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水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展


中国农学通报

2010,26(11):23-27

Chinese Agricultural Science Bulletin

水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展
陈 煜, 杨燕凌, 谢小芳, 柯玉琴
(福建农林大学生命科学学院, 福州 350002)

摘 要: 盐分是影响水稻生长发育的重要环境因素之一。伴随工业化进程及淡水资源的匮乏而出现的土 壤盐碱化是当今水稻育种需要突破的一个难点。在此背景下, 克隆耐盐基因和培育耐盐转基因水稻成 为水稻育种的新的技术手段。作者在耐盐转基因水稻研究、 耐盐相关新基因的克隆两个方面进行了综 述, 以期能使水稻育种科技人员对该领域有较为全面的了解, 同时能为他们的科研工作提供一些借鉴。 最后, 对盐胁迫下转基因水稻的前景以及存在的问题进行了展望和讨论。 关键词: 水稻; 耐盐基因; 基因克隆; 转基因水稻; 研究进展 中图分类号: S511 文献标志码: A 论文编号: 2009-0053

Research Progress on Cloning and Translation of the Salt Resistance Genes in Rice
(College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)

Chen Yu, Yang Yanling, Xie Xiaofang, Ke Yuqin

Abstract: Salinity is one of the factors which affect the growth and development of rice. At present, Soil

salinization, which followed with the industrialization progress and the lack of fresh water resource, became one difficult point in the rice breeding. In such situation, cloning genes of salinity resistance and raising transgenic rice of salinity resistance are the new methods for rice breeding. Transgenic rice with salinity resistance and new genes cloned recently were reviewed as to support totally comprehension and advice for it were discussed. 0 引言 水稻(Oryza sativa L.)源于淡水沼泽植物, 因此对 盐较为敏感。水稻作为中国第一大粮食作物, 现正 面临可耕种面积逐渐缩小的尴尬。一些因素导致的 土壤盐碱化也是导 致 水 稻 耕 种 面 积 缩 小 的 原 因 之 一。在亚洲, 150 hm 水稻受到盐胁迫的危害, 2 而且
2

researchers. At last, prosperity of transgenic rice with salt resistance was predicted and the problems exist in Key words: rice (Oryza sativa L.); salt resistance genes; gene clone; transgenic rice; research progress 基因克隆的研究现状做简要综述。 1 耐盐转基因水稻研究 基因工程技术的诞生使得水稻育种变得容易, 通 过将耐盐基因转化到盐敏水稻品种中提高了盐敏水稻 对盐的耐受能力。 1.1 渗透相关基因 植物在盐胁迫下, 细胞会代偿性地增加一些相容 性物质, 降低细胞的渗透势, 保护酶和细胞膜结构, 清 除氧自由基[1]。这些物质包括: 脯氨酸、 甜菜碱、 果糖、 蔗糖、 多胺等。它们具有较强的亲水力, 可以代替蛋白 质、 蛋白复合物或膜表面的水[1]。

这种情况仍在不断加剧。因此, 研究、 培育耐盐水稻 品种, 提高土地利用率, 从而扩大水稻种植面积, 提 高水稻产量已刻不容缓。目前, 国内外已克隆了一 些耐盐相关基因, 并转化水稻, 获得了耐盐性较高的 转基因水稻。此文就转耐盐基因水稻及耐盐相关新

基金项目: 福建农林大学校青年教师基金(06B03)。 第一作者简介: 陈煜, 1977 年出生, 女, 四川泸州人, 讲师, 硕士, 主要从事植物分子生物学研究。通信地址: 350002 福建福州金山福建农林大学生命 科学学院, 0591-87656198, Tel: E-mail: chenyuyu521@126.com。 通讯作者: 柯玉琴, 1954 年出生, 女, 福建莆田人, 教授, 大普, 主要从事植物逆境生理生化研究。通信地址: 350002 福建福州金山福建农林大学生命 科学学院, 0591-83789443, Tel: E-mail: yuqin_ke@163.com。 收稿日期: 2010-01-06, 修回日期: 2010-02-27。

