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利用DNA指纹图谱进行农作物品种鉴定的研究进展


第 26 卷增刊 2003 年 5 月
文章编号 :1000 - 1573 (2003) S0 - 0028 - 03

河北农业大学学报
JOURNAL OF AGRICULTURAL UNIVERSITY OF HEBEI

 

 

Vol. 26 Sup .   May

2003

利用 DNA 指纹图谱进行农作物品种鉴定的研究进展


佘花娣 ,   陈景堂 ,   黄亚群 ,   祝丽英 ,   池书敏
( 河北农业大学 农学院 ,河北 保定 071001)

摘要 : 阐述了利用 DNA 指纹技术 ( 如 RFL P 、 RAPD 、 P 、 、 AFL SSR ISSR 和 STS 等) 进行品种鉴定的原理 、 特点及其研究概况 。与形 态学鉴定 、 同工酶鉴定相比 ,DNA 指纹技术是通过检测 DNA 水平上的差异来鉴定品种 , 具有准确 、 可靠 、 不受环境因素影响 、 且可 鉴定表型上难于鉴别的品种等优点 。DNA 指纹技术简单 、 、 快速 易于自动化 ,因而它在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景 。 关 键 词 : DNA 指纹图谱 ; 品种鉴定 ; 农作物 中图分类号 : S 512      文献标识码 : A

Progress on variety identif ication of crop using D NA f ingerprinting
SHE Hua2di , CHEN J ing2tang , HUANG Ya2qun , ZHU Li2ying , CHI Shu2min
(College of Agronomy ,Agricultural University of Hebei , Baoding 071001 , China)

Abstract : The basic principle ,traits and its application of variety identification using DNA fingerprinting technology are put forword , such as RFL P , RAPD , AFL P , SSR , ISSR and STS ect . Com pared wit h met hods of morp hological and isozyme identification , DNA fingerprinting has high accuracy and reliability because vatiety identification is evaluated fying varieties t hat can not be evaluated by morp hologic markers. DNA fingerprinting technology is simple ,quick and ben2 eficial to automation , so it shows t he wide future application in variety identification. Key words : DNA fingerprinting ; variety identification ; crop t hrough testing DNAs using it . Furt hermore , t he met hod can be employed in any season and have an advantage in identi2

优良品种是作物高产的基础 ,品种混杂和纯度降低会明显降低产量 。快速准确地鉴定品种和进行纯度分析对于种子质 量标准化 、 品种审定 、 假种辨别 、 产权纠纷均有重要作用 。目前 , 我国种子生产和经营管理还不太规范 , 不合格的种子屡屡混 入市场并用于生产 ,造成减产和经济损失 ,因此品种鉴定就显得尤为重要 [ 1 - 3 ] 。早期 ,人们采用形态学方法对品种进行识别 , 该方法简便 、 经济 ,但是由于许多形态学性状鉴定周期长 、 受环境影响大 [ 4 ] , 并且随着育种亲本的利用集中化 , 品种鉴定愈来 愈困难 ,传统的形态学方法也就越来越不适应品种鉴定和纯度分析 。 随着电泳技术的发展 ,蛋白质电泳和同工酶电泳相继被用于品种鉴定 。蛋白质电泳能产生品种特征特性的蛋白质分子 标记 ,能准确地将不同品种区分开 ,而且稳定性 、 重复性好 , 具有很强的适用性 。但是蛋白质电泳技术也存在一些问题 , 对某 些作物尤其对亲缘关系比较近的品种难以鉴别 。同工酶电泳技术能分析大量样品 ,技术比较简单 ,但是同工酶是基因表达的 直接产物 ,具有组织特异性 、 可利用的数量少 、 多态性少 、 对酶的提取要求高等缺点 , 因而在杂种鉴别上常因同工酶选择不当 而得不到应有的结果 [ 5 - 6 ] 。 近年来 ,随着生物技术的不断发展 ,诞生了一系列 DNA 分子标记技术 , 给作物遗传育种研究带来了巨大变化 , 同时也应 用到了品种鉴定的研究中 。DNA 指纹图谱技术主要有限制性片断长度多态性 ( Restriction fragment polymorp hism , 简称
RFL P) 、 随机扩增多态性 DNA ( Random amplified polymorp hic DNA , 简称 RAPD) 、 扩增片断长度多态性 ( Amplified fragment lengt h polymorp hism ,简称 AFL P) 、 简单序列重复 ( Simple sequence repeat ,简称 SSR) 、 内部简单序列重复 ( Inter - Simple sequence repeat ,简称 ISSR) 和序列标志位点 ( Sequence tagged site , 简称 STS) 等 [ 7 ] 。

