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Real Time PCR介绍


实时荧光定量PCR介绍
(Real Time PCR)

主 要Time PCR基础知识 Real 内 容
1 2 3 4 Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 Real Time PCR实验方法

Real Time PCR解析方法 2. Real Time PC

R的检测方法 Real Time PCR应用实例

Real Time PCR的用途
Real Time PCR用途

定性分析

定量分析

绝对定量
病毒及病原菌检测 物种鉴定 基因分型 病毒及病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测

相对定量
差异显示结果验证 基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析

Real Time PCR的原理
Real Time PCR

使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。

发 激 射 发 光 光

Ct值

Real Time PCR的原理
同一个样品重复96次PCR的扩增曲线

Ct值

Real Time PCR的原理
Ct值概念
Real Time PCR扩增过程中,每个反应管内的荧光信号值 达到设定的阈值时所经历的循环数。 ( C-代表Cycle,t-代表threshold)

阈值:在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的 荧光检出界限。

Real Time PCR的原理
在PCR反应体系中加入荧光物质,并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程, 最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。

Real Time PCR基础知识
1 Real Time PCR基础知识

1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法

Real Time PCR的检测方法
SYBR Green I

荧光染料嵌合法

荧光探针法

TaqMan Probe

Cycling Probe

Molecular Beacon

etc.

荧光染料嵌合法(SYBR Green I)
SYBR Green I:是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具 有绿色激发波长的染料。

SYBR Green I

SYBR Green I法作用机理示意图
热变性
Primer

F

F

F F F

退 火

Primer

Pol.

F

F

F F F

延 伸
Primer Pol.

F F

F

F

F

TaqMan法作用机理
TaqMan探针为一寡核苷酸,
5’端标记一个报告基团(Reporter), 3’端标记一个淬灭基团(Quencher)。

R

Q

TaqMan Probe法原理示意图
热变性
Primer

R

Q

退 火

Primer

Pol.

R

Q

延 伸
Primer Pol.

R

Q

CycleavePCR法原理
Cycling probe为一寡核苷酸,5’端标记一个荧光报告基 团(Reporter),3’端标记一个荧光淬灭基团(Quencher), 寡核苷酸为DNA/RNA杂合体。
RNA

Q

R

CycleavePCR法原理示意图
热变性
Primer

Q

F

退 火

Primer

Pol.

Q

RNase H

F

延 伸
Primer Pol.

Q

F

SYBR Green I 法与Probe法比较
SYBR Green I 法 简便易行
One-Step RT-PCR Probe法

特异性高

价格便宜

多重PCR检出

要求反应的特异性

Probe设计要求高

不能进行多重PCR

Probe合成费用高

常用于mRNA表达量分析等

常用于SNP解析,病毒、病源菌检测等

主 要 内 容
1 Real Time PCR基础知识
反转录反应

2

Real Time PCR实验方法 Real Time PCR解析方法

3

◇ One Step和Two Step RT-PCR的选择 ◇ RT Primer的选择 ◇ Total RNA中genomic DNA混入的对策

Real Time PCR反应

4

◇ Real Time PCR引物及探针的设计 Real Time PCR应用实例 ◇ 引物反应性确认 ◇ PCR条件优化顺序

One Step和Two Step RT-PCR的选择
Two-Step RT-PCR

RT反应

RNA

cDNA

PCR反应

One-Step RT-PCR

One Step和Two Step RT-PCR的选择
Two-Step RT-PCR
One-Step RT-PCR One-Step RT-PCR

高扩增效率

操作简便

cDNA使用更加灵活

有效降低污染

更多的RT primer选择

特异性RT primer

常用于mRNA表达量分析等

常用于病毒、病源菌检测等

RT Primer的选择
Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene specific Primer Oligo dT Primer

PCR F-primer

PCR R-primer

RT Primer的选择
Random

5’ 5’ 5’

F F

目的片段 Random 目的片段

R R

3’

目的片段在mRNA任何位 置都能使用。通常mRNA

1,500base
目的片段

F

R

表达量分析最适 AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析,提 升反应检测的灵敏度 Oligo dT Primer Oligo dT Primer 目的片段在距Poly(A) Tail AAA··· 3’ 1.5kbp 以内适用,RT效率 较高 One Step RT-PCR只能使 用Gene specific Primer, 不适用于复数基因的检出

Gene specific Primer

5’

F

目的片段

R

3’