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中国农学通报 http://www.casb.org.cn 累了甘露醇和山梨醇。与未转基因对照相比, 转基因 植株耐盐性明显提高。 1.2 功能蛋白相关基因 LEA 基因是在种子成熟和发育阶段表达的基因, 称为晚期胚胎发生丰富蛋白基因, 在种子发育过程中 的胚胎晚期引起 LEA 蛋白的高度富集。在植物受到 盐胁迫后造成脱水的营养组织中也有所表达。LEA 基因表达与植物的环境胁迫成正相关。在胁迫条件 下, LEA 蛋白对植物细胞起保护作用。在 ABA 和盐诱 导下, LEA 蛋白在耐盐的水稻根部有积累而在盐敏感 品种中没有积累 [11]。Xu 等人 [12] 将大麦的 LEA-2 基因 HVA1 转入水稻, 转基因水稻获得高耐盐性。 钙依赖/钙调素不依赖的蛋白激酶(OsCDPK7)是 一种依赖于 Ca2 + 的参与寒冷与盐胁迫的正向调节因 子。已有资料报道 OsCDPK7 在根的中柱和花冠维管 束中大量表达, 同时, 该基因也在花冠维管束鞘以及根 的 厚 壁 组 织 中 表 达 。 Saijo 等 [13] 制 备 了 过 量 表 达 OsCDPK7 基因的转化体, 转化体中加入了花椰菜病毒 35S 启动子, 证实了上述结果。 OsbZIP23 是水稻亮氨酸拉链转录因子家族成员 之一, 为研究其功能和细胞内的定位, Xiang 等[14]将其 转化酵母细胞, 发现 OsbZIP23 作为转录激活因子而发 挥功能。用 OsbZIP23-绿色荧光蛋白在洋葱(Allium

1.1.1 脯氨酸 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸, 分布最 广的渗透调节剂。它不仅作为渗透调节剂降低细胞质 的水势, 维持胞质的水分状况, 还是一种保护剂, 使胞 内大分子物质免受盐离子的毒害 。而且还参与氮代 谢和能量代谢 。 P5CS(2-氢吡咯-5-羧酸合成酶)基因是一个双功能 基因, 编码γ-谷氨酰激酶(γ-GK)和谷氨酸-5-半醛脱氢 酶(GSA)两种酶, 催化从谷氨酸合成脯氨酸的最初两 步反应。Anoop 等 成功地把 P5CS 基因转入水稻中,
[4] [3] [2]

并发现转基因水稻植株表现为较好的根生长和较高的 生物量。 1.1.2 甜菜碱 甜菜碱(GB)是生物界广泛存在的细胞 相容性物质, 作为细胞的渗透调节剂, 发挥平衡液泡中 水势的功能, 并对细胞内大分子物质起保护作用, 从而 维持细胞正常的生理功能。盐胁迫下, 水稻细胞中会 大量积累 GB, 以维持细胞内外的渗透平衡, 其积累水 平与植物抗胁迫能力成正比。其合成途径是由胆碱经 由甜菜碱醛生成甜菜碱, 需要胆碱单氧化酶(CMO)和 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化 。 Shirasawa 用农杆菌将菠菜(Spinacia oleracea)的
[6] [5]

CMO 转化水稻, 结果发现: 转基因水稻 GB 含量增加, 而且提高了对盐胁迫、 温度胁迫的耐受性。Su 等[7]制备 了几种产 GB 的转基因水稻。在这些转基因水稻中, 分 别使用了 ABA-诱导的启动子(SIP)和泛素蛋白(UBI) 基因启动子, 使胆碱氧化酶基因(COX)与叶绿体打靶 序列(TP)融合表达。发现应用 SIP 的种系的 GB 水平 (2.60 μmol/gDW)不如 UBI 种系的高(3.12 μmol/gDW)。 因此, 应用 ABA-诱导启动子在 GB 的初始生产方面并 不合适。但是, 种系在盐生长环境中提高了 GB 的 SIP 积累达 89%, 然而 UBI 种系只有 44%。尽管 GB 浓度 较低, 但在统计学上发现, 种系比 UBI 种系能够产 SIP 生更强的胁迫耐受水平, 暗示在 SIP 种系中发现的胁迫 保护不能完全用所增加的 GB 含量来解释。 而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)对植物细胞中甜菜碱 的合成和积累有直接的作用。1990 年 Weretilnyk 等 [8] 从菠菜中首次克隆了 BADH 的 cDNA。郭岩等 [9] 应用 基 因 枪 法 将 含 盐 生 植 物 山 菠 菜 (Atriplex hortensis) BADH 基因的植物双元表达载体导入粳稻中花 8 号中, 得到的转 BADH 基因水稻植株具有较高的耐盐性。 1.1.3 糖醇 糖醇作为相容性溶质在渗透调节和渗透保 护中起重要作用。王慧中等[10]通过农杆菌介导法将 1磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD)基因, 6-磷酸山梨醇脱氢酶 (gutD)基因同时整合进水稻基因组并且在转基因水稻 中得到表达, 气相色谱分析证明转基因水稻合成并积