1  DNA 指纹图谱
1. 1  RFL P 图谱



收稿日期 :2003 - 03 - 18

基金项目 : 河北省 “九五” 科技攻关资助项目 (98220119D)

作者简介 : 佘花娣 (1976 - ) ,女 ,河北邯郸市人 ,在读硕士研究生 ,从事玉米遗传育种研究 1

  增刊          佘花娣等 : 利用 DNA 指纹图谱进行农作物品种鉴定的研究进展

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RFL P 是由 GRODZIC KER 最早创立的 。RFL P 技术是最早在 DNA 水平上用于品种鉴定分析的一项技术 。它的基本原 ern 杂交和放射自显影 ,即可揭示出 DNA 的多态性 [ 8 -

理是利用特定的限制性内切酶将基因组 DNA 酶切 ,得到大小不等的 DNA 片断 。通过凝胶电泳形成不同的条带 ,再经 Sout h2
12 ]

。RFL P 标记的优点是标记量大 ,等位基因间呈共显性 ,可以区分杂

合基因型和纯合基因型 ,且不受环境条件限制 。

自 20 世纪 80 年代以来 ,RFL P 开始应用于植物研究 。目前在水稻 、 小麦 、 玉米 、 大麦 、 番茄和马铃薯等作物上都有研究报

道 。SIM TH 利用 RFL P 技术 ,用 38 个探针成功地将 78 个玉米杂交种区分开 ,共得到 288 个 RFL P 标记 ,杂种间遗传距离与
VAV INO 等利用 RFL P 技术 ,用 2 个特异性的麦谷蛋白 ( glutenins) 和麦醇蛋白 ( gliadins) 探针 ,将 54 个意大利普通小麦品种区 RFL P 技术的缺点是成本高 ,操作技术复杂 ,要求的 DNA 量大且纯度要高 。RFL P 的多态性信息量是相对而言的 ,在一些

RFL P 遗传距离相似系数为 Y = 0. 91 。同时他还发现 , RFL P 技术可区分同工酶和蛋白质电泳不能区分的玉米杂交种 [ 13 ] 。

分开 [ 14 ] 。

作物上 RFL P 探针可进行品种间及种间的鉴别 ,然而在小麦 、 马铃薯 、 大豆等作物上的多态性较低 ,特别是小麦 ,由于是严格的
1. 2  RAPD 图谱

自花授粉作物 ,基因组较大 ,多态性很低 ( 即使在相当分散的品种间也是如此) ,因此 RFL P 在指纹图谱中的应用受到限制 [ 7 ] 。
RAPD 技术是 1990 年由美国杜邦公司的科学家 WILL IAMS J G 和加利福尼亚生物研究所的 WEL SH J 领导的两个小组

几乎同时报道的一种分子标记技术 。RAPD 是利用随机引物 ( 一般为 8 ~ 10 bp ) 通过 PCR 反应扩增 ,用凝胶电泳分析扩增产 物 DNA 片段的多态性 ,其多态性反映了基因组相应区域的 DNA 多态性 [ 8 - 12 ] 。在基因组上 ,每个引物可连续直接扩增特定的
DNA 片段 ,对一个特定的基因型来讲 ,这些扩增的片段或片段的类型是唯一的 ,因此 RAPD 用于品种鉴定是有用的 。 RAPD 技术的优点是 DNA 用量少 ,简单快速 ,引物无种属特异性 ,不使用放射性同位素 。HU 利用 RAPD 对 Brassica 属作

