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野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析


第2 卷 第1期 0 V l2 , o 1 o .0 N .

草 业 学 报 A TA P A C L C   R TA U TUR ES N C A  I I A

1 1-1 9 3 3    21 年2月 01

野生大豆盐胁迫响应基因 G P P 的 sI 克隆及其序列分析
王希1, 李勇 , 柏锡 , 才华 , 纪巍 , 朱延明 *
( 东北农业大学生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨 1 0 3 ) 500

摘要: 盐胁迫是影响植物生长、 发育以至产量的重要 因 素, 生 大 豆 是 优 良 的 非 生 物 胁 迫 抗 性 材 料 , 天 然 的 优 质 野 是 利用东北农业大学植物生物工 程 研 究 室 已 获 得 的 基 因 芯 片 杂 交 抗性基因库。本研究以耐盐东北野生大豆为试材, 结果, 对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫 E T 数据库中各 E T 在胁迫下的表达情况进行了分析, 中 从 S S 低温、 干旱 胁 迫 早 期 均 上 调 表 达 的 3 -E T, 列 分 析 表 明 该 E T 编 码 质 膜 结 合 蛋 白 (ls a 选出了 1 个在高盐、 ′ S 序 S pa m 通 i i c m jr nr s poen I 家 i i c ′ m m rn  t ni rti , I ) 属于主嵌入蛋白( ao  t ni rti ,M P) 族; 过 电 子 克 隆 和 改 进 的 5- e ba e nr s poen P P , 其翻 译 产 物 与 含 羞 草 质 膜 结 合 蛋 白 的 相 似 性 为 9 , 该 基 因 命 名 为 G P P。 R C 获得了基因完整的编码区; A E 0% 将 sI 无 与 G P P 基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的 跨 膜 结 构 域, 信 号 肽, 已 发 现 的 植 物 P P 蛋 白 一 致。 本 sI I 研究获得的基因具有自主知识产权, 通过进一步的功能分析, 可为耐渗透胁迫基 因 工 程 研 究 提 供 基 因 资 源 , 为 植 并 物耐渗透胁迫机理研究提供依据。 关键词: 野生大豆; 盐胁迫; 主嵌入蛋白( I )G P P; -R C M P ;s I 5 A E ′ 中图分类号:5 5.0 ; 9 3. S 6 1 3 Q 4 2   文献标识码: A   文章编号:0 45 5 (0 1 0 - 1 10 1 0 - 7 9 2 1 )10 3 - 9

1 影响植物的产量和品质 [-3]。通过基因工程手段改良植物的耐胁迫能力   高盐等非生物胁迫会限制植物生长,

45 已成为一种高效的途径 [ , ]。寻找胁迫抗性基因是植物耐胁迫基因工程的首要任务。东北野生大豆(lcn   - G yie o s

其中的大部分基因尚未被克隆和分析, 是克隆耐胁迫基因的理想材料。 a 具有丰富的耐逆基因资源, j ) 主嵌入蛋白( ao nrni rti ,M P) m jr t s poen I 旧称水通道蛋白( ae h n e rti 或 a u p rn AQ ) 主 i i c w trc a nlpoen q a oi , P , 要包括液泡膜结合蛋白( n pat nrni rti ,T P) 质 膜 结 合 蛋 白 (ls a m m rn nrni rti , t ols it s poen I 和 o i i c   i c pa m   e ba e t s poen 从 形 水 P P) I 两大类。其中,I 控制着质膜内外 的 水 分 运 输, 而 参 与 植 物 的 生 长 发 育、 态 保 持、 分 调 节 等 多 种 过 PP 程。目前, 在多种植物中都已发现了 M P 家族基因。植物的 M P 控制着水分在膜上的快速运输, 并可透过其他 I I
6 3 小分子, 在胁迫反应中有可能参与细胞的水分状态调节过程, 以及某些小分子物质的区隔化过程 [-1 ]。

虽然关于 M P 类蛋白质对植物的耐胁迫能力影响的研究较少, I 在植物胁迫反应中的具体功能尚不是很 I MP 清楚, 但已有一些研究 证 明 M P 基 因 在 渗 透 胁 迫 后 表 达 量 上 调, 明 它 们 很 可 能 参 与 植 物 的 胁 迫 反 应。Jn 表 I ag
[5] 1 等 [4]对拟南芥(r bd pi  ai n ) 多 A ai o s t la a 的研究 结 果 显 示, 个 M P 基 因 都 在 胁 迫 后 上 调 表 达。 H 等 1 从 苹 果 sh I u