ToTal RNA中Genomic DNA混入的对策
Genomic DNA
exon PCR Primer exon intron
RealTime PCR

cDNA
exon PCR Primer exon
RealTime RT-PCR

Small PCR Product

融 解 曲 线 分 析

Small PCR Product

此种情况必须采用DNase I处理,去除基因组DNA

ToTal RNA中Genomic DNA混入的对策
Genomic DNA
PCR Primer exon intron exon

cDNA
PCR Primer exon exon
RealTime RT-PCR

RealTime PCR

Long PCR Product or No Product

融 解 曲 线 分 析

Small PCR Product

可以区分cDNA或者基因组DNA来源的扩增产物

Real Time PCR引物及探针设计
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 普通PCR引物 目的是获得目的基因,对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。 Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增,对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。 => 对引物设计要求严格

Real Time PCR引物及探针设计
扩增片断大小 Primer长度 GC含量 Tm值 序列

★ ★ ★ ★★★ ★

80-150bp(尽量限制在300bp以内) 17-25base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近,应用专用软件计算Tm值
△ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’端) △ 避免T/C连续,A/G连续 △ 3’末端避免GC rich或AT rich

3`末端序列



△ 3’末端碱基最好为G 或C △ 3’末端碱基尽量避免为T

互补性 特异性
RT-PCR用引物

★★★ ★★★ ★★★

△ 引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列 △ 引物3’末端避免2base以上的互补序列

使用BLAST检索,确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物,限制基因组DNA扩增

Real Time PCR引物及探针设计
好的引物 需要寻找好的参照序列
目的基因 目的基因序列获得 引物设计 分析序列

RefSeq序列

特异性确认 基因组序列确认 Real Time RT-PCR 引物

Real Time PCR引物及探针设计
通过NCBI获得参考序列和相关情报。 RefSeq数据库提供无重复,准确性, 完整性的基因参考序列。

序列可信度高,信息量大
Pah

NCBI:

The National Center for Biotechnology Information

X51942

Pah
Pah

Pah

BC013458
Pah

X51942 BC013458 评价 BI330290 BF789560

NM_008777

BI330290
Pah

RefSeq

BF789560

GenBank

Real Time PCR引物及探针设计
NCBI提供目的基因相关信息
(基因名、染色体上的位置、Accession、 表现型、文献索引、同源性等其他数据库 以及功能、pass way、蛋白质图谱等)

基因词典

Real Time PCR引物及探针设计
NM_008777 Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA.
GenBank file
LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_008777 VERSION NM_008777.1 GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1..1959 /gene="Pah" /db_xref="GeneID:18478" /db_xref="MGI:97473" CDS 48..1409 /gene="Pah" /note="go_function: iron ion binding [goid 0005506] /protein_id="NP_032803.1" /db_xref="GI:6679203" /db_xref="GeneID:18478" /db_xref="MGI:97473" ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt

目的基因 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 Real Time RT-PCR 引物

Real Time PCR引物及探针设计
1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 aattcaaccc tcctggagaa tcgaagacaa ttggtgccct ttgaatccag agcgtagcaa ctgtccatga ttcaggagct accacccagg cctacaacta agacctgggg agcacaacca cgcagctgga ttgctggctt gcacacagta atgaactctt aaattgggct actggtttac ctgggctctt tgcccctgga tgtactatgt caatcccccg ataatactca gccatgccct aggtcaacca aaaagtttta aaataaatca agtcacattt tctcatcaac tgtgctaagc cggagtcctg ctccaatcaa ggccaaggtc accttcccgt gcccgtcctg gctttcccga ggacagattc ctttaaagat ccgccatggg aacggtgttc catcttccct agatgtttct actgtcgtct cattaggcat gggacatgtg tgcatcgctg tgtggagttt gtcatccttt gctagagaag ggccgagagt gcccttctcc gcagttgaag gcagaaaata aaaaaatctg tttgcaatgt atttctctga gatttagata attcatcaaa tagacacctc agcagaaaac aatggtgctg ctgcgcttat ttaaacaaag ggcagcatca gacaaggaaa gccaatcaga cctgtgtacc cagcccattc aggactctga cttctggaaa cagtttctgc cgagatttct ggatctaagc cccttgtttt ggggcacctg gggctttgca ggagaattac acagcctgcc ttcaatgatg gttcgctatg aatttagctg aagtcatgaa ctgatagaag cagcttttaa atgaaagtat tctcagacct tttgggactc acttactgag tctcagactt tatctctgat ttgaggagaa atgagtatga tcaagagcct agaacacagt ttctcagcta gggcgagacg ctcgggtgga aggccttgta agtactgcgg agacttgtac tgggtggcct ccatgtacac cagatagaag atgagtacat aggaaggaga agtactgttt aggagtatac ccaaggagaa acccctacac actccattaa cagaaagtga tatagtaact tatattttcc attaaaaccc tcaatttggt atatcatttg agccagcatg tgggcaggaa attctcactc tgagatcaac gtttttcacc gaggaacgac gccctggttc tggagccgaa aaagcagttt atacacagag taaaacacat tttccgtgaa tggtttccgc ggccttccga acctgaacct ctttgcccag tgagaaactg ttctataaag atcagacaag tgtcacagag agtgaggact tcaaagggtt tagtgaggtt cgtcatagac gcttcttttc taacatagtg atcagtggta ttaaaatgta ggctctgtct gcagctgttg acaagttaca aaagaggaag ctgacacaca tatctggata attggtgcca ccaaggacca ctggatgcag gctgacattg gaggagagga gcctgctacg gacaacatcc ctccgtcctg gtcttccact gatatctgtc ttttctcagg gccacaattt gcatatggtg ccaaagctcc ttccgacctc tttgctgcca gaggtcctgg ggaatccttt agaacttagg cctgaagaag gaggatcacc gatccttcag atttctcagt gttcattttt

