限制,利于种质资源的地区间及国际间的交 换和转移,给保存和抢救有用基因带来了希望。例如胡萝卜和烟草等植物的细胞 悬浮物,在一20一-.-196℃的低温下贮藏数月,能恢复生长并且生成植株。目前, 我国在多个地方建立了植物种质资源离体保存设施。据报道这种保存方法可以保 存20年,估计可以无限制的保存下去。需要的时候可以将这些品种再复制出来, 这样可以省工节本,省去了大量的人力物力D31。 1.4.4无性系的快速繁殖 在花卉植物上需要大量统一规格的苗木,常规繁殖方法每年只能繁殖几倍到 十几倍,组织培养方法每年可以繁殖出几万至几百万的规格一致的幼苗晦1。这对生 产实际有很大的作用。这对优质新品种,特别是珍稀品种的繁育是一个非常有价

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值的方法。 1.4.5组织培养应用于有机物的生产 利用组织培养中的细胞培养的方法生产对人类有益的化合物,这类研究已经 开展了20年,今天已经达到了应用阶段,进入商品化生产阶段。比如生产抗病毒

物质、抗生素、蛋白酶抑制剂等。还可用此方法培养酶、色素、抗癌物质、抗菌
素、以及调味品、芳香品等等。例如葡萄中的芳香物质,化学方法很难合成,但 将这类芳香类物质用细胞悬浮培养可以直接繁殖生产。利用植物组织或细胞大规 模培养,有可能生产出人类所需要的一切天然有机化合物,如蛋白质、脂肪、糖 类、药物、香料、生物碱及其他化合物。因此,近年来这一领域已引起人们的极 大兴趣,许多产业部门纷纷投资进行研究。目前,大约已有20多种植物组织培养 形成的植株中的有效物质含量高于原植物,国际上已获得这方面专利100多项。用

单细胞培养生产蛋白质,将给饲料和食品工业提供广阔的原料生产前途;用组织
培养方法生产微生物以及人工不能合成的药物或有效成分的研究正在不断深入, 如中国科学院植物研究所的紫草细胞大规模培养、华中理工大学的红豆杉细胞大 规模培养、上海中医药大学的黄芪毛状根大规模培养等,有些已进行产业化生产, 预计今后将有更大发展。

1.5蝴蝶兰组织培养的研究进展
蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科蝴蝶兰属兰花,原生种有70多种,原产于我 国的台湾、菲律宾、印度尼西亚、泰国、马来西亚等亚洲热带地区。蝴蝶兰属热 带气生兰,花型奇特,花色艳丽丰富,花序由数量不等的花朵成队排列犹如一列 蝴蝶在空中翩翩起舞,使人百看不厌。蝴蝶兰花期特别长,而且品种繁多,深受 人们的喜爱,素有“兰花皇后”美誉¨41。它是目前兰科植物中栽培最广泛的种类 之一, 同时也是室内绿化美化的新型观赏花卉,国内外对其需求量越来越大。长

期以来,人们尝试了各种方法快速繁殖蝴蝶兰,以满足日益增长的市场需求。蝴 蝶兰是单茎气生兰,植株上极少发育侧枝,比其他种类的兰花更难进行常规无性 繁殖,不可以用传统兰花分株繁殖方式进行快速繁殖。其种子非常细小,无胚乳,

孙莉:蝴蝶兰组织培养快繁技术示范应用

胚发育不完全,在自然条件下很难萌发,常规播种发芽率极低,也难以满足大量 繁殖的需要。利用组织培养技术,才能解决这一问题。 蝴蝶兰组织培养最早的成功报道是RotorG乜1(1949)利用花梗腋芽培养出试管

苗。对于蝴蝶兰的大量的研究始于20世纪60年代以后,国内外学者对蝴蝶兰的组
织培养技术进行了大量研究,研究者利用各种外植体如种子n5“6|、胚n刀n81、叶片n
9J、

根段㈨、根尖口¨、茎尖心2’23’24l、花梗腋芽晗别、花葶节间嘶1、花梗节或节间切段∽’
冽等诱导类原球茎,进而诱导不定芽实现快繁。大量研究表明, 在蝴蝶兰进行组

织培养过程中,选取的外植体不同,类原球茎的诱导率也有很大差异,其中幼叶、 茎尖、花梗腋芽是蝴蝶兰诱导类原球茎的较佳外植体,叶片和根段的诱导效果最 差。但是,采用茎尖作外植体会对植株造成损伤,因此蝴蝶兰的组织培养通常以 幼叶或花梗腋芽为外植体。试验结果表明经过愈伤组织阶段形成类原球茎后再生 成植株的途径有较高的变异率,为了进一步减少变异,自上世纪80年代以来,不 通过原球茎途径直接诱导“丛生芽”繁殖蝴蝶兰的研究成果始见报道晒1,这一方 法为快速繁殖优质蝴蝶兰种苗开创了新的途径。 1.5.1诱导类原球茎方法快繁蝴蝶兰的研究 1.5.1.1诱导类原球茎的外植体及原球茎的研究进展 蝴蝶兰可利用茎尖、茎段、叶片、根尖、根段、花梗等来诱导类原球茎。田 中道男协1等(1975)报道,用蝴蝶兰白花杂交种的试管内实生苗(120~200天和345~ 550的实生幼苗)和成年植株的叶片都做了培养,但诱导率很低。将整张叶片切下 直接插入培养基中,效果比将叶切断好。取第一真叶作为外植体诱导,其类原球 茎形成率比较老叶好。幼叶中间部分类原球茎形成比顶部和基部好。成年植株用 叶基部诱导类原球茎时形成率较好。叶切段大小与诱导率直接相关,切段太小, 存活率低,以5mm左右为最好。叶片诱导类原球茎诱导系数低,据王怀宇∞3(1989) 报道,143个叶片外植体中只有9个外植体出现类原球茎,总诱导率为6.3%。 兰花一个果荚内存在数以万计的种子,但种子的胚发育不完全,没有胚乳, 在自然条件下很难萌发,必须和菌共生才能诱导萌发。随着组织培养研究的不断

