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荧光显微镜












王泽剑

上海交通大学药学院

基本知识

荧光的性质
? ? ? ? ? 保持固有的荧光特性 荧光波长>激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激

发光强度、被检物浓度、 荧光效率

荧光染色分类:
? 自发荧光 ? 二次荧光 ? 抗体荧光技术

自发荧光(不加染色)
有些物质不加染色,也能发出荧光(自发荧 光或原发荧光),但在医学和生物学领域 中,只有很少物质具有自发荧光。

二次荧光(用化学染色)
非荧光性的物质(蛋白质、炭水化合物)用 荧光色素染色,由荧光色素产生荧光(二 次荧光),以便进行观察。对特定物体选 择合适的荧光色素,该物体就能和周围的 组织或细胞区别出来而可以观察到。

荧光的种类
自发荧光:物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光:物质借荧光色素受光激发产生的荧光
染 色

激发光

发射光

不染色

自发荧光

二次荧光

抗体荧光技术(用免疫染色)
利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这 一个事实,有意识地使带荧光标记的抗体 和标本中的抗原进行抗原/抗体反应,这样 两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。

荧光显微镜的种类
透射式 落射式

荧光的特性(1)
? 荧 光 的吸收光谱和发射光谱 大致对 称 于 某轴分布 ,形成镜象关系 ? 荧光发出时不 象普通光那样 会产生热 效 应 ,它是冷 光 。

30----180nm

荧光的吸收及发射光谱

? 荧光发光方向与激 发光的方向无关, 它呈 球体辐 射 。 ? 荧光具有偏振性

一、荧光显微镜原理
? 原理:

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荧光显微镜是利用一个高发光效率的 点光源,经过滤色系统发出一定波长的光 作为激发光、激发标本内的荧光物质发射 出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和 目镜的放大进行观察。

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在强烈的对衬背景下,即使荧光很微 弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结 构和功能以及化学成分等的研究。

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荧光显微镜的光源所起的作用不是直 接照明,而是作为一种激发标本的内荧光 物质的能源。我们之所以能观察标本,不 是由于光源的照明,而是标本内荧光物质 吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。

? 荧光显微镜的基本构造 :
? 由普通光学显微镜加上一些附件(如荧 光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断 滤片等)的基础上组成的。

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特点

? 荧光: 一般采用超高压汞灯(50-200W), 它可发出各种波长的光,但每种荧光物质 都有一个产生最强荧光的激发光波长,所 以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、 蓝色和绿色激发滤片),仅使一定波长的 激发光透过照射到标本上,而将其他光都 吸收掉。

光 源

滤光片
? 激发滤光片:紧靠光源 UV:340-380nm 色玻璃 V:390-460nm 种类: B:460-500nm 干涉滤色片 G:500-570nm ? 截止滤光片:物镜与目镜间

阻断(或压制)滤光片:

? 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧 光和损伤眼睛。 ? 选择并让特异的荧光透过,表现出专一的 荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。

光学系统需完成的功能

荧光显微镜就其光路来分有两种: ? 1. 透射式荧光显微镜 ? 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料 来激发荧光的。常用暗视野集光器,也可 用普通集光器,调节反光镜使激发光转射 和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显 微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点 是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观 察较大的标本材料较好。

透射荧光显微镜
? ? ? ? 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜

透射荧光显微镜原理
目镜

吸收滤色镜

物镜
暗场聚光镜 汞灯

激发滤色镜

透射荧光显微镜的构造

吸收滤色镜 汞灯箱

暗场聚光镜 激发滤色镜

优点: ? 由于用了暗场聚光镜,激发光不能进入物 镜,因此容易形成暗的背景,得到良好的 反差。 ? 由于上述同样的原因,任何物镜都可用于 观察。 ? 用低倍物镜时,比反射荧光显微镜更亮。

缺点: ? 必须正确调整聚光镜中心和高度,否则不 能获得明亮的荧光像。 ? 由于暗视场聚光镜焦距限制,不能使用厚 的载玻片。 ? 视场照明区不能过大,否则容易使荧光标 本荧光色衰褪。 ? 厚的或不透明的标本不适用。

? 2.落射式荧光显微镜:
?
这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上 不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即 用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。 光路中需加上一个双色束分离器,它与光铀呈45 度角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上, 样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片 表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束 分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被 阻断滤片吸收。

组成
? 光源:高压汞灯或卤素灯。 ? 聚光镜:因为物镜作为聚光镜,所以不需 要聚光镜。 ? 物镜:所用的物镜必须能透过足够的紫外 光,而且本身不产生荧光,对数值孔径没 有限制。 ? 标本:厚的标本或不透明的标本都能观察。

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汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜

荧光显微镜 下的丝状细菌

反射荧光显微镜原理

吸收滤色镜





分色镜 物 标 镜 本 激发滤色镜

反射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏(FS) 视场光栏(AS) 紫外线保护罩

分色镜 汞灯

优点: ? 由于物镜兼作聚光镜,不需要很多调节。 ? 物镜数值孔径不受限制,在高放大被率时,也可 以获得高分辨率的像。 ? 厚的或不透明的标本也能观察,厚的盖玻片也能 使用。 ? 其它观察法也能与反射荧光结合使用,特别和相 差法和透射微分干涉差法相结合。 ? 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。