目的基因 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认 基因组序列确认 Real Time RT-PCR 引物

Forward CCTGGCCAAGGTCCTGCG AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC ACTCTTGCGACATGTGCCCTTG AAAGTCATGAACAGAAAGTGA

Reverse TTGGAACCAGGGCACTGTGT TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC GTGATCCTCCACTATGTTAG

Real Time PCR引物及探针设计
Forward
5’CCTGGCCAAGGTCCTGCG

Reverse
3’ 末端的T

目的基因 目的基因序列获得 引物设计 序列分析 特异性确认

5’- TTGGAACCAGGGCACTGTGT -3’

5’- AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC
5’5’TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC -3’

3bp互补
ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG 5’TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC -3’

5’-

SNP
AAAGTCATGAACAGAAAGTGA 5’GTGATCCTCCACTATGTTAG -3’

基因组序列确认 Real Time RT-PCR 引物

Real Time PCR引物及探针设计
目的基因 目的基因序列获得 引物设计
参考数据库? RefSeq-rna

序列分析 特异性确认 基因组序列确认

物种选择 WordSize ? 7

Real Time RT-PCR 引物

Real Time PCR引物及探针设计
Real Time PCR用TaqMan探针设计原则
Probe长度 Tm值 序列

★★ ★★★ ★ ★ ★★★ ★★★

20-24bp 探针的Tm比引物高8-10℃ △ 目的序列GC含量相对较高的区域设计 △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3’端)避免T/C连续,A/C连续) 探针5’末端的第一个碱基不能是G Probe内部或Probe与两条引物之间避免3base以上的互补序列 BLAST检索确认Probe特异性

5’末端序列 互补性 特异性

Real Time PCR引物及探针设计
探针荧光标记物选择
3’淬灭基团 淬灭基团性质 TAMRA 建议使用的5’报告基团 FAM, HEX, TET, JOE等 FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等

荧光物质

Eclipse

非荧光物质

反应性能确认
线性关系、扩增效率确认
相关系数(r2):大于0.98 PCR扩增效率(E):0.8-1.2

检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法,30Cycles内 无非特异性产物扩增

No template control确认
30Cycles内无引物二聚体产生

PCR条件优化顺序
A. 扩增效率低时
? ? ? ? 延长退火、延伸时间 提高退火、延伸温度 改为三步PCR,降低退火温度 提高引物浓度

标准Protcol 95℃ 10sec. 60℃ 20sec. (Primer 终浓度200nM)

