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表达defensin策略


海湾扇贝抗菌肽(Anti-LPS factor)的重组与表达
背景: Anti-LPS factor 以及从鲎和文昌鱼中获得,在鲎中是通过蛋白纯化方式获得的成熟肽,而文昌鱼中获得的是全长 cDNA 序列,海湾扇 贝的 EST44, EST46 与鲎及文昌鱼的 Anti-LPS factor 有很高的相似性,有 50%的氨基酸完全一致。 在高级结构上,海湾扇贝的抗菌肽也与

Anti-LPS factor 有很高的一致性。例如都有信号肽序列(下图方框部分) ,去除信号肽后紧跟 着的是 20 个氨基酸的跨膜螺旋区域(下图下划线部分) ,然后在成熟肽部分的六个半胱氨酸高度保守。 BS: Bay Scallop; Ap: Amphioxus; HC: Horseshoe Crab; BT: Bos Taurus (Cow); 鲎,文昌鱼,海湾扇贝的 Anti-LPS factor 及牛的 beta-defensin 的氨基酸序列。
>BS MTRPSLVRCYSLFFTALIVMAIICPAWSEEIPKSRKKRAIPIAYVGMAVAPQVFRWLVRAYGAAAVTAAGVTLRRVINRSRSNDNHSCYGNRGWCRSSCRSYEREYRGGNLGVCGSYKCCVT >AP MEKKTAYCLLFLVLLVPYTALGAVLKRAPAKKEKRAVPLAVPLVYWGASVSPAVWNWLLVTFGAAAVAAAAVTVSDNDSHSCANNRGWCRSRCFSHEYIDSWHSDVCGSYDCCRPRY >HC NPLIPAIYIGATVGPSVWAYLVALVGAAAVTAANIRRASSDNHSCAGNRGWCRSKCFRHEYVDTYYSAVCGRYFCCRSR >BT MRLHHLLLTLLFLVLSAGSGFTQGISNPLSCRLNRGICVPIRCPGNLRQIGTCFTPSVKCCRWR

鲎,文昌鱼,海湾扇贝的 Anti-LPS factor 的氨基酸序列的多序列比对

鲎,文昌鱼,海湾扇贝的 Anti-LPS factor 及牛的 beta-defensin 的氨基酸序列的多序列比对。 可以看出Anti-LPS factor与beta-defensin在二硫键的布局上非常的相似。

鲎的Anti-LPS factor与牛的beta-defensin在一级结构上非常的相似。
>BS IPIAYVGMAVAPQVFRWLVRAYGAAAVTAAGVTLRRVINRSRSNDNHSCYGNRGWCRSSCRSYEREYRGGNLGVCGSYKCCVT >HC NPLIPAIYIGATVGPSVWAYLVALVGAAAVTAANIRRASSDNHSCAGNRGWCRSKCFRHEYVDTYYSAVCGRYFCCRSR
BS (1) IPIAYVGMAVAPQVFRWLVRAYGAAAVTAAGVTLRRVINRSRSNDNHSCYGNRGWCRSSCRSYEREYRGGNLGVCGSYKCCVTHC (1) IPAIYIGATVGPSVWAYLVALVGAAAVTAANIRR-------ASSDNHSCAGNRGWCRSKCFRHEYVDT-YYSAVCGRYFCCRSR

主要利用EST44来重组,下列片断为用引物PreDF-F和PreDF-R扩增获得的片段,本来的目的是筛选并区分EST44和EST46但是没有 成功,随机选取三个克隆测序都是EST44,所以以后的工作全都以EST44为基础。下列片段命名为DF11,连接与pMD18-T载体后转化 大肠杆菌XL1-Blue,并于-80℃冰箱保存菌种命名相同。
>DF11

GCTTTGACACGACCAGATCGACAATGACTCGTCCCTCCCTAGTAAGATGTTATTCCCTGTTCTTCACGGCCCTCATTGTAATGGCAATCATATGTCCGGCCTGGTCGGAGGAGATCCCTAAGAGTAGAAAGA AACGTGCCATACCCATTGCTTATGTAGGAATGGCCGTAGCACCACAAGTTTTCAGGTGGCTTGTGAGAGCGTACGGAGCAGCGGCCGTGACTGCAGCTGGAGTGACATTGAGGAGAGTTATCAATAGATCAA GGAGCAACGACAATCATTCATGCTATGGCAACCGCGGATGGTGTCGAAGTTCATGCCGCTCATATGAGAGAGAGTACAGAGGTGGGAACTTGGGCGTTTGTGGAAGTTACAAGTGCTGTGTTACATGATGAA AATATCTAATTTCAACACGACGGA