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深入,人们发现大部分兰花种子可以通过无菌萌发的方式进行,蝴蝶兰种子也可 以用该方法实现。潘学峰唧1(1997)等多人应用利用蝴蝶兰杂交结成的果荚进行 无菌播种均有获得成功的报道。该方法简单,短期内可获得大量试管苗,但是杂 交后代性状分离,和母本性状差异很大,生产上很难形成统一标准的商品苗。 1.5.1.2基本培养基和植物生长调节剂的研究 蝴蝶兰组织培养采用的基本培养基有MS、1/2MS、VW、B5、KC、Kyoto、花宝 及其改良型等瑚1。在类原球茎的诱导过程中,不同品种的蝴蝶兰和外植体对最适 培养基的选择有所不同,且适当减少培养基中大量元素和部分微量元素有利于类 原球茎的增殖。因此,根据品种和不同的生长阶段选择不同的培养基,诱导阶段 用MS、花宝等,在壮苗生根阶段用1/2MS或者改良型的等。 植物生长调节物质对愈伤组织诱导和器官分化及植株再生具有重要的作用, 常常是培养基中不可缺少的关键物质。生长素的主要作用是诱导愈伤组织的产生、 促进细胞脱分化、促进细胞的伸长生长、诱导受伤的组织表面形成愈伤组织、促 进生根。细胞分裂素的主要作用是促进细胞分裂和茎增粗而抑制茎伸长,诱导芽 的分化,促进侧芽萌发生长,抑制衰老,细胞分裂素能减少叶绿素的分解,延缓 离体组织或器官的衰老过程。但是细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。组培 中决定愈伤组织生根还是生芽的关键取决于细胞分裂素与生长素之间的比率。通 常当配制的培养基中生长素/细胞分裂素的比例高时则有利于生根,生长素/细 胞分裂素的比例低时则有利于生芽。若两者浓度相当时,既不利于生根、也不利

于生芽,而是愈伤组织的产生占优势‘311。目前在蝴蝶兰上常用的生长素有I从、
IBA、Nab,常用的细胞分裂素类的是6一BA、KT等。不同品种的蝴蝶兰在不同的生 长阶段所需的外源植物生长调节剂的浓度是不同的,但继代增殖和壮苗生根所用 激素浓度和组合大致相同的,可以不更换培养基‘301。 1.5.2用花梗离体培养诱导丛生芽途径快速繁殖蝴蝶兰 1.5.2.1诱导丛生芽的目的意义 利用原球茎途径繁殖蝴蝶兰已取得较为广泛的应用,但经研究证明,经过了

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愈伤组织阶段后形成的植株有较高的变异率,苗生长势弱,这将直接影响组培苗 工厂化生产。为了减少变异,寻求一种更为便捷的途径,王怀宇、刘荣维‘321,等 人提出了不经过愈伤组织阶段而直接利用花梗苗的茎尖诱导“丛生芽”来实现蝴 蝶兰的快速繁殖,从而达到避开脱分化而达到减少变异的目的,并取了成功。丛 生芽途径的外植体通常是取花梗腋芽,通过适宜的光照、温度条件以及适宜的培 养基使花梗腋芽萌发。这个过程是芽增芽的过程,整个过程未通过脱分化过程形 成愈伤组织,对减少变异,保持母株持征特性是有利的;该方法可以在植株开花 后进行,这对于从外面引进的新品种,特别是对于从外地新引进的新品种,可以 待其开花后确认其有推广价值后再进行大量繁殖,避免对品种不知情的情况下盲 目生产的情况。 1.5.2.2培养基及植物生长调节剂的选择 在蝴蝶兰花梗离体诱导营养芽及营养芽诱导产生丛生芽的过程中,MS培养基 用的最为普遍,其他的如花宝培养基也用;生根壮苗阶段通常用1/2MS基本培养基。 植物生长调节剂也是用生长素类的和细胞分裂素类的,和诱导类原球茎所用的培 养基组合基本一样,浓度有差异。 1.5.3蝴蝶兰培养过程中的褐化问题 蝴蝶兰外植体在组织培养过程中容易褐变死亡,褐化问题是影响其成活率的 关键因素。褐化是由于植物组织中含有的多酚氧化酶(PPO)呦1,它是一种双功能酶 负责黑色素的形成天然色素大分子,作用于酚类物质形成醌而引起的。培养基的 pH值、矿质元素含量以及培养期间的光照、温度等都能影响植物组织的PPO活性, 从而对植物组织的褐变产生重要影响。印芳等n¨研究了蝴蝶兰外植体初代培养过 程中不同浓度Fe、K、Ca、Zn、Cu等矿质元素对其褐变的影响,结果表明,培养 基中Fe、Cu浓度越高,褐变情况越严重;培养基中K、Ca、zn浓度越高,褐化越 轻。赵伶俐等‘35’眠37’研究表明,对外植体进行前期避光培养可减缓植物组织中酚 类物质的合成,从而抑制褐变的发生,且不同光照强度对褐化的影响不同,其中 10001ux和30001ux光照培养可降低褐化率;培养前的黑暗预处理能减轻外植体的

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14

__一

褐变,

其中以黑暗预处理lOd的褐化程度最轻;此外,当培养基pH值为6.5或培

养温度为20"C时外植体的褐化率最低。有关研究表明,活性炭对蝴蝶兰类原球茎 和幼苗的生长均具有积极作用, 在每升基本培养基中添加活性炭1~2 g,适时切

除培养物的褐化部分并及时更换新鲜培养基,能有效抑制外植体的褐变死亡D31。 在培养物加入柠檬酸0.05%~0.5%或Vc等能起到一定作用。8月份高温季节采芽排 出的褐变物质多,成活率也最低。 1.5.4不同外界条件对蝴蝶兰的影响 不管是通过类原球茎途径还是通过丛生芽途径,蔗糖作为培养基的能源物质 和渗透调节剂,不同浓度对组培有不同的作用,有试验表明,2%的蔗糖浓度有利 于原球茎的最好生长,2%~3%蔗糖有促进芽的形成,5%的蔗糖有利于根的分化和 生长;花药培养和胚培养则采用3%"-15%的高浓度汹1。培养基的PH值,直接影响 到培养物对离子的吸收,所以过酸或过碱都对植物材料生长有很大影响, PH值还

