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氨基酸检测方法


氨基酸分析
1958 Spackman, Stein and Moore 第一次实现氨基酸自动分离和定量
NH2 R C H
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UV-210nm

COOH

氨基酸衍生化方法
柱后衍生 柱前衍生
氨基酸 色谱柱 衍生化后的氨基酸 色谱柱

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试剂 检测器 检测器

检测器 检测器

柱后衍生
氨基酸 色谱柱 试剂 检测器 检测器

阳离子交换 色谱柱 : 阳离子交换柱 检测器 试剂 : 茚三酮方法 --- UV/VIS 检测器 OPA方法 --- 荧光检测器 检测器 方法

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柱后衍生化分离柱
阳离子交换柱 使用阳离子交换柱,峰分离度较差。 使用阳离子交换柱,峰分离度较差。 分析所有的氨基酸所需时间较长。 分析所有的氨基酸所需时间较长。
蛋白质水解氨基酸 (45 min) 生物体氨基酸 (120 min)

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茚三酮方法

伯氨基酸和仲氨基酸( 氨基酸) 伯氨基酸和仲氨基酸(亚氨基酸) 检 测 : 440nm ( 脯 氨 酸) or 570nm (primary) 反应温度 : 130 ℃ 反应速度 : 快 速 试剂稳定性 冷藏) 试剂稳定性 : 不稳定( 必须冷藏) 衍生化产 衍生化产物稳定性 : 稳定
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茚三酮方法
柱温箱 氨基酸 130 ℃ UV/VIS 检测器 反应器加热器 器加热

阳离子交换 阳离子交换柱

茚三酮试剂
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OPA 方 法
( 邻 苯 二 甲 醛)

伯氨基酸 检测器 检 测:荧光检测器 (Ex=350nm, Em=460nm) 温度: 反应温度: 室 温 速度: 反应速度: 快 速 试剂稳定性 试剂稳定性 : 较 差 衍生化产 定性: 衍生化产物稳定性: 较 差
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脯氨酸和羟基脯氨酸分析
脯氨酸和羟基脯氨酸不与OPA试剂 试剂 脯氨酸和羟基脯氨酸不与 发生反应 在与OPA反应前两种氨基酸应先使 反应前两种氨基酸应先使 在与 用下列试剂进行氧化 次氯酸盐 氯胺- 氯胺-T
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OPA 衍生反应辅助试剂
有硫醇存在时, 有硫醇存在时,OPA才会与伯氨基酸发 才会与伯氨基酸发 生反应

乙硫醇 2- 硫基乙醇 3- 硫基丙酸
( 非挥发性)

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OPA 方 法
柱温箱 氨基酸 荧光检测器 检测器

阳离子交换 阳离子交换柱

次氯酸盐
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OPA 试剂

茚三酮方法和OPA方法比较

茚三酮 反应 反应温度 反应速度 检测器 反应物稳定性 一 , 二级氨基酸 130 C 快 UV-VIS检测器 不稳定

OPA 一级氨基酸 室温 快 荧光检测器 稳定

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柱前衍生
衍生化后的氨基酸 色谱柱 检测器

色 谱 柱 : 反相柱 (ODS) OPA ( 荧光检测) 试剂: 检测 FMOC (荧光检测 荧 检测) 荧 光 胺(荧光检测 荧 检测) DANS-Cl (荧光检测 荧 检测) PITC (UV)
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柱前衍生分离柱
反相色谱柱 (ODS)
使用反相柱,色谱峰分离良好。 使用反相柱,色谱峰分离良好。

分析某些类型的氨基酸所需时间很短
蛋白质水解氨基酸 (20 min) 生物体氨基酸 (60 min)

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OPA Method
(o(o-phthaldialdehyde)

伯氨基酸 检测器 检测 : 荧光检测器 (Ex=380nm, Em=420nm) 温度: 反应温度:室温 反应速度:快速 速度:
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OPA柱前衍生化色谱图
生物体氨基酸标 生物体氨基酸标准品

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Shim-pack CLC-ODS

FMCO 方法
(9(9-fluorenylmethyoxycarbonyl chloride)

通用试剂, 通用试剂,用于缩氨酸 N端保护 N端保护

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荧光胺方法

pH=7时与伯氨基酸快 = 时与伯氨基酸快 速反应 易于水解

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DANSDANS-Cl 方法
(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride) (1-dimethylaminonaphthalene-

与伯氨基酸和仲氨 基酸反应效率低

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PITC 方法
(phenylisothiocyanate) For peptide and protein sequencing as Edman抯 抯 reagent (碱 伯氨基酸和仲氨基酸 (碱 性条件) 性条件 反应时间长 使用UV检测器 检测器, 使用 检测器,灵敏度 低

PITC

PTC

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PTC - 氨基酸色谱图
氨基酸标 氨基酸标准品

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STR ODS-II

自动氨基酸分析仪
对于“ 柱前” 柱后” 对于“ 柱前”和“ 柱后”自动氨基酸分析 仪来说,采用何种方法更好? 仪来说,采用何种方法更好? 要控制反应时间, 要控制反应时间,采用柱后衍生方法更方 便。 这就是为什么采用柱后衍生法所得结 果之重复性更好的原因。 果之重复性更好的原因。
柱后衍生重复性, 柱后衍生重复性 RSD 约为 1% 柱前衍生重复性, 柱前衍生重复性 RSD > 2%