物进行鉴定 ,用 4 个引物可区分 12 个花椰菜品种 [ 15 ] 。TIN KER 利用 RAPD 分析了 27 个杂交大麦品系 ,用 7 个引物将其区分 开 ,因此认为 RAPD 方法是区分高度相似性的大麦品系的有效方法 [ 16 ] 。余四斌利用 RAPD 技术 , 对水稻种子纯度进行了探 讨 ,比较了田间试验与 RAPD 结果 ,二者一致 [ 17 ] 。陈一华等对 12 个优良玉米自交系的 DNA 进行了 RAPD 分析 ,并建立了 12

个自交系的 RAPD - DNA 指纹图谱 。在该图谱中每个自交系都具有特异的 DNA 指纹 ,可以与其他自交系相区别 。然后 ,用 观、 准确 ,鉴定更省时 [ 3 ] 。但是 RAPD 技术也有不足之处 : 稳定性差 ,结果重复性不好 ; RAPD 一般为显性标记 ,不能鉴定杂合 子 ; RAPD 标记在基因组中分布不均匀 ,每个标记提供的信息量较少 。
1. 3   AFL P 图谱

1 、 数据分别表示各条带的有无 ,建立了 12 个自交系的计算机化的 DNA 指纹用于品种鉴定 ,这使得 DNA 指纹图谱更加直 0

AFL P 技术是 1992 年由荷兰 Keygene 公司科学家 ZEB EAU MARE 和 VOS PIETER 发明创造的一种 DNA 分子标记技

术 ,该方法结合了 RFL P 的稳定性和 PCR 技术的高效性 。AFL P 技术是通过选择性扩增基因组 DNA 的酶切片断而产生多态 性 ,选择性扩增是通过在引物的 3′ 末端加上选择性核苷酸而实现的 。通过改变选择性核苷酸的数目 ,就可预先决定所要扩增 的片断的数目 [ 8 - 12 ] 。
AFL P 不仅重复性好 ,而且多态性高 ,在聚丙烯酰胺凝胶上 ,一次可扩增 50 ~ 100 条带 ,因而非常适合品种鉴定和纯度分

析 。SM ITH 等利用 AFL P 技术将 44 个玉米自交系分成不同类别 ,并认为 AFL P 是一种很准确的方法 ,可以将亲缘关系非常 认为 AFL P 是构建花生指纹图谱的有效方法 [ 19 ] 。但是 ,AFL P 技术操作复杂 ,成本较高 ,并且该技术受到专利保护 ,只能用于 非盈利性的科学研究 。
1. 4   SSR 图谱

近的品种区分开 [ 18 ] 。WEN G 等利用 AFL P 分析了来自半干旱热带作物国际研究所的 10 个花生品种 ,获得 78 个多态性谱带 ,

SSR ( Simple Sequence Repeat ) ,简单序列重复 ,称为微卫星 DNA ( microsatallite DNA) 或短串联重复 ( STR) ,是近几年来发展

起来的建立在 PCR 基础上的第二代分子标记 。SSR 是一种真核生物基因组中普遍存在的重复序列 ,重复序列一般由 1 ~ 6 个 碱基组成 ,重复次数在不同物种或同一物种不同基因型之间是高度可变的 。这些重复序列两端大多是保守的单拷贝序列 ,因 此可以根据保守序列设计特异引物 ,通过 PCR 技术将中间的核心重复序列扩增出来 ,利用琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析技术可获得其长度多态性 [ 8 - 12 ,20 ] 。

SSR 具有 RFL P 的所有遗传学优点 ,且避免了 RFL P 技术中的使用放射性同位素的缺点 ,又比 RAPD 的重复性和稳定性

高 ,因而目前已成为遗传标记中的热点 。SSR 已用于番茄 、 大豆 、 水稻 、 玉米等许多作物 。SEN IOR 等在 4 % Metap hor 琼脂糖

上检测了 70 对 SSR 引物对 94 个玉米自交系的扩增产物 ,共检测到 365 个等位基因变异 [ 21 ] 。李新海等利用 43 对 SSR 引物在
21 份玉米中共检测出 127 个等位基因变异 ,平均每对 SSR 引物检测到等位基因为 2. 95 个 [ 22 ] 。他们都认为 SSR 标记具有很