会影响琼脂固体培养基的凝固,PH值过低,琼脂不凝固。从试验资料来看,类原 球茎在pH5.0--一5.4的环境中生长最好;丛生芽的诱导与增殖在PH5.6~5.8的环境 中较好咖1。 在蝴蝶兰诱导及增殖生根的各个阶段,常会加入有机附加物,如椰子汁、香 蕉汁和土豆汁等是一类含有氨基酸、激素和酶等成分较为复杂的天然复合物‘391。 大量研究证明,它们对细胞和组织的增殖及分化有明显的促进作用。试验证明,在 培养基中添加适量蛋白胨、椰子汁、香蕉汁、番茄汁、苹果汁等天然提取物对类 原球茎增殖也有明显的促进效果。陈勇等“们研究表明, 马铃薯汁和香蕉汁的培养基与对照相比, 以白色花系蝴蝶兰的类原球茎为材料, 球茎幼苗分化的影响, 结果表明, 附加椰子汁、苹果汁、

类原球茎增殖率明显提高。王献等‘4嵋 研究了椰子汁、马铃薯汁和香蕉汁对类原 其

3种添加物均可提高类原球茎的增殖率,

中椰子汁和马铃薯汁的效果优于香蕉汁。 用花梗腋芽诱导蝴蝶兰丛生芽过程中,所取的花梗芽在培养过程中有两种发 育方向,一种方向是发育成营养芽,另~种方向是发育成花芽。田中道南‘:q(1975)

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对此做过认真研究,较低温度20。C会使大部分花梗芽发育成花芽,即发育成小花 梗,在较高温度28"C下培养,花梗芽发育为营养芽,因此在蝴蝶兰花梗离体诱导 时温度控制很重要。 蝴蝶兰在组织培养中,通常都以45w日光灯作为光源,因此可以人为地进行控 制光照强弱。试验表明,光照强度对试管苗发根和生长势均有明显的影响。据刘 荣维‘321报道,尽管蝴蝶兰属于阴生植物,光照强度对试管苗的生根和长势仍有明 显的影响。在试验范围内光照3000hx对蝴蝶兰根的诱导和植株的生长有利,光照
?

促进植株壮苗生根。陈之林“钉,王怀宇汹1等人报道,光照强度在1500--一20001ux 也取得了较好的效果。 1.5.5试管苗的驯化移栽 传统花卉栽培都依赖于土壤,土壤是植物赖以生存的物质基础。但由于蝴蝶 兰根系对环境的特殊要求,土壤栽培存在明显的局限性,如黏重、通透性差、积 水、酸碱度多大、带菌易造成病害流行。随着科学的发展,人们采用一些类似土 壤的化学物质,创造植物生长的理想环境,这种化学物质就是栽培基质,这种栽 培方法叫做无土栽培“31。无土栽培的基质是土壤的替代品,不完全具备土壤的优 点,它需要根据栽培植物的需求进行选配。 蝴蝶兰属热带气生兰,有发达的气生根,栽培上要求根部通气良好,因此需 选用安全卫生、轻便耐用和经济实用的栽培基质。现在蝴蝶兰无土栽培中常用基 质有椰块与椰糠、水苔、冷杉皮、蛇木等‘441。 (1)椰块与椰糠椰块和椰糠在海南材料丰富是食用椰汁或加:【椰干后的废 弃椰壳经简单加工而成。主要成分为纤维素和木质素,这些纤维纵横交错层叠在 一起,具有一定的保水和保肥性能,不积水,不易腐烂。它和蝴蝶兰根系有较好 的亲和性,但其保水力很强。椰壳加工一般选择椰块和椰糠,一般用3~5厘米的 椰块栽培附生形态的蝴蝶兰。椰糠多数情况下作混合基质的组分,用于小苗栽培 基质。 (2)水苔水苔是生长于热带、亚热带或者温带地区林地的一种低等植物。

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16

一般长条状,具有一定的吸水能力,同时透气透水,不含对植物生长不利的有害 成分。水苔在国外无土栽培中一直被作为优质的培养基质,多用于种植一些根系 好气性强,喜好湿润环境的植物。水苔用作基质易创造与根系原生长条件更为接 近的环境。 (3)冷杉皮冷杉皮是由冷杉木经切碎、脱脂、去盐等加工过程生产出的细 块木屑。冷杉皮对根系的亲和力强,表现为生长快,根系发达,直接使用或者与 其他基质混合使用效果均不错。美国、日本、韩国使用比较广泛。 (4)珍珠岩珍珠岩是由硅质火山岩形成的矿物质,因具有珍珠状球形裂纹而 得名。硅质火山岩含水量为2%----5%,当粉碎加热至1000℃时,即膨胀形成无土栽 培用的珍珠岩。珍珠岩透气性好,但含水量适中,并能保持适当的通透性。珍珠 岩化学性质稳定,但是对养分吸附能力极小,珍珠岩质地轻,浇水多时会浮在水 上,和根系接触不牢固,易倒伏伤根。并且珍珠岩在浇营养液后易生长绿藻。 蝴蝶兰有气生根,栽培基质对植株的生长影响很大,尤其是幼苗阶段。筛选 试验表明n51:树皮,它虽有一定的肥分,透气性较好,但保湿性能差,且容易腐 烂滋生杂菌,危害蝴蝶兰苗生长;椰块椰糠崮定性差;珍珠岩保水保肥力差,易 倒伏伤根;水苔作为基质,保水力强,透气性能好,小苗不易腐烂,栽培在水苔 中的兰株根系发达,根长而粗且多,植株生长健壮, 叶大而宽, 色泽亮绿。分