cepa)细胞中的瞬时表达确定了该蛋白在核内的定 位。同时还发现, 表达 OsbZIP23 的转基因水稻表现出 对干旱、 高盐很强的耐受性以及对 ABA 的敏感性。而 且, 该基因的无效突变体对高浓度的 ABA、 高盐和干 旱胁迫表现出明显的敏感性降低及耐受性降低, 该表 型可通过将 OsbZIP23 转导该突变体而得到弥补, 暗示 其在胁迫耐受的遗传改良方面具有潜在的应用价值。 质外体蛋白在水稻盐胁迫中也扮演了重要角色。 Zhang 等 [15] 用 200 mmol/L 的 NaCl 对 10 日龄的水稻进 行处理, 然后用二维蛋白质电泳对抽提的质外体进行 了分析, 发现其中一个质外体蛋白具有富含半胱氨酸 功能域(DUF26)的胞外结构域——OsRMC。该蛋白 在盐胁迫的初期对盐胁迫的应答提高非常明显。应用 RNAi 技术, 确定了其在转基因水稻盐胁迫应答中的 功能。结果表明, 与非转基因水稻相比, 在转基因水稻 中下调 OsRMC 的表达水平能够使种子发芽缓慢、 生 长抑制情况得到缓解, 同时提高了水稻对 NaCl 盐胁迫 的耐受性。 1.3 Na+/H+反向转运蛋白基因 Fukada[16]等首次从单子叶植物水稻中克隆得到了 水稻液泡膜 Na+/H+逆向运输蛋白基因 OsNHX1。为确

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定 OsNHX1 的产物在细胞内的定位, Fukuda 等 [17] 利用 OsNHX1 产物的特异性抗体对其具体定位进行了分 析, 结果发现 OsNHX1 的表达产物定位于液泡膜, 结 果暗示了 OsNHX1 基因编码液泡(Na 、 /H )反向转运 K
+ + +

胁迫应答克隆, Ts2、 这 3 个克隆分别定位于 1、 Ts1、 Ts3 3、 号染色体上。Northern blotting 分析显示在盐胁迫 7 3 h 内 Ts1 和 Ts2 转录水平提高, 并在 24 h 内保持高水 平, 然而 Ts3 的转录水平在 3 h 内达到高峰。 Rabbani[24] 等利用干旱、 寒冷、 高盐处理的水稻植 株 cDNA 文库, 建立了 cDNA 微阵列, 微阵列中包含了 1 700 种 cDNA。最终他们鉴定了 73 个胁迫诱导基因, 其中包括了 58 个新的未见报道的基因。其中, 36、 第 62、 和 43 号基因分别是由寒冷、 57 干旱、 高盐和 ABA 诱导表达的。发现, 胁迫应答基因的表达有很强的相 关性, 而且发现了对上述 4 种处理而应答的 15 个基 因。分析发现, 在因干旱、 ABA 和高盐胁迫而产生的 信号路径之间有很强的相关性, 该相关性比因寒冷、 ABA 胁迫或寒冷与高盐胁迫所引起的信号相关性 强。同时转录组分析显示, 水稻中存在与拟南芥中不 同源的胁迫诱导基因。 李子银等[25]利用差异显示 PCR(RT-PCR)技术从水 稻中克隆了 2 个受盐胁迫诱导和 1 个受盐胁迫抑制的 cDNA 片 段 , 别 代 表 了 S- 腺 苷 蛋 氨 酸 脱 羧 酶 分 (SAMDC)基因、 水稻翻译延伸因子 1A 蛋白(eEF1A)基 因家族中的新成员(称为 REF1A)以及一个功能未知的 新基因(命名为 SRG1)。进一步利用 RT-PCR 技术克隆 了 SAMDC 基因的全长 cDNA 序列(SAMDC1), 发现该 基因序列与其他植物及酵母、 人类的 SAMDC 基因均 有一定的同源性。Northern 杂交结果显示, SAMDC1 和 REF1A 基因的转录均明显受盐胁迫诱导, SRG1 而 基因的转录在盐胁迫 6 h 后即受到抑制。Southern 杂 交分析表明 SAMDC1 和 SRG1 基因在水稻基因组中 均以单拷贝存在, REF1A 基因则检测到多个拷贝。 而 利用 ZYQ8/JX17 组合构建的 DH 群体和 RFLP 图谱将 REF1A, SAMDC1 和 SRG1 基因分别定位在水稻第 3, 第 4 和第 6 染色体上。 Lin 等 [26] 通过用高度耐盐水稻品种与感盐品种构 建的群体和分子标记进行耐盐 QTL 的定位分析, 共定 位得到 11 个控制水稻耐盐性状的 QTL。发现其中有 2 个是遗传效果较大的主效 QTL, 一个是位于第 1 号染 色体、 控制盐胁迫下 K + 含量的 SKC1, 它通过增加 K + (营养元素)含量而有助于增加耐盐性; 另一个是位于 第 7 染色体、 控制 Na+含量的 SNC7, 它通过降低 Na+含 量而有助于增加耐盐性。Ren 等[27]成功克隆了与水稻 耐盐相关的数量性状基因 SKC1, 并阐明了该基因的 生物学功能和作用机理。发现 SKC1 编码的蛋白是钠 离子的特异性转运蛋白而不直接运输钾离子, 钾离子 含量的变化是由于钠离子竞争引起的; 该蛋白定位于

