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强大的多重检测平台


Gene Express

基因快讯2010年第2期

强大的多重检测平台
——Panomics/Luminex多重核酸与蛋白定量检测平台 Luminex多重核酸、蛋白定量检测平台又称作液相芯 片,是基于xMAP技术(flexible Multi-Analyte Profiling) 的新型生物技术平台。xMAP技术最早在1997

年由美国 Luminex公司开发,可用于免疫学、蛋白质、核酸检测、 基因研究等领域,已成为一种新的蛋白质组学和基因组学 研究工具。Luminex的代表产品 Luminex 100/200(图1) 以及新推出的FLEXMAP 3D多功能流式点阵仪, 是唯一得 到美国FDA批准的,也是唯一被纳入美国临床实验室质 控网络的高通量诊断技术,被国际业界专家评价为临床 诊断的趋势性技术之一。
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达到500种编码微球)。不同颜色微球在分类激光激发下 产生的荧光互不相同,这种分类荧光是识别不同微球的 唯一途径。利用这100种微球,可以分别标记上100种不 同的探针分子。 2. 交联探针、抗体或抗原:把针对不同检测物的核 酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的 微球上(图3)。 3. 检测反应:先把针对不同检测物的、用不同荧光 色编码的微球混合,再加入被检测物。 悬液中的微球与 被检测物特异性结合,结合物被标记上报告荧光。 4. 激光分析:微球成单列通过两束激光,一束判定 微球的荧光编码;另一束测定微球上的报告分子的荧光 强度。红色激光可将微球分类,从而鉴定各个不同的反 应类型(即定性);绿色激光可确定微球上结合的报告 荧光分子的数量,从而确定微球上结合的目的分子的数 量(即定量)。因此,通过红绿双色激光的同时检测, 完成对反应的实时、定性和定量分析(图4)。

图1 Luminex 100/200多功能流式点阵仪

一. Luminex多重检测平台技术原理
Luminex多重检测平台主要由4部分构成:生化试 剂、微球、流体和光学设备以及高速电子处理设备。其 核心技术是基于xMAP微球技术的液相芯片检测系统,在 不同荧光编码的微球上进行抗原—抗体、酶一底物、配 体—受体的结合反应及核酸杂交反应,通过激光分别检 测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的,一个 反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应。
图3.探针以共价方式结合到特定 荧光编码的微球上 图4.红绿双色激光分析

二. Luminex多重检测平台技术优势
Luminex 多重检测平台最突出的优势在于:仅需少量 样本即可同时定量检测同一样本中多个不同的目的分子, 即多重检测。具体,有以下显著优势: 1. 高通量:可对同一样本的多个目的分子同时分析。 理论上说,检测的通量等于微球的种类数,即最多达100 种。 2. 样本消耗量少:由于同一反应孔内可同时完成100 种不同的目的分子检测,所以大大节省了样本用量;且由 于微球体积小巧,少至1μL的样本即可检测。

图2 100种经荧光编码的微球

3. 操作简单、快速:由于是液相体系,反应时间大 大缩短,多重细胞因子检测,2~3小时内可完成。 4. 灵敏度高:微球表面积大,每个微球上可固定10 万个探针,保证了能最大程度与样本内的目的分子结合, 提高检测灵敏度。最低检测浓度可达0.1pg/mL。

1. 编码微球:分别用不同配比的红色和橙色两种荧 光染料(这两种染料各有10种不同区分)将直径5.6μm的聚 苯乙烯微球(beads)染成不同的荧光色(图2),从而获 得多达100种经荧光编码的微球(最新的FLEXMAP 3D可

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5. 特异性强:可读取单个微球上的荧光信号,自动 区分结合与未结合微球。 6. 准确性高:无需洗涤,微球上的报告分子荧光强 度与结合的待测分子成正比。由于Luminex检测平台的检 测范围大,因此不需要像ELISA检测进行稀释,进一步减 少误差。 7. 重复性好:Luminex检测平台直接读取荧光值,更 稳定、灵敏;每种微球检测100个,取中值作为结果,相 当于每个样本重复检测了100次。 8. 费用低:同时检测一个样本的多项指标可节约时 间、样本、试剂、耗材和劳动,降低检测成本,提高分析 效率。 9. 灵活:用户只需要增减带有探针的微球和标记分 子即可满足不同检测项目的需要。