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Shimadzu 氨基酸分析系统

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氨基酸分析流程图

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分离柱
强酸性阳离子交换树脂
(带有磺化基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物) 带有磺化基团的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物 带有磺化基团的苯乙烯

Na型 and Li型 型 型
Shim-pack AMINO-Na ,用于水解氨基酸分析 Shim-pack AMINO-Li ,用于生物体氨基酸分析

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水解氨基酸色谱图

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生物体氨基酸色谱图

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流动相
[ Na型 ] 型 A 溶液 : 0.2N 柠檬酸钠 (用高氯酸调 pH至 3.2) 用高氯酸调 至 B 溶液 : 0.6N 柠檬酸钠 / 0.2M 硼酸 (用4M NaOH调 pH至 10.0) 用 调 至 C溶液 : 0.2N NaOH(用于清洗色谱柱 用于清洗色谱柱) 溶液 用于清洗色谱柱 [ Li 型] A 溶液 : 0.15N 柠檬酸锂 / 7% 甲氧基乙醇 (用硼酸调 pH至 2.6) 用硼酸调 至 B溶液 : 0.3N 柠檬酸锂 / 0.2M 硼酸 溶液 用4M LiOH调 pH至 10.0) 调 至 C 溶液 : 0.2N LiOH (用于清洗色谱柱 用于清洗色谱柱) 用于清洗色谱柱
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PH梯度

H R-C-COOH NH3+

H R-C-COOH NH2

H R-C-COONH2

分离是通过 离子力进行的 分离是通过 离子力进

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N-acetylcystine作为辅助试剂

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什么是氨捕集柱?
无捕集柱 流动相中的氨

有捕集柱

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重复性 (各250 pmol)
Rretention time

Area value Retention timeretention timeArea value 1.2 1.0 1.3 1.3 0.9 0.9 1.0 1.6 1.0 Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phynylalanine Histidine Lysine Arginine 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.1 0.1 0.1 1.1 0.9 1.3 1.2 1.3 1.1 1.5 0.9

Asparatic acid Threonine Serine Glutamic acid Proline Glycine Alanine Cystine Valine

0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4

(n=10)
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线性

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高灵敏度分离色谱图
25 pmol 氨基酸标准品 氨基酸标

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样品预处理
脱脂 去蛋白 蛋白质水解 样品稀释 过滤

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脱脂
脂类组分会影响分析柱 使用弱极性溶剂
乙酸乙酯 氯仿 正己烷等

两相分离后, 水相必须使用0.45 um 滤膜过 两相分离后 水相必须使用 滤

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除蛋白
蛋白组分会干扰氨基酸的分离 除蛋白试剂
酸性溶剂方法 有机溶剂方法 超滤方法

蛋白沉淀物必须采用离心 (3000 rpm, 5 min) 或过滤方法除去 或过滤方法除去.
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酸性溶剂方法
三氯乙酸
(5-10% 水溶液 水溶液)

高氯酸
(0.1 - 1% 水溶液 水溶液)

除去蛋白后, 除去蛋白后 通过加 NaOH or LiOH 以中 和溶液
(溶液呈酸性时会影响色谱保留时间 溶液呈酸性时会影响色谱保留时间.)
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有机溶剂方法
乙腈 乙醇
聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。 聚苯乙烯柱不适合用有机溶剂。 如果采用有机溶剂方法, 进样量应尽可能小。 如果采用有机溶剂方法 进样量应尽可能小。

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超滤方法
效率高 成本低

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老鼠血清中游离氨基酸分析

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牛尿中游离氨基酸分析

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猪血粉中游离氨基酸分析

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茶叶中游离氨基酸分析

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蛋白质水解 (1)
高氯酸水解方法
6N - HCl 110C (N2氛围 氛围) 氛围 22 - 72 hours

色氨酸, 半胱氨酸,蛋氨酸 蛋氨酸分析不能用此水 色氨酸 半胱氨酸 蛋氨酸分析不能用此水 可用其它方法). 解方法 (可用其它方法 可用其它方法 转换成酸的形式。 天冬酰胺酸和 谷氨酸 转换成酸的形式。

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蛋白质水解 (2)
碱水解方法
4N NaOH 110C (N2 氛围 氛围) 16 - 24 hours

这一方法用于色氨酸 这一方法用于色氨酸

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蛋白质水解 (3)
过甲酸氧化方法
A/B=5/95 110C (N2 氛围 氛围) A:30% 过氧化氢 B:90% 甲酸 22 - 72 h

半胱氨酸、 这一方法用于 半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨 酸分析
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盐酸水解方法实例
从胰腺得到的胰岛 从胰腺得到的胰岛素中 的水解氨基酸分析

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氨基酸残留基团测定值和理论值比较

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碱水解方法实例
意大利草中水解氨基酸分析

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过甲酸氧化方法实例
人发中水解氨基酸分析

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样品稀释
0.2N 柠檬酸钠缓冲液 (pH 2.2) 0.2N 柠檬酸锂缓冲液 (pH 2.2) 用于稀释样品
稀释后的最佳浓度约为 5 nmol/ml - 10 ?mol/ml.
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过滤
进样前应使用 0.45 ?m孔径的滤膜 孔径的滤膜 过滤样品

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