? 缺点: ? 在用低倍率物镜时,像比较暗,因此必须 用大数值孔径的物镜。 ? 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧 光。

? 激发荧光的方式: ? 按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外 线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。 ? UV激发法是用短于400nm的近紫外光进 行激发。该法不存在可见的激发光,所以被观 察的荧光呈现该染料固有的荧光,容易判别标 本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。

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BV激发法是以404nm、434nm为中心 的由紫外至蓝光进行激发。 ? 该方法使用蓝光照射标本,所以荧光 观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻 断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤 光片。

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用于荧光抗体法的荧光色素,对于激 发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波 长比较接近,所以BV激发法使用的滤光片 必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光 作为激发光,所以荧光色素的吸收效率较 高,可得到较明亮的图像。

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其缺点是500nm以下的荧光无法看到, 而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧 光抗体法中,大多以荧光色素特有的颜色 来判断其特异性,所以在讨论微妙的特异 性时,上述BV激发法的缺点往往影响极大。

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荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造 和激发光的波长按以下三点考虑:
①从荧光像的反差要求来看,UV激发 暗场聚光器照明最好。 ②以像的亮度来考虑,BV激发滤光片 暗场观察效率最高。

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③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗 场聚光器照明的特性,可看作介于这两种 照明方法之间,但前者滤光片暗场的性质 较强,显示图像较明亮,反差小;后者因 保留暗场光路的性质,故显示图像较暗, 而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜 时,应采用最适合标本要求的照明法进行 观察。

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需要注意,即使像反差最佳的UV激发 暗场聚光器照明,由标本折射或散射的部 分紫外激发光也会进入物镜,这样在光学 系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激 发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因 此,必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片 作为截止滤光片(萤石或氟石玻璃)。

三、使 用 方 法
? 洁。 ? 2.打开灯源,超高压汞灯要预热几分 钟才能达到最亮点。使用荧光进行观察时, 不要频繁的开关荧光电源。开关间断时间 要保持在20~30分钟以上。 1.使用显微镜时请保持周围环境的清

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3.透射式荧光显微镜需在灯源与聚光 器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的 后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显 微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发 滤片/双色束分离器/阻断滤片的插块。

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4.仪器的所有镜头均经校正,不得擅 自拆开,如有灰尘沾在镜头上可先用吹风 球将灰尘吹去,再用毛笔拂除。 ? 5.载物台在不使用时不应放置过重 的物体,以防止升降机构损坏。

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6.用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微 镜的调节装置,调整光源中心,使其位于整个照 明光斑的中央。 ? 7.放置标本片,调焦后即可观察。 使用中 应注意:未装滤光片不要用眼直接观察,以免引 起眼的损伤;用油镜观察标本时,必须用无荧光 的特殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开, 需经5分钟后才能再启动,否则会不稳定,影响汞 灯寿命。

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8.显微镜使用过后,应立即切断电 源。并保持载物台的清洁。如使用100X油 镜,请在使用后,用清洁液清洗。 ? 清洁液配比,乙醚:酒精=7:3

? 观察荧光: ? 在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光 滤光片,可见经0.01%的丫啶橙荧光染料染 色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两 种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)

细胞器染色

激光共聚焦染色

四、注意事项
? 1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进 行操作,不要随意改变程序。
2.应在暗室中进行检查,进人暗室后接通 高压稳压器电源,开启3~5min后再开启激发高压 汞灯,当看到高压汞灯完全亮后,停止激发,再 开始观察标本。 3.防止紫外线对眼睛的损害,做实验前将 防护屏放下。

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4.检查时间每次以1h为宜,超过90min, 高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱,标本经 激发15min后,荧光亦明显减弱。
5.荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命 有限,标本应集中检查,节省时间;汞灯应避免 多次开启,最好避免在半小时内开关。

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6.标本染色后立刻观察,因存放时间太久, 荧光会逐渐猝灭。可将染好色的标本用黑纸包好, 存放在聚乙烯塑料袋中,4℃保存,可延缓荧光的 猝灭时间。
7.荧光亮度的判断标准一般为四级,即 “一”无或可见微弱自发荧光;“+”仅能见明确 可见的荧光;“++”可见有明亮的荧光;“+++” 可见耀眼的荧光。

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五、维护与保养
? ? 1.镜头的清洁 镜头上粘的灰尘应用柔软的刷子轻轻刷掉, 在有指纹和油污的地方宜用柔软于净的脱脂棉、 纱布或擦镜纸蘸上无水乙醇(或甲醇)轻轻擦拭, 对物镜表面上的油渍可以用汽油擦拭。

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2.涂漆部分、塑料部分的清洁 对涂漆部分、塑料部分用中性去污剂擦拭, 避免使用有机溶剂。


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