( au   ml ) 其表达量在渗透胁迫下的茎中上调, 可能在胁迫条件下水分动态 平 衡 u M lsp ia 中分离了 2 个 P P 基因, I
1 的保持中起重要作用。G o 等 [6]分离了若干水 稻 P P 基 因, 量 表 达 水 稻 (r z   tv )I 基 因 的 转 基 因 拟 超 u I O y a aia P P s

南芥对干旱胁迫和中等强度的盐胁迫 的 耐 性 有 所 提 高。Jn 等 [7]将 拟 南 芥 P P 基 因 转 入 拟 南 芥 及 烟 草 ( i - ag 1 I Nc

o a a a au ) 转基因植株对不同胁迫的反应发生了不同的变化。 t n   bc m , i t
东北农业大学植物生物工 程 研 究 室 前 期 已 建 立 了 耐 盐 东 北 野 生 大 豆 的 表 达 序 列 标 签 (x rse e u ne e pesdsq e c
[8] 低 干 tg E T) 并 借 助 大 豆 基 因 表 达 分 析 芯 片 获 得 了 该 品 种 野 生 大 豆 在 高 盐、 温、 旱 早 期 的 基 因 表 达 谱 1 。 a , S 库,

本研究从中发现了 1 个在多种胁迫早期上调表 达 的 P P 类 3 - S , 过 电 子 延 伸 和 5 -R C 克 隆 了 其 全 长 序 I ′E T 通 ′ A E 列, 并通过生物信息学手段对获得的序列进行了分析, 表明该基因与已知的 P P 基因在序列上有一定的差异, 是 I
2 1 - 21 ; 2 1 - 52 * 收稿日期:0 00 - 0 改回日期:0 00 - 4 基金项目: 国家 科 技 部 重 大 基 础 研 究 前 期 研 究 专 项 (0 3 C 0 5 0) 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (0 7 0 9) 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 20 C A 30 , 3415 和 (0 7 1 Z 9 ) 2 0 AA 0 1 3 资助。 作者简介: 王希(9 4 ) 女, 博士。E-m i: g w@1 3. m 1 8 - , 黑龙江黑河人, a l o la 6 c o a y z u 0 1@ht a . m l o mi c l o * 通讯作者。E-m i:m h 2 0

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一个全新基因, 具有潜在的抗性功能; 通过后续的研究, 分析基因在植物耐渗透胁迫反应中的作用及其调控机制, 将丰富耐胁迫分子育种的基因资源, 并为植物耐胁迫机理的研究奠定理论基础。 1  材料与方法 1. 试验材料 1  野生大豆品种为耐盐材料 5 1 9。野生大豆盐胁迫 E T 数据库由东北农业大学植物生物工程研究室构建; 00 S
1 野生大豆在胁迫下的基因 表 达 量 通 过 与 Af m t x 大 豆 基 因 表 达 分 析 芯 片 杂 交 获 得 [8]。 大 肠 杆 菌 为 DH α fy er i 5。