体。高浓度的 NaCl 和 KCl 处理都可以提高 OsNHX1 在水稻根和地上部的 OsNHX1 的转录, OsNHX1 受盐 和甘露醇处理诱导表达, 过量表达 OsNHX1 可以提高 水稻的耐盐性 。 Ohta 利用耐盐植物野滨藜(Atriplex fera)的液泡
[18] [17]

膜逆向转运蛋白 AgNHX1 过量表达, 提高转基因水稻 的耐盐性。液泡膜上的 OsNHX1 在将 Na 以及积累于
+

细胞质中的 K 运送到液泡的区室化过程中扮演了重
+

要的角色, 说明反向转运体的数量是决定水稻盐胁迫 的重要因素。Kader 等 [19] 研究发现 OsHKT2(K +/Na + 共 转运体)和 OsVHA(盐胁迫下液泡 Na /H 反向转运体的
+ +

激发器)的诱导多数发生于韧皮部、 韧皮部到叶肉细胞 的过渡部分和叶片的叶肉细胞。邱生平等
+ [20]

通过

RT-PCR 技术从水稻幼苗组织中克隆了一个新的 Na +/ H 逆向转运蛋白基因 OsNHX2, 结果表明, 水稻 2 个液 泡膜 Na /H 逆向转运蛋白基因 OsNHX2、 OsNHX1 在
+ +

盐敏感程度不同的水稻品种中表达有所不同, 液泡膜 Na /H 逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定水稻
+ +

耐盐能力的一个重要因素。 1.4 其他基因 Katsuhara 将大麦的 HvPIP2;1 基因转入水稻, 得
[21]

到转基因水稻。HvPIP2;1 的过量表达提高了水稻根 的保水性达 140%, 茎杆到根的达到 150%。使得生长 在 100 mmol/L NaCl 盐胁迫下的转基因水稻, 生长速 度大于非转基因植株。 Hu[22]通过研究展示了胁迫应答基因 SNAC1 的过 量表达明显提高了转基因水稻对干旱的耐受性(比对 照组的发芽率高 22%~34%), 这些水稻是生长于大田、 处于极度干旱胁迫的条件下, 且处于发育阶段, 没有表 型变化和产量上的损失。转基因水稻在幼苗期表现出 对干旱和盐的耐受性的明显提高。SNAC1 主要在保 卫细胞中通过干旱诱导表达出来, 编码具有转录激活 活性的 NAM, ATAT 和 CUC(NAC)转录因子。DNA 芯 片分析显示, 在过量表达 SNAC1 的水稻中, 大量胁迫 相关基因表现出上调。数据暗示 SNAC1 在通过水稻 对干旱和盐的耐受方面具有良好的应用前景。 2 耐盐相关新基因的克隆 建立盐胁迫下水稻的 cDNA 文库是筛选盐胁迫相 关基因的最佳方法。Qian 等 构建了盐胁迫下和没有 盐胁迫的水稻 cDNA 文库, 通过差异筛选得到 3 个盐
[23]