析这是由于水苔通气,保湿性能好,适宜气生根生长所致。植株长大以后,可以 在水苔中加入少量瓦粒、松树皮,以增强基质的同定。蝴蝶兰栽培基质材料选择 还是以水苔为主,不仅资源丰富,成本低,又能营造保湿透气的生长小环境,对 蝴蝶兰生长十分有利。 1.5.6总结 快速繁殖蝴蝶兰的方法主要有类原球茎途径和丛生芽途径。类原球茎途径长

期以来是人们研究的重点,成果丰富,但它主要存在两点不足:(1)繁殖系数低或
易使母株丧失;(2)遗传不稳定,后代易发生变异。前者可以通过采取不同的外植 体得以解决,但后者在诱导类原球茎过程中一直未得到解决。丛生芽途径就是针

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对类原球茎途径的变异问题提出的新方法,已有试验证明它能从根本上降低变异 率。此途径已有成功报道,是一个极富前景的快繁蝴蝶兰的新途径侧。

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18 ●_一

第二部分研究报告
生物技术被誉为21世纪的主导农业技术,已率先在花卉业的生产和科研中得 到印证。然而在拥有地理、气候、资源、人力和技术储备优势的中国,生物技术 应用于花卉的产业化程度却不高。其主要原因并不在于我们从事花卉生物技术研 究的人数少、水平低,而是长期以来,对生物技术的产业化转化认识不够。以组 织培养为例,科研主管部门的科研经费大多投在愈伤组织或胚状体的形成、器官 分化或试管苗再生的前期实验室基础研究上,而对中试和进一步产业化的投入则 远远不足。相反,国外发达国家在研究、开发推广和生产试验上的经费投放之比 是1:10:100。由于我国中后期环节试验经费不足,导致很多有希望的成果仅停 滞在小型试验阶段,而不能转化为生产力。其次,企业和广大农户没有成为技术 进步和成果转化的主体,往往急功近利,不敢冒风险,宁可对花卉苗木粗放经营, 也不敢投资风险大、回报率高的生物技术产业,这就导致了我们在国际竞争中的 被动。 另一方面,国内外对高档花卉的需求高速增长,尤其是高档花卉的品种、品 质以及数量都不能与迅速增长的市场需求相适应。如有“花卉王国"之称的荷兰 每年还要进口大量的名贵花卉,以蝴蝶兰成品花为例,其国内外生产企业仅能供 给市场的60%,尚有40%的空缺,而蝴蝶兰种苗国际市场需求量远大于成品花。可 以说,名贵花卉,尤其是优良品系的高档花卉销售前景相当广阔。 为响应国家农村产业结构调整和行业发展规划,创新、消化高档花卉育种和 快繁的新技术,开发科研成果转化为适合规模生产所需的关键技术,实现高档花 卉生产工艺规范化、产品质量标准化、工艺装置智能化,实现技术一流、环境一 流、成果一流的战略目标。在高档花卉生物技术研究和高档花卉产业化的发展上, 代表地方水平,为本市花卉生产提供主导技术和示范产品,提高和树立高档花卉 品牌,本站建立了苏州地区唯一的自主投入、自主研发的组培中心,历时4年, 比较系统地研究了蝴蝶兰等高档花卉的组培快繁技术和设施栽培技术等先进实用 的现代农业技术,并开创了边研究、边中试、边应用推广的新机制。

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蝴蝶兰属兰科蝴蝶兰属植物,它最先由德国兰花分类家Blume氏于1825年命

名,他根据植物采集家Rumph氏在1750年采自印度尼西亚安汶岛的一株蝴蝶兰标 本,发现其花在形态结构上均与众不同,具有蛾蝶般的美丽而定名。蝴蝶兰素有 “兰花皇后”的美誉,是当今国际花坛上最富有时代气息的新颖名花和全球晟具
商品价值的兰花之一。


1蝴蝶兰规模化组培快繁技术研究
蝴蝶兰组培快繁技术主要采用下述两种途径:(1)无菌播种技术蝴蝶兰种子

由于非常细小,胚发育不完全,没有胚乳,在自然条件下很难萌发““,必需和真 菌共生才能萌发。在实验室可以分离苗和之共生萌发,但这种菌分离方法复杂,
取而代之的是非共生萌发法,即无菌播种。(2)利用花梗为外植体离体培养建立

无菌体系,诱导丛生芽,利用丛生芽实现植株的分化和再生。蝴蝶兰通过杂交选 育出受欢迎的新品种。花梗离体培养具有很高的重复性,可以在实验室内多次重 复实验,培养出大量植株,用这种方法培养出的植株,稳定遗传,是应用最广泛 的培养方法。这种方法可以有效地保持植株的性状,对优良品系的推广具有重要
意义,两种方法繁殖发法密不可分的。


1.1蝴蝶兰无菌播种 1.1.1试验材料



蝴蝶兰试验材料由张家港市港美园艺有限公司提供,无菌播种选取三种花色
的为材料,标记分别为H(粉花系,见图1)、w(白花系,见图2)、TW(条纹系, 见图3),设定三种杂交组合:(1)H


测园誓
圈l 圈2 圈3

w、(2)H×TW、(3)w×TW。

2006年4fJ底,杂交授粉,lO天后花冠逐渐枯萎,子房运渐膨大,约120天果 荚成熟。

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1.1 1


2试验方法 2.1无菌播种

取成熟的尚未开裂的成熟果荚用自来水冲洗lOmin,在超净工作台放置在预先 消毒好的玻璃瓶内,用75%的酒精浸泡30秒,取出用0.1%的HgCl。消毒10分钟, 用力振荡,再用无菌水反复冲洗6~8次,用酒精灯烘干果荚表面残留水分(注意