基因快讯2010年第2期
产品类型包括细胞因子、生长因子、趋化因子、MMPs、 肥胖/糖尿病相关因子、血管再生因子等。MERCK公司的 WideScreen Assays系列目前只提供预混的试剂盒,主要产 品类型包括肿瘤标志物、心血管疾病、细胞信号转导通 路、肾毒性、激素以及代谢相关分子等。 2.多基因表达的定量检测 Affymetrix公司的Panomics QuantiGene Plex 2.0技术, 可以在同一反应中同时对3-36个基因做DNA或mRNA拷贝 数的精确定量。它可以分析各种样本(组织、细胞、血 液、FFPE样本、纯化的RNA或DNA等),只需用特定裂 解液裂解样本即可,对样本量下限无要求,特别适合需要 对微量样本做多基因定量的研究实验。它无需核酸的抽提 纯化,无需PCR,因为避免了很多人为因素的干扰,可以 快速得到准确的实验结果。 QuantiGene Plex 2.0技术特别适用于血液样本和保存 多年的FFPE样本。血液样本含有各种酶的抑制物,FFPE 样本由于保存太久造成mRNA高度降解,这两种样本很难 用传统的real-time PCR进行分析。而QuantiGene Plex 2.0技 术可以保证得到极高的准确度与重复性,相关文献已陆续刊 载于世界顶尖杂质(Nature, New England J Med, PNAS等)。 除此之外,Luminex多重检测平台还广泛涉及病原体 的检测和分型、HLA分型、mRNA表达谱(Branch DNA 技术,无需RNA抽提纯化、无需PCR扩增)、miRNA表达 谱、转录因子研究、细胞信号转导通路研究以及过敏原筛 选、自身抗体筛查、肿瘤标志物检测等诸多方面。 3.转录因子(TF)检测 转录因子是一种DNA结合蛋白,它们通过结合上游 启动子区域来调控基因表达。转录因子可以通过特定位点 的磷酸化或与其他转录因子结合成复合物的方式被激活。 而被激活的转录因子复合物则可以结合DNA上游启动子区 域来启动转录机制。单一的胞外刺激可以激发多条信号转 导通路,从而进一步激活多种转录因子来调节特定mRNA 的转录。 转 录因子 活性 的改变 通常 与人类的 疾病 相关, 比 如:癌症患者的AP1、ER、以及p53表达都会改变;相关 疾病中NFκB改变;肥胖症中PPARG发生改变。用简便易 行的方法对活化的转录因子做分析和定量就可以帮助我们 了解细胞的信号转导并揭示与疾病相关的转录因子。通过 运用这些方法,人们逐渐地积累了更多有用信息,同时通过 运用这些信息在更短的时间内开发了更安全有效的药物。 Affymetrix公司的Panomics Procarta TF Plex assay是一 种转录因子高通量检测试剂盒,它利用专利的分离技术与 Luminnex液相芯片系统相结合,可以在同一反应中同时 检测最多达43种转录因子。它对样本的要求量很低,只需 500ng的总细胞蛋白或250ng的核抽提物,整个过程只需不