B. 有非特异性扩增时
? 提高退火温度 ? 缩短退火、延伸时间 ? 降低引物浓度

主 要 内 容
1 2 3 4 Real Time PCR基础知识
1. 标准曲线分析 Real Time 2. 融解曲线分析

PCR实验方法

Real Time PCR解析方法 Real Time PCR应用实例

3. 绝对定量和相对定量解析方法

标准曲线制作
扩增曲线 标准曲线
105 104 3 10 2 10 1 10 0 10

105 104 103 102 101 100

? 标准品梯度的选择:5~6个梯度 ? 标准品稀释倍数的选择:标准品稀释倍数通常为5-10

标准品的种类

DNA样品定量标准品
基因组DNA 质粒 PCR产物

RNA样品定量标准品
Total RNA & cDNA 体外转录RNA PCR产物或质粒

质粒标准品的构建
质粒标准品引物设计
AGTACCTAGATCCTAG

红色 绿色
AGTACCTAGATCCTAG

部分为标准品构建用引物区 部分为Real Time引物区

质粒标准品构建流程
目的基因

基因组DNA PCR

目的基因

目的基因克隆
目的基因

质粒

质粒提取,OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul,作为标准品。

RNA标准品构建
……

红色部分为标准品构建用引物区 蓝色部分T7启动子和Poly(T) 绿色部分为Real Time引物区

……

体外转录RNA标准品构建流程
目的基因

Total RNA RT

目的基因

cDNA PCR

T7 Promoter

目的基因

TTTT???T

PCR产物

T7 RNA polymerase
AAAA???A AAAA???A

体外转录RNA

RNA纯化后,测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul,作为标准品。

理想的标准品扩增曲线
基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显,陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽

理想的标准曲线
相关系数(r2):大于0.98,越接近1,结果可信度越高。 扩增效率(E):0.8-1.2, 越接近1,越理想。
扩增效率(E)计算方法
标准曲线X轴表示起始模板浓度(log10),Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值,Y轴表示起始模板浓度(log10) E=10-a-1 扩增效率

相关系数

Real Time PCR解析方法
3 Real Time PCR解析方法
1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法

融解曲线分析
SYBR Green I法进行检出时, 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。

Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。

融解曲线分析
对PCR产物特异性进行分析

特异性产物 非特异产物

引物二聚体

Real Time PCR解析方法
3 Real Time PCR解析方法
1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法

绝对定量解析方法
提取样品

流 程

引物设计 标准品制备 Real Time PCR反应 数据分析

绝对定量解析方法
通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病 毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。

检测样品
105 104 103 102

101

扩增曲线图

检测样品

标准曲线图

相对定量解析方法
进 行 相 对 表 达 量 分 析 必 要 性
Sample A

实际上目的基因表达量分析 细胞起始数相同

Sample B

RNA提取效率相同

目的基因扩增效率相同
以上条件不可能同时得到满足,必须用内对照基因(管家基因)校正, 以上条件不可能同时得到满足,必须用内对照基因(管家基因)校正, 进行相对表达量分析。 进行相对表达量分析。

相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如:GAPDH、Actin等。

筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选

相对定量解析方法
双标准曲线法
通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量,然后以管家 基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正,求得相对值即为相对表达量。

校正值=

目的基因定量结果 管家基因定量结果

相对值=

检测样品的校正值 对照样品的校正值

⊿⊿Ct法
通过对照样品、检测样品的目的基因及管家基因的Ct值,然后以管家基因的Ct值为 依据对目的基因进行差值校正,最终求得相对表达量。

Rel.Qty. = 2

? Ct (目样?目管 ) ? Ct ( 对样?对管 )

[

]

主 要 内 容
1 Real Time PCR基础知识
定性分析

2

Real Time PCR实验方法 ◇ 对人的ALDH2基因进行SNP解析
绝对定量

3

Real Time PCR解析方法 ◇ 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析
相对定量

4 ◇ 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 Real Time PCR应用实例

定性分析应用例
实验背景

对人的ALDH2基因进行SNP解析

Aldehyde dehydrogenase-2(ALDH2)基因位于人类第12对 染色体q24位置,有ALDH2 type1和ALDH2 type2两种基因型, 其两种基因型序列的差别在exon12第487个氨基酸位置, ALDH2 type1型为Glu(GAA), ALDH2 type2型为Lys(AAA)。

检测方法 Cycling Probe法 SNP 位点 ALDH2 type1和ALDH2 type2 (G/A) 使用试剂 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa Code. DCY501 使用仪器 Thermal cycler Dice? RealTime System (TP800)

SNP解析原理示意图

定性分析应用例
Cycling Probe法
ROX FAM

对人的ALDH2基因进行SNP解析

PCR-RFLP法
Eco57 I
杂合型 (hetero)
CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切断 Mutant type :不切断 Mutant wild

ROX、FAM通道均有信号检出
ROX FAM

野生型 (wild homo)

Mutant wild

ROX通道有信号检出
ROX FAM

突变型 (mutant homo)

Mutant wild

FAM 通道检出荧光信号

定性分析应用例

对人的ALDH2基因进行SNP解析

提取样品

流 程

引物、探针设计 Real Time PCR反应 数据分析

定性分析应用例 样品提取

对人的ALDH2基因进行SNP解析

提取试剂:Blood Genome DNA Extraction Kit (TaKaRa Code.D9081)