蒴果在火焰上来回移动,防止局部温度过高),然后将果荚放置在已经准备好的无
菌铝板上,纵切一分为二,用镊子夹住果荚将种子均匀地播在培养基上,培养室

温度为25*(2,先暗培养半个月蛳…”,半个月后光照12小时/天,光强1500Lux,
培养基为:花宝1号+6
BA(0 i、0

3、0.5)mg/1+0.05mg/INAA+IO%香蕉汁+89/1

琼脂+蔗糖30.Og/1,pH值为5.4:Ms培养基对照。
2.1.1.2.2原球茎的发生与增殖

种子在培养基中培养2周后开始膨大(胚吸水膨胀撑破种皮形成淡黄色胚),
逐渐由淡黄色逐渐转绿,见图4,胚上部有尖状突起,下部有白色吸收毛出现。播 种1个月后形成原球苇,播种2个月后.原球摹分化形成叶片(见图5、图6)。

网 蜀
一.■ ■
圈4
2.1

强5

图6

1.2.3成苗培养

将分化出叶片的原球茎转接到成苗培养基上,3个月后长出3~4张叶片,长出 根,生根率达95%。生根壮苗培养基为Kyoto营养基+i Og/1蛋白胨+10%香蕉汁
+7 2.1 2.1

59/l琼n旨+20 Og/1蔗糖+l_Og/1活性炭,pH值为5.6:对照为Ms培养基。


3结果与分析

1.3.1基本培养基对蝴蝶兰种子萌发的影响

试验中用Ms、花宝两种基本培养基作比较,结果表明.在其他物质相同的条

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件下,种子在花宝培养基中的萌发率L[:MS的高(因种子为粉末状,非常细小,无法 精确统计萌发率)。这可能与花宝培养基中含有丰富的营养成分和各种营养成分的 比例适当有关。 2.1.1.3.2激素对蝴蝶兰种子萌发的影响 在花宝培养基中分别加入不同浓度的6一BA(O.Img/l,0.3mg/l、0.5mg/1),结 果表明,3种6-BA浓度水平下的萌发率都在78%以上,尤以6一队0.3mg/1培养基中 萌发率最高,达95%,见表1。
表1不同浓度6—BA对蝴蝶兰种子萌发影响
Table l The Effects of

Different

6-BA Contenton Seed Germinat

of Phalaenopsis

2.1.1.3.3不同培养基对幼苗生根的影响

原球茎培养形成的小苗转到生根培养基中培养,试验用Kyoto培养基和MS培养
基做比较,结果见表2,以Kyoto培养基较好。在Kyoto培养基中,培养4周后生根 率为90%,6周后为95.65%,且根粗壮肥大。 表2不同培养基对蝴蝶兰苗生根的影响
Table 2
The Effects of Different Media
on

the

Rooting of Phalaenopsis

培养4周
调查

培养6周
调查

生根 生根率 株数
(%)

生根 生根率 株数
(%)

培养基 株数 (株)

株数 (株)

(株)

(株)

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22
●●一

2.1.1.3.4在培养基中添加香蕉汁对蝴蝶兰壮苗的影响 在Kyoto培养基中进行了两组试验(第l组不加香蕉汁,第2组加香蕉汁10%), 培养40天后观察结果如表3,在Kyoto培养基中加入10%香蕉汁表现为生根多、叶片 宽大,证明香蕉汁促进蝴蝶兰壮苗培养。 表3香蕉汁对蝴蝶兰生根的影响
Table 3 The Effects of Banana Juice Oil the Growth of Phalaenopsis

平均每株 处理 生根数(条)

平均叶长
(cm)

平均叶宽
(锄)

平均 宽长比

2.1.2花梗离体快繁 2.1.2.1材料 选取花苞尚未形成但花梗已经完全抽出的花梗,从植株上剪下来,用75%酒精 顺着花梗生长的方向擦拭,然后剥去花梗节段外面的苞叶,将花梗离芽眼上下3 cIIl左右切成段,放入预先灭菌好的广口瓶中消毒,消毒方法同上。最后取出用无 菌水冲洗数次后置于灭菌的铝板上,在距芽眼两端约2锄处,用刀切断,将花梗 节段插入预先准备好的培养基中。 2.1.2.2试验方法 2.1.2.2.1花梗芽的诱导¨钉培养基配方为:MS+6-BAl.5 mg/l+NAhl.0 mg/l+琼脂 7.59/l+蔗糖25.09/1,PH=5.6。培养基做成斜面,每瓶斜插j节段,培养温度为 25"C,光照强度15001ux,光照时间12小时/天,40天以后切取萌发芽。 2.1.2.2.2花梗芽诱导丛生芽“81将花梗上萌发的芽切下,切去叶片2/3,留茎尖, 在茎尖基部刻下微伤口,然后接种到蝴蝶兰丛生芽诱导培养基上。培养基配方: MS+6~BA(0.5,1.0,1.5,2.0)mg/I+NAA(0,0.5,1.0)mg/1+琼脂7.59/l+ 蔗糖25.09/1,PH=5.6。培养温度25℃,光照强度1500lux,光照时间12小时/ 天,2个月后统计单芽增殖率。

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2.1.2.2.3花梗苗叶片诱导类原球茎””
(1)类原球茎的诱导切取花梗苗的叶片,横切,宽度1 an左右。按极性放置在

培养基上,培养温度25。C,环境湿度60%~80%,光照强度15001ux,光照时间12
小时/天,培养基配方为:MS+6 BA(O,1
0,2 0,3

0)mg/I+NAA(0,0 5,1.o)

mg/1+琼脂7.59/l+蔗糖25.09/1,PH-5.6。褐变比较严重,每周继代一次””,7 周后统计诱导率。 (2)类原球茎的增殖和分化诱导出的类原球茎切分继代增殖培养,切口朝下放 置在3种培养基中:MS、1/2MS、花宝培养基。培养基中添加10%香蕉汁、蛋白胨