三. Luminex多重检测平台技术应用
Luminex多重检测平台是一种非常灵活的多元分析平 台,在核酸、蛋白质等生物大分子的大规模分析中具有巨 大的应用潜力,可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、 受体—配体识别分析等众多领域的研究,蛋白质—蛋白质 相互作用、蛋白质—核酸相互作用分析等都可以在同一个 平台上实现。 1.可溶性蛋白分子定量检测 Luminex多重检测平台广泛应用于细胞因子检测、病 原体的检测和分型、HLA分型、细胞信号转导通路研究 以及过敏原筛选、自身抗体筛查、肿瘤标志物检测等诸 多方面。国外多家公司已推出了商品化的细胞因子液相 芯片检测试剂,比如Affymetrix公司的Panomics Procarta ? Cytokine Profiling Kits, R&D 公司的Flurokine MAP系列、 MERCK公司的WideScreen Assays系列等。可用于来自 人、小鼠、大鼠的样品,既有一次检测单种细胞因子的试 剂盒,也有预先混合多种细胞因子抗体交联微球而一次检 测多个指标者,研究者还可根据自身需要自行选购某几种 交联微球。这些试剂盒在检测灵敏性、准确性、可靠性等 方面都具有很好的性能。 Affymetrix公司的Panomics Procarta ?细胞因子/趋化因 子检测试剂盒,可在同一反应中同时检测最多达54种蛋 白,目前已开发的产品按种属分主要有120种human,39 种mouse,32种rat,45种non-human primate,8种porcine和 12种canine。该系列试剂盒方便快速,检测时间小于3小 时,灵敏度可达1pg/mL,准确性和重复性好。目前可以检 测的样本类型有:血清、血浆、细胞培养上清、以及体液 和细胞内检测。 R&D 公司的Fluorokine? MAP系列可以对50?L的血 清、血浆或细胞上清样品进行多因子分析,目前已推出的
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到5个小时。 4. SH2结构域检测 SH2域是在信号转导过程中,介导蛋白质与蛋白质相 互作用的众多蛋白质域家族之一。和其他域一样,SH2 域 也由氨基酸残基的保守区定义。100个氨基酸序列的折叠 特性,使得这些序列可以定向识别并结合到包含磷酸化酪 氨酸的配体中。涉及磷酸化酪氨酸的蛋白质与蛋白质相互 作用,就像SH2域促成的相互作用一样,是补充信号蛋白 质的主要方式,因而在信号转导过程中占据重要角色。 目前人们已在酶、适配蛋白质、信号蛋白质的调节 亚基、支架蛋白质和转录因子中发现了SH2域。这些蛋白 质对于信号转导过程必不可少,因为它们在受体和下游信 号分子之间扮演着适配器的角色,使得细胞内的信号传递

基因快讯2010年第2期
得以进行,并对特定蛋白质激酶的活性进行调控。 蛋白 质磷酸化是细胞应答的主要信息通道,依赖于SH2域的信 号传递发生故障,通常直接或间接地与人类疾病相关。 Affymetrix公司的Pamonics SH2 Domain Plex Kit可以 在同一反应中同时检测最多达30种SH2结构域,可以自由 选择不同的SH2蛋白对样本的磷酸化情况做定量定性分 析,操作简单快速,可在4小时内得到精确结果。 总而言之,Panomics/Luminex多重核酸蛋白检测平台 带给用户一个更全面、更系统的分析角度,从而使您的检 测数据具有更大的意义。

(上接第18页) 6. 高通量N-聚糖研究 链接在重组单克隆抗体(rMabs)的Fc区域的Asn-X 位置的N聚糖已表明可以影响药代动力学,药效以及治疗 安全性。抗体生产过程中介质,pH值,温度等条件的变化 都会影响糖基化的结构。考虑到聚糖对于抗体治疗性特征 来说具有的重要意义,各家药物生产商必须能够在生产中 测量并控制糖基化过程。这就需要一整套糖分析模块系统 来确认各批次药物在糖基化关键性治疗属性上的一致性。 而且,药物设计和开发过程中优化糖基化作用可有助于显 著增强药物性能,并减少临床应用中的安全风险。如果用 传统的层析技术,CE-LIF技术或者质谱技术来分析N-聚 糖,通常需要3天的时间来进行消化,标记和分析。而如 果在LCGXII上使用N聚糖分析试剂盒来做这项工作,这一 过程将从3天缩短为不超过6个小时。 7. LabChip N-聚糖分析技术同NPLC和CE-LIF的比较 辉瑞的一份研究报告比较了LabChip N-聚糖分析技术 和传统的NPLC和CE-LIF方法,发现LabChip技术的速度是 NPLC的160倍,是CE-LIF的6倍,具体数据参见图16.
图16. NPLC analysis with 2-AB label (top), CE-LIF analysis with APTS label (center), LabChip N-Glycan Profiling Assay with fluorescent label (bottom). Data courtesy of Pfizer Inc., Chesterfield, MO

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