下图用更清晰一些的方式显示了DF11号的序列,阴影部分标出了成熟肽的起始区域,也就是表达成熟肽的引物设计区域。
1 GCTTTGACACGACCAGATCGACA 24 ATGACTCGTCCCTCCCTAGTAAGATGTTATTCCCTGTTCTTCACGGCCCTCATTGTAATGGCAATCATATGTCCG 1 M T R P S L V R C Y S L F F T A L I V M A I I C P 99 GCCTGGTCGGAGGAGATCCCTAAGAGTAGAAAGAAACGTGCCATACCCATTGCTTATGTAGGAATGGCCGTAGCA 26 A W S E E I P K S R K K R A I P I A Y V G M A V A 174 CCACAAGTTTTCAGGTGGCTTGTGAGAGCGTACGGAGCAGCGGCCGTGACTGCAGCTGGAGTGACATTGAGGAGA 51 P Q V F R W L V R A Y G A A A V T A A G V T L R R 249 GTTATCAATAGATCAAGGAGCAACGACAATCATTCATGCTATGGCAACCGCGGATGGTGTCGAAGTTCATGCCGC 76 V I N R S R S N D N H S C Y G N R G W C R S S C R 324 TCATATGAGAGAGAGTACAGAGGTGGGAACTTGGGCGTTTGTGGAAGTTACAAGTGCTGTGTTACATGATGAAAA 101 S Y E R E Y R G G N L G V C G S Y K C C V T * 399 TATCTAATTTCAACACGACGGA

真核表达系统中表达抗菌肽类物质;
1、正向引物加上SacI酶切位点:GAGCTC ① ACCATGGCCATACCCATTGCTTATGTAGG ……………………正向引物首先要加上Kozak序列(相当于原核生物的RBS位点) ………正向引物还要加上SacI酶切位点,和CTT保护碱基(便于酶切)

② ErDefensinF: CTTGAGCTCACCATGGCCATACCCATTGCTTATGTAGG 2、反向加上EcoRI酶切位点GAATTC ① CAAGTGCTGTGTTACATGA ② TCATGTAACACAGCACTTG ③ ErDefensinR: CGCGAATTCTCATGTAACACAGCACTTG

………反向引物要加上EcoRI酶切位点,和CGC保护碱基(便于酶切)

原核表达系统中表达抗菌肽类物质:
1、正向引物加上BamHI酶切位点GGATCC ① ATACCCATTGCTTATGTAGG ② PrDefensinF: CTTGGATCCATACCCATTGCTTATGTAGG 2、反向引物加上HindIII酶切位点AAGCTT ① CAAGTGCTGTGTTACATGA ② TCATGTAACACAGCACTTG ③ PrDefensinR: CGCAAGCTTTCATGTAACACAGCACTTG ………反向引物要加上HindIII酶切位点,和CGC保护碱基(便于酶切) ………正向引物要加上BamHI酶切位点,和CTT保护碱基(便于酶切)

用上述引物扩增DF11质粒获得在真核和原核中表达的抗菌肽片段: 用PrDefensinR与PrDefensinF扩增获得的片段命名为P5,连接该序列入pMD18-T载体,送华大测序,结果证明正确。P5序列如下:
>p5 CTT GGA TCC ATA CCC ATT GCT TAT GTA GGA ATGGCCGTAGCACCACAAGTTTTCGGGTGGCTTGTGAGAGCGTACGGAGCAGCGGCCGTGACTGCAGCTGGAGTGACATTGAGGAGAGTTATCAATAGATCAAGGAGCAACGACAATCATTCATGCTATGGC AACCGCGGATGGTGTCGAAGTTCATGCCGCTCATATGAGAGAGAGTACAGAGGTGGGAACTTGGGCGTTTGTGGAAGTTACAAGTGCTGTGTTACATGAAAGCTTGCG

用ErDefensinR与ErDefensinF扩增获得的片段命名为E6,连接该序列入pMD18-T载体,送华大测序,结果证明正确。E6序列如下:
>E6 CTTGAGCTCACCATGGCCATACCCATTGCTTATGTAGGAATGGCCGTAGCACCACAAGTTTTCGGGTGGCTTGTGAGAGCGTACGGAGCAGCGGCCGTGACTGCAGCTGGAGTGACATTGAGGAGAGTTATC AATAGATCAAGGAGCAACGACAATCATTCATGCTATGGCAACCGCGGATGGTGTCGAAGTTCATGCCGCTCATATGAGAGAGAGTACAGAGGTGGGAACTTGGGCGTTTGTGGAAGTTACAAGTGCTGTGTT ACATGAGAATTCGCG

包含上述片段的菌种均在-80℃冰箱保存,命名相同。


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