09/]、NAA0.5咤/l、6-BA7.5 mg/1,琼脂7.59/1,培养温度25℃,接种密度为

10粒/瓶,先暗培养3天后光照强度10001ux,光照时间12小时/天,两个月后统

计类原球体的出芽率。不定芽生根壮苗培养基用1]2MS+NAA0 5mg/1+香蕉10%+
蔗糖20 0鲥+琼脂7.5们,ph=5.6。



2.3结果分析 (1)蝴蝶兰腋芽有两种发育的可能,一是发育为花芽,一是发育为营养芽。

根据田中道男(1975)研究,28"C时几乎全长成营养芽,20"C时则多数产生花芽。 花梗培养两周,花梗芽眼开始萌动。结果约40天后,一部分花梗芽分化长成了花 梗苗,即营养芽(见图7);一部分花梗芽直接长出含有数个腋芽的花梗芽。前者长 出的花梗苗,将其切下处理后,可直接接种在丛生芽诱导的培养基上;后者将其 节芽同样方法分段,可重复用作新花梗芽诱导花梗苗,花梗芽诱导后同种方法接
种在丛生芽诱导培养基上。

圈7

图8

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(2)激素的浓度及激素组合对花梗苗诱导丛生芽的影响

花梗苗植入丛生芽

诱导培养基后,1个月后,基部开始膨大并且分化出小芽(见图8),两个月后, 幼芽长大可以将其切离,继续增殖,从而获得大量的无菌材料。花梗苗及其切离 幼芽的繁殖系数受6.BA和NAA的浓度及其组合影响,如表4所示。低浓度的6-BA 及低比例的6-BA/NAA都没有诱导出丛生;,当6-BA浓度很高时,外植体非常脆 弱,并且极度矮化,几乎无丛生芽产生1481。适量NAA的加入,6-BA在i.0
2.O mg/1

mg/l范围内,却有较好的效果,尤其以6-BAl.5

mg/I+NAA0.5

mg/1组合效果最佳。

表4不同激素对蝴蝶兰花梗苗繁殖系数的影响
Table 4 The Effort ofIncretionon
On

Propagate Rate ofPhalaenopsis Footstalk

(3)植物激素对叶片诱导类原球茎的影响无菌苗叶片接入诱导培养基4天后可 观察到叶片伤口处出现一些黑褐色的酚类化合物,为减轻褐变影响,采取每周继

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代一次的方法。从实验我们可以观察到,5周后,可以陆续地观察到一部分叶片上 表面和下表面、切口处有细小颗粒突起,最先出现颗粒突起的是带基部的的伤口 处。7周后我们观察到在无6-BA的培养基中无类原球体产生,随着6-BA浓度的 升高,配合一定浓度NAA(0.5,1.O),均不同程度地诱导出类原球体,尤其在6-BA3.0
mg/I+NAA0.5

mg/1的培养基上,绝大多数都可诱导出类原球茎。 由于增殖时的切割损伤,培养基

(4)基本培养基对类原球茎增殖和分化的影响

中盐离子对切割以后的成活率有重要影响t341,从而进一步影响增殖和分化。在实 验的三种培养基中,在花宝培养基中类原球茎的成活率最高,达到85.0%,其次是 1/2MS和MS,分别是68.0%和63.O%。培养基对类原球体增殖情况的影响见表5。
表5 基本培养基对类原球茎增殖和分化的影响
on

Table 5 The Test of Significance

Frequency of PLB in Phalaenopsis

2.1.2.4讨论 (1)蝴蝶兰在培养初期采用一段时间的暗培养,其目的都是为了减少植株的褐 变㈨。植株细胞内含有丰富的酚类物质,当组织被切割和接种时,损伤切面细胞 中酚类物质被氧化成醌,切面迅速变成棕褐色或暗褐色,这些褐色物质回逐渐扩 散到培养基中,抑制其他酶的活性,毒害外植体。光照可以促进酚类物质的氧化, 因此低光照或暗培养一段时间能减轻褐变。减轻褐变的方法很多,还可以通过添 加防褐剂,在以后的实验中我们会进~步研究。 (2)蝴蝶兰在培养过程中要进行不断的继代培养,其原因一方面是培养基中的 营养成分是有限的,不能满足植株长期生长的需要,不断继代,可以不断增养分

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以满足生长的需要,另一方面是植株在生长过程中会分泌一些有毒气体物质积累 在培养器皿中影响植株的生长,不断继代可以缓解这方面的问题。 (3)在生产中可采用砂糖代替蔗糖[2li p降低生产实验成本。在实验过程中,进 行了不同糖的比较实验,实验结果表明砂糖在培养过程中对植株生长影响表现为 不显著,和曾宋君啪棚1结果相近,可能是砂糖中含有多种矿物元素对植株生长有 益。因此在以后的生产实验中用砂糖代替蔗糖,这对生产的可行性创造了更为优 越的条件。 (4)不同品种的植株的最适的培养基有差异。在实验中我们发现,不同品种间 对培养基的要求有差异,在以后的试验中,将根据不同品种实验择优筛选出最佳 的激素组合,达到最好的快繁效果。

2.2蝴蝶兰标准化设施栽培技术示范应用
2.2.1适宜生长的生态环境 2.2.1.1喜温暖而畏酷暑和严寒 蝴蝶兰喜欢温暖的环境,而且对寒冷十分敏感。它生长的适温是白天22"--" 28"C,晚上18.-.一25"C,高于35"C停止生长,进入半休眠状态,影响花芽分化。高 于38℃则导致高温病,植株萎蔫、叶面生理性脱水,且极易受细菌、病毒的侵染。 蝴蝶兰越冬时要求温度不低于IO'C,否则容易产生冻害‘5¨。 2.2.1.2喜潮润而畏滞水和湿腻 蝴蝶兰的根为典型的气生根,故要求栽培的基质通气排水性好,保水保肥能 力强,生产中一般采用水苔做无土栽培的基质。盆内要忌滞水,僵质的水苔要及 时更换。浇水时要严格掌控,严禁叶心滞水过夜。 2.2.1.3喜空气清新而畏尘烟和闭塞 蝴蝶兰要求栽培的温室空气清新,无烟熏,无飘尘等污染,保证良好的通风 条件。 2.2.1.4喜淡肥而畏浊腻 蝴蝶兰虽有菌根,可以从空气中吸收氮,但合理的施肥对兰苗的生长同样也