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中国农学通报 http://www.casb.org.cn 耐盐性明显提高。 尽管转基因水稻的安全性仍颇具争议, 但是转基 因水稻将会在未来发挥其巨大作用。华中农大作物遗 传改良国家重点实验室研发的 2 个转基因水稻品种 “华恢 1 号” “Bt 汕优 63” 已获得农业部下发的转基 和 , 因 水 稻 生 产 应 用 安 全 证 书。安 全 证 书 的 有 效 期 为 2009 年 8 月 17 日—2014 年 8 月 17 日, 种植区域限定在 湖北省[31]。这意味着未来 3~4 年间转基因水稻将进入 商业化生产应用, 在未来加强转基因的基础研究工作、 转基因技术与常规育种技术的有机结合, 转基因水稻 的商业化生产。将来, 一定能克服并解决因土壤盐碱 化而带来的水稻种植问题甚至整个世界的粮食问题, 为人类造福。 参考文献
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细胞膜上, 在耐盐水稻品种中其功能活性明显强于感 盐品种。这对水稻耐盐遗传育种研究有重要的学术意 义和一定的应用前景。 HAL3 是前人在筛选酵母耐盐基因的过程中分离 克隆的抗逆相关基因, 研究发现其编码一种促进细胞 分裂以及提高耐盐性的核黄素蛋白, 其过量表达不仅 可以提高植物的耐盐性, 还可以加速植物的生长。 Sun 等 对水稻中 HAL3 同源基因 OsHAL3 开展了功
[28]

能和作用机理研究发现, 这一基因介导了一个与普通 光受体模式不同的光控发育机制。这是第一次发现 HAL3 扮演细胞分裂信号传导的角色。 Huang 等 通过图位克隆方法分离克隆了控制抗
[29]

逆 性 状 的 基 因 DST, 基 因 编 码 一 个 只 含 有 一 个 该 C2H2 类型锌指结构域的蛋白。过氧化氢是一种重要 的诱导气孔关闭的信号分子。DST 作为抗逆性的负 调控因子, 当其功能缺失时可直接下调过氧化氢代谢 相关基因(如过氧化物酶基因)的表达, 使清除过氧化 氢的能力下降, 从而增加过氧化氢在保卫细胞中的累 积, 促使叶片气孔关闭, 减少水分蒸发, 最终提高水稻 的抗旱耐盐能力。 3 问题与展望 水稻基因组测序的完成是水稻研究的一个里程 碑, 使人类在基因组水平上对水稻有了更深入地了解, 使得一些传统的学说、 假说受到挑战, 但这并不意味这 所有问题能够迎刃而解。植物的耐盐机理较复杂, 从 植株水平到细胞水平、 分子水平, 涉及信号传递、 基因 调控、 蛋白质翻译与表达等一系列复杂的体系。至今 尚未能完全弄清楚。国内外学者从不同的角度去研 究、 分析与水稻盐胁迫有关的机理, 已经取得了很大的 进步。近年来进行了植物耐盐胁迫功能基因组的研 究 , 利 用 盐 胁 迫 特 异 性 的 表 达 序 列 标 签 (EST) 和 即 cDNA 微阵列(或基因芯片)技术筛选胁迫相关基因, 然 后在拟南芥中超量表达或通过基因敲除等技术对初步 筛选的基因进行功能研究, 再利用酵母双杂交等技术 对基因间相互关系及基因产物间的相互作用做进一步 研究[5]。 水稻耐盐性状是数量性状, 不仅仅是某个基因在 单独发挥作用, 可能是几个基因或更多基因起作用的 结果。因此, 采用复合基因策略有利于获取高度耐盐 转基因植株。郭龙彪等[30]采用双价基因共转化和杂交 选育的方法聚合了 2~5 价的耐盐基因, 得到了不同耐 盐能力的转基因植株。王慧中等[10]通过农杆菌介导法 将 mtlD、 gutD 基因同时整合进水稻基因组并且在转基 因水稻中得到表达, 与未转基因对照相比, 转基因植株

陈 煜等: 水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展
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+

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导、蛋白修饰和转录调控、细胞活性调控”分子机 制四个层次的研究:鉴定、克隆...阐明 TaSRO1 水稻耐盐相关基因/QTL;构建野 调控耐逆及促进植物生长的相关 生...
水稻耐盐指标的测定方法
水稻耐盐相关基因的克隆及... 5页 免费 盐胁迫下水稻发芽特性和幼... 2页...转基因耐盐水稻研究进展 暂无评价 7页 免费如要投诉违规内容,请到百度文库投诉中心...
转基因技术在我国农业上的应用
在我国转基因水稻、棉花、玉米等作物已大面积种植,...(gutD) 等与耐盐相关基因,通过遗传转化获得了耐 ...[7]杨支才,周倩明.(2003)转基因水稻研究进展.湖南...
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