从人血液中(共计10个样品)提取基因组DNA。

定量反应
反应试剂:CycleavePCR Core Kit (TaKaRa Code.DCY501)

定性分析应用例
实验结果

对人的ALDH2基因进行SNP解析

Allele 1: 杂合型 Allele 2: 突变型

绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

检测方法 TaqManTM probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的genomic RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step RT-PCR Kit(Perfect Real Time)
TaKaRa Code.DRR064





Smart Cycler Ⅱ

绝对定量应用例
SARS Control RNA构建
SYN247 F01 SYN247 F02

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

SYN247R03

SYN247R02

BamHⅠ

SYN247R01
Hind Ⅲ

SacⅠsite

BamHⅠ

Hind Ⅲ

pBluescript II SK(+) vector
T7 promoter

绝对定量应用例
M1
DNase I 处理前

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

体外转录的SARS Control RNA 电泳照片
DNase I 处理后

M2

M1: λ-Hind Ⅲ digest M2: DL-2000 Marker

纯化的SARS Control RNA OD值测定结果

绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

SARS Internal Control RNA的构建
BNITMSARS1 Adaptor F BNITMSARAs2 Adaptor R

λDNA
A
SacⅠsite BamHⅠsite

A

pBluescriptII SK(+)vector T7 promoter

绝对定量应用例
M1
DNase I 处理前

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

体外转录的Internal control RNA电泳照片
DNase I 处理后

M2

M1: λ Hind Ⅲ digest M2: DL-2000 Marker

纯化的SARS Internal Control RNA OD值测定结果

绝对定量应用例
探针的选择
Template SARS Control RNA or SARS Genomic RNA SARS Internal Control RNA

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

TaqMan Probe Primer 5’端报告基团 3’端淬灭基团 共用 共用 FAM标记 ROX标记 Eclipse标记 Eclipse标记

绝对定量应用例

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

SARS Control RNA105-101扩增曲线

标准曲线

SARS Internal

control RNA扩增曲线

SARS genomic RNA Sample 1、2、3扩增曲线

绝对定量应用例
定量结果

对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量

对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。

相对定量应用例
检测方法 管家基因 目的基因 标 准 品 试 仪 剂 器

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况

SYBR Green I荧光嵌合法 GAPDH基因 PAH基因 cDNA
PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time(DRR036) SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) (DRR081)

Thermal cycler Dice? RealTime System (TP800)

相对定量应用例
详细的实验资料获取

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况

实验设计及引物 设计、合成

Total RNA提取

标准品RNA制备

Total RNA基因组 DNA去除

标准曲线制作及预实验

样品Real Time PCR反应

数据整理及论文撰写

相对定量计算及数据分析

相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况

提取Total RNA后电泳照片
M C L B M

M:DL2,000 DNA Marker C:Control RNA L:Liver RNA B:Brain RNA

提取试剂:TaKaRa RNAiso Plus TaKaRa Code D9108

相对定量应用例
目 的 基 因 标 准 曲 线 制 作 结 果

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况

扩增曲线图

融解曲线图

标准曲线图

管 家 基 因 标 准 曲 线 制 作 结 果

相对定量应用例
样品目的基因定量结果

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况 样品管家基因定量结果

扩增曲线图

管家基因 GAPDH 定量结果 样品a1 228800 212700 222175 样品a2 227300 219900 样品 b1 333600 340300 340975 样品 b2 354100 335900 82.46 76.80 207100 196600 76.80 92.65 82.18 平均值 定量结果 196600 204400 201175 平均值

目的基因 PAH 通过GAPDH校正 的PAH校正值 小鼠肝脏和脑中 PAH的相对表达量

0.905

3757

2.41×10-4

1

相对定量应用例

分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况

通过双标准曲线方法计算得出,苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因在小鼠肝脏中的 表达量明显高于其在脑组织中的表达水平,二者的表达量比例约为3757:1

通过⊿⊿CT方法计算得出,二者的表达量比例约为6712:1

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相对定量解析方法
实验例
实验目的
检测GOI基因在4个样品(Sample1、2、3、4) 中表达量的变化情况

定量结果

内对照基因

从HK1、HK2、HK3、HK4、HK5种选取
以表达量最大样 品为1,计算不 同样品的量

将上述结果输入到geNorm软件 中,计算出most stable genes (可选取2-3个)

相对定量解析方法

几何平均数

Quantity GOI/NF
GOI相对表达量 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 Sample A Sample B Sample C Sample D

相对表达量

GOI

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DRR039

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DRR061

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