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十分重要。适当施肥可使植株更加健壮,生长更迅速,花色也更鲜艳。施肥应以 “薄肥多施,薄肥勤施”为原则,生长期多施,开花期、高温期内少施或者不施 肥。忌浓肥,因为浓肥易使植株产生肥害,并导致基质的提早酸化,危害苗根。 2.2.2高效栽培设施的控制 江苏地区自然气候条件下适宜栽培蝴蝶兰的月份不多,只有4月下旬到6月 上旬和10月,其余月份不适宜。因此具备一套完整、合理、高效的栽培设备显得 极为重要。 2.2.2.1温度的调节 温度调节通过遮阳网开启与关闭来增加或降低阳光补给调节温度的高低。夏季 用内外两层遮阳网,其余季节用外遮阳即可。夏季温度超过30"C低于35"C时通过 打开排风扇,增加空气对流达到降温通风目的。当温室内温度超过35"C时即要开 启水帘降温设备,并配合地面喷水降温。冬季应保证温室的密封,安装内保温,

缩d')Jn温面积,通过蒸汽管道通蒸汽加温或者柴油机加温。
2.2.2.2光照的调节 主要通过遮阳网的开启与关闭来调控。在炼苗阶段和小苗阶段,光强要求不 高,遮阳网遮阴40--一50%1521,在催花和开花时间,内遮阳网关闭增强光照。光照太 强,叶片易发黄,影响蝴蝶兰的正常生长。采用活动双层遮阳网就能调节光照如叫。 2.2.2.3湿度的控制 主要通过加湿设备弥雾、地面喷水增湿;通过排风扇通风来实现降湿[531。 2.2.3种植前的准备 2.2.3.1基质 目前商业化规模生产主要采用固体基质的无土栽培。栽培基质必须质轻、疏 松、保水力良好。一般蝴蝶兰选择保水保肥透气较好的水苔为栽培基质1541水苔 分为国产和进口两种。国产水苔碎、细、杂质多,价格便宜。进口水苔粗而长, 杂质很少。国产水苔使用后容易烂根,进口水苔不易发生。基质使用前用1%的多 菌灵浸泡杀死基质中的病原菌,浸透后用脱水机甩干至用手拧刚好有水出来正好,

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水苔过干不利于缓苗,水分过多容易烂根。 2.2.3.2温室和用具消毒 种植前半个月,用漂白液对温室或塑料大棚进行喷洒消毒;用0.3%高锰酸钾 溶液对穴盘、营养钵、水桶、手铲等用具浸泡消毒。 2.2.4蝴蝶兰周期栽培流程 2.2.4.1炼苗 一般三四月份是炼苗移栽的最佳时机,将蝴蝶兰试管苗从培养室转移到温室 炼苗驯化。由于未出瓶幼苗在培养室一直生长在相对恒定的最适环境条件下,在 瓶中生根苗与盆栽苗相比相当脆弱,自身获取养分的能力差,抗病能力低。因此, 在出瓶移植前要进行适当的炼苗,逐渐让瓶中生根苗适应外界变化的环境。炼苗 的方法是将瓶苗在温室床架上生长半个月,使其适应温室光照温度条件。半个月

后打开瓶塞,用镊子小心将苗取出,洗净根部培养基(rg量不要让小苗产生机械
损伤)。用杀菌剂(如多菌灵、百菌清1500倍液)浸泡1分钟,捞出小苗沥干待 种植。 2.2.4.2移栽 将浸透水的水苔用手把多余的水挤干(手握紧水苔正好无水滴产生),左手握 住苗基部最顶端,使其苗根呈自然放射状向外伸展,右手抓取水苔包裹根部,水 苔用量为营养钵体积1.5倍左右,最后幼苗种植于1.5寸透明营养钵中。注意水苔 不要包得太紧,过紧会抑制根系生长,用手捏压软盆以结实有弹性感为度。苗应 定植在营养钵中心,叶心不能包到水苔里面,否则浇完水后易得软腐病。水苔包 裹时不要伤到根尖和根基部,种后水苔应低于盆沿约1.Ocm的横线处,当天出瓶的 瓶苗当天种完。 2.2.4.3幼苗期 出瓶后的幼苗水分管理以偏干为宜,仅保持基质湿润,空气湿度控制在75%--- 90%,适宜温度20~28℃小苗,光照强度5000 Lux。大棚内要保持通风透气。当晴 天气温较高时,应及时使用遮阳网,防止目光灼伤叶片;同时要防止过度遮阴,

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以免发生徒长。此外,还要经常向大棚空间及小苗叶片喷水,以保持稳定湿度, 防止叶片失水皱缩。移栽植后6~7天内不需要浇水;6~7天后当水苔表面较干、 杯底留有少量水珠时浇水。一般应在晴天上午浇水,浇水量以水苔均匀湿润为宜, 切忌大水浇灌。幼苗心叶不要积水过夜,以免烂心。移栽一个月内暂不施肥。 2.2.4.4小苗期 移栽1个月以后,幼苗通过了缓苗期进入了小苗期。温度控制在18~30℃。 一般一周用药一次,不同药品轮换使用,如多菌灵、百菌清、甲基托布津等,多 以预防为主。薄肥勤施,一般使用花多多1号(20—20~20)4000~5000倍叶面肥。 在此期间,光照强度7000~12000 Lux,光照不可过强,否则会造成小苗灼伤。 2.2.4.5中苗期 试管苗移栽5个月后,苗的叶幅达10~15锄,1.5寸营养钵已经不能满足根 系生长需要j需换盆移栽到2.5寸营养钵中,此时进入了中苗生长期,光照要求
12000--15000 Lux。中苗生长期间用药仍然以杀菌剂为主,多种杀菌剂轮换使用。