高的多态性 ,非常适用于品种鉴定研究 。然而由于 SSR 技术必须针对每个染色体座位的微卫星 ,发现其两端的单拷贝序列才 能设计引物 ,这给微卫星标记的开发带来一定的困难 。
1. 5  ISSR 图谱

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河北农业大学学报

第 26 卷

ISSR 是一种新型的分子标记 ,是由 Ziet kiewecz 于 1994 年创建的一种简单序列重复间扩增多态性的分子标记 。它的生物

学基础仍然是基因组中存在的 SSR 。ISSR 标记根据植物中广泛存在 SSR 的特点 ,利用植物基因组中出现的 SSR 本身设计引 物 ,无需预先克隆和测序 [ 12 ,20 ] 。ISSR 具有很好的稳定性和多态性 ,技术要求低 ,且 PCR 扩增时退火温度在 52 ℃ 左右 ,保证了
PCR 扩增的可重复性 。 CHAR TERS 等运用 5′ 端锚定 SSR 引物分析了 20 个甘蓝油菜品种 ,指出锚定 SSR - PCR 法是一种多态性很高 、 重复性很

好的指纹库构建方法 [ 23 ] 。FAN G 等用 ISSR 标记区分亲缘关系很近的柑橘品种 [ 24 ] 。PREVOST 等用于鉴别丰富的马铃薯品 种 ,仅用了 4 个 ISSR 引物就将 30 多个品种区分开来 [ 25 ] 。但 ISSR 与 RAPD 相似 ,不能鉴别检测位点的纯合与杂合状态 。
1. 6   STS 图谱 STS 通过设计特定的引物 ,使其与基因组 DNA 序列中特定位点结合 , 从而可用来扩增基因组中特定区域 , 分析其多态

性 。D′ IDIO 利用 STS 标记对硬粒小麦品种进行了鉴定 [ 26 ] ,FACCIOL I 利用β- 大麦醇溶蛋白 STS 标记对大麦品种进行 OV 了区分 [ 27 ] ,他们认为 STS 方法对于干种子鉴定是一个合适的方法 ,而且可像蛋白质电泳那样成为标准方法 。

2  展望
品种鉴定不但要准确 、 可靠 、 快速 ,还要简单化 、 自动化 , 这是品种鉴定实现商业化的前提 , 也是品种鉴定技术的发展趋 势 。利用 DNA 分子标记进行品种鉴定从理论上是切实可行的 ,整个实验过程可在实验室进行 ,具有准确 、 可靠 、 快速等优点 , 为品种鉴定技术的简单化 、 自动化 、 商业化奠定了基础 [ 28 ] 。当然 ,在实际操作中 ,DNA 分子标记技术各有不足之处 ,如 RFL P 需要放射性同位素 ,RAPD 重复性差 ,SSR 开发较困难 ,STS 需要知道序列等 ,但是随着这些问题的解决 ,尤其是 DNA 分子标 记技术若能进一步简化步骤 ,降低成本 ,实现自动化 ,那么 DNA 分子标记技术将有更广阔的应用前景 。
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业科学 ,1998 (2) :38 - 391

北农业科学 ,1998 (3) :27 - 321

( 下转第 33 页)

  增刊      

   王丽宏等 : 农作物秸秆资源的开发利用

33

综上所述 ,秸秆饲料资源的开发利用是一项浩大的工程 , 目前 , 秸秆饲料各种处理方法如青贮 、 氨化 、 发酵等技术局限于 当地处理 ,就地使用 ,制约着秸秆资源高效的利用 。因此 ,加快发展秸秆饲料压快技术 ,有利于秸秆异地运输 ,贮存 ,加速发展 秸秆畜牧业 。

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( 编辑 : 黄金祥)

( 上接第 30 页)

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( 编辑 : 郭桂仙)


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