施肥主要施平均肥,花多多l号(20—20-20)3000倍。 2.2.4.6大苗期 试管苗移栽10一--12个月后,叶幅达到20 cnl以上,需进入第二次换盆,换入 3.5寸的营养钵。此阶段光照要求15000--一20000 Lux,一般施用花多多10号 (30-10—10)2500~3000倍,促其营养生长。催花前改施平均肥,控制营养生长。 在大苗期间,必须注意剪黄叶、去病叶,如不及时处理,可能使病害迅速蔓延而 造成损失。催花期前两个月停止施N肥,控制营养生长。 2.2.4.7催花开花期 在自然状态下,蝴蝶兰有自己特定的花期。但为了满足市场的需要,蝴蝶兰 的花期调控技术已被人们完全掌握,其主要是由人为控制。蝴蝶兰在生长发育过 程中,必须要经过一段时间的低温春化才能转入生殖生长,否则不能开花。温度

是蝴蝶兰花芽形成的主要决定因素。催花条件为:昼夜温差控制8"C~IO。C之间,
夜温最好控制在20。C左右,同时追以适当的催花肥料。苗龄达16个月就可以催花。

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进入9月份,夜间温度逐渐降至20。C以下,花芽便开始分化。气温如果过高,夜 间可采用水帘降温。光照强度保持在25000一300001ux之间,湿度60%-70%,水要 适当控制,适当的偏干,浇水过多不利于花箭的形成。配合P、K含量高的花多多 2号(10-30—20)肥料施用。低温处理一个月后花梗露出,从花梗露出到现蕾需 25天左右,现蕾到开第一朵花需30天,此期间保持夜温18℃-20℃,白天25℃~ 28℃,光照强度25000—300001ux,这样的光照条件下有利于碳水化合物的积累, 而且可以提高花色及鲜艳程度。每周两次叶面肥,结合灌根肥,浓度15000倍, 花蕾现出后换用开花肥花多多15号(9—45—15)。注意浇水施肥时肥水不可溅到 花瓣上,否则影响花的外观品质。 当花梗芽长至35cm左右时,用80am包塑铁线竖直插在花梗旁,隔1"---2节用 专用夹子固定花梗芽较硬部分,使花梗竖直向上生长。待花梗长至50cm左右、第 一朵花开放时,将铁线从第一朵花约4cm处向前弯曲,末端微向下伸展,并用夹 子将花枝固定在铁线上,使花朵有较好的向光性。

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第三部分结论与讨论
1、蝴蝶兰无菌播种试验中基本培养基对蝴蝶兰种子萌发的影响,花宝培养基中种 子萌发率高于MS培养基。6-BA浓度对蝴蝶兰种子萌发的有影响,0.3mg/1的萌发 率最高;在生根培养基中加入香蕉汁生根壮苗效果好最好,可能由于香蕉中含有 氨基酸、激素和酶等有机物且成分较为复杂的天然复合物啪1。多数研究证明,它

们对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用,许多研究人员在天然有机添加
物的选择与应用方面做了大量的工作。由于香蕉的不同品种、不同产地和不同成 熟度对其有效成分的种类尤其是含量方面有较大影响,因此,该结果仅可作为参 考.具体使用时,应做预备实验加以证实.同时,以后的研究中可增设不同产地、 不同品种及不同成熟度之间的对比实验,结果将更加可靠。。 2、蝴蝶兰花梗离体培养中花梗苗的繁殖系数受6-BA和NAA浓度及其组合的影响。 低浓度的6.BA及低比例的6-BA/NAA都没有丛生芽诱导,NAA对丛生芽诱导起 协同作用,当只有6-BA或6-BA浓度极高的情况下,外植体非常脆弱,并且极度 矮化,几乎无丛生芽产生。适量NAA的加入,6.BA在1.0 却有较好的效果,尤其以6-BAl.5
mg/I+NAA0.5 mg/1---2.0

mg/1范围内,

mg/l组合效果最佳。
mg/I+NAA0.5

3、植物激素对叶片诱导类原球茎有影响,在6-BA3 诱导出类原球茎效果最好。

rag/1的培养基上,

4、基本培养基对类原球茎增殖和分化有影响,由于增殖时的切割损伤,培养基中 盐离子种类和浓度对切割以后的成活率有重要影响,从而进一步影响增殖和分化。 在实验的三种培养基中,在花宝培养基中类原球体的成活率最高,达到85%,其 次是1/2MS和MS,分别是68.0%和63.O%。 5、催花条件为昼夜温差8~10℃,同时追加追加P、K肥,光照要求强光照,适 当控水。花梗花芽抽出后及时固定这样有利于造型。

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本论文是在导师韦军教授和吴美南高级农艺师的悉心指导和关怀下完成的。 攻读硕士学位期间,导师倾注了大量的心血和汗水,不仅对论文的选题、设计给予 了详细的指导,还对我的工作、学习、生活等诸多方面予以关心和照顾。正是在导 师科学、严谨的指导下,我的研究课题才能顺利进行,这篇研究论文也才得以顺利

完成。论文成稿以后,又蒙导师在百忙之中仔细审阅和修改,在此谨致谢忱。导师
严谨的科研态度,忘我的科研精神,深邃的知识积淀,谦和的待人处世风格,是够我 一生受用的,会影响我终生,将激励我在今后的人生道路上努力工作、刻苦钻研业 务知识,力求多有作为。 感谢所有关心、支持、帮助过我的良师益友。 最后,衷心感谢几年来默默支持、关心我的家人。 孙莉

2009.10于张家港

作者简介
孙莉,女,生于1980年10月,江苏兴化人,2003年6月毕业于扬州大学农学院 园艺系园艺专业,2006年10月考入扬州大学攻读农业推广硕士学位研究生。2003 年7月到张家港市农业试验站工作,工作期间,先后参加和实施了《蝴蝶兰风梨组 培快繁技术示范应用研究》、《高档盆花产业化开发》、《“菌克菌”植物连作障碍改 良菌剂的研究和开发》等市、县各级农业科技项目,获得张家港市攻关杯奖和科技 进步奖。

蝴蝶兰组织培养快繁技术示范应用
作者: 学位授予单位: 孙莉 扬州大学

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