常规化学试剂购自北京益利公司, 分子生物学试剂购自 T kr 公司, MAR 逆转录酶 P w rcit购自 T k - a aa S T o esr aa p r - D 公司。 aB 模板转换引物 S MAR Ⅳ Oio uloie序列: T l nc t e d g AAG AG G TAT AA G AGAG G C AT C G C G C T G C C C T G C TA G C G G 根据模板转换引物设计的 5- 锚定引物( - n h rpi es 5 -A ) ′ 5 a c o rm r , ′ P : ′ 5 -A   : ′ P1 AAG AG G TAT AA G AGAG C T G C C C T 5 -A   : T G ′ P2 G G TAT AA G AGAG G C C C C T G 5 -A   : G C TA G C G G ′ P3 G C AT C G C G 1. 渗透胁迫应答 M P 类 E T 的筛选 2  I S 利用 Af m t x 大豆芯片分析野生大豆 E T 在 不 同 胁 迫 早 期 的 表 达 变 化 情 况, 步 确 定 野 生 大 豆 中 胁 迫 初 fy er i S 对 确 早期( ) 1h 应答的 E T ; 据 芯 片 探 针 的 注 释 信 息, 这 些 E T 进 行 初 步 筛 选, 定 可 能 属 于 膜 结 合 蛋 白 的 Ss根 S 将 ET; S s 再利 用 T EMB / I SP O 和 G n a k 数 据 库, 这 些 E T 序 列 在 美 国 国 立 生 物 信 息 中 心 ( h r L SW S - R T eBn S Te 进 N t nlC ne o  itc nlg no m t n N B ) 站 上 利 用 “lsX” 序 进 行 相 似 性 比 对, 一 步 推 断 a o a etr rBoeh oo yIfr a o , C I 网 i f i Bat 程 确定候选的 P P 类 E T 。芯片杂交及 E T 库构建完成于 2 0 年 [8], E T 功能, S I Ss S 0 5 1 目的 E T 的筛选完成于 2 0 S 06 年。 1. 目的基因/ S 的序列分析 3  ET 用目的序列利用“lsX” 推 并 Bat 程序进行相似性比 对, 断 E T 所 代 表 基 因 的 功 能, 根 据 比 对 结 果 判 断 编 码 区 S ( dn  e u ne C S 完整性。对于断定已包含完整 C S 的 序 列, “ R   n e ” 序 再 次 分 析 开 放 读 码 框 用 O Ff dr 程 c igsq e c , D ) o D i (p nraigfa e O F) o e  edn  m , R 的完整性。 r 1. 4 E T 的电子延伸 S 用目的 E T 序列与 G n a k 中的野生大豆 E T 利用 Bat 程序进行相似性比对, 下载与之匹配的序列, S eBn S ls N 用D 的 s u neas m l 工 导 NAm n ( e . 0.0, y n nBoot公司开 发) “ q e c se by” 具 进 行 序 列 拼 接, 出 拼 接 结 a V r 6. 4 L n o  isf e 通过 Bat 程序进行相似性比对以判断 C S 完整性, 若不完整, 则再用最靠近 C S 末端的匹配序列与野生 果, lsX D D 大豆 E T 利用 Bat 程序再次比对, 重复比对和 拼 接 过 程, 至 不 再 有 可 延 伸 的 匹 配 序 列。 按 1. 所 述 方 法 直 Ss ls N 6 通过聚合酶链式反应(oy eaec anrat n P R) i pl m rs hi ec o , C 及测序验证电子延伸的正确性。 1. 5 R C 及全长序列的获得 A E 用 Tio 试剂提取经低温、 高盐、 干旱处理的野生大豆幼苗叶片总 R 通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测 r l z NA, R NA 质量。 根据目的基因已知序列设计 基 因 特 异 引 物 (e es ei cpi e ,G P) 其 中 1 条 用 于 逆 转 录 ( 为 G P 称 f S- g n pc i rm r S , 但要保证 R C 所得片段中有足够长的已知 R )2~4 条用于巢式 P R。引物设计位置应尽量靠近未知部分, T , C A E 序列, 以保证序列拼接的正确性。由于无法得知目的基因未知部分是否有引物的非特异性结合位点 , 因此通过预 备试验筛选出不发生严重单引物扩增的 5 -A 和 G P。 ′ P S 以 G P T 起始逆转录并在 c NA 第一链上添加模板转换引物, 再将各 G P 与不同的 5 -A 搭配, 进行巢 S -R D S ′ P 式 P R, C 扩增基因的未知片段。
1 从琼脂糖凝胶中回收 P R 产物条带, 将回收产物与 T 载体连接, 采用 C C2 法 [9]制备并转化大肠杆菌感受 C al 1 态细胞, 用碱裂解法 [9]提取质粒 D 将 NA, 重 组 质 粒 酶 切 鉴 定 结 果 正 确 的 转 化 子 菌 液 送 交 北 京 华 大 基 因 公 司 测

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序。每段序列至少测 3 个转化子, 并进行双向测序。 根据 R C 所得片段的测序峰图, 手动校正测序结果序列, 并去除测序低质量区, D 用 NAm n 将目的 基 因 A E a 已知部分与 R C 所得序列进行拼接, 出 拼 接 结 果。 利 用 1. 所 述 方 法 分 析 测 序 结 果 中 C S 的 完 整 性。 通 导 A E 3 D 过 P R 及测序验证拼接结果。 C 1. 通用模板的制备及序列拼接结果的 P R 验证 6  C 将野生大豆总 R 在逆转录产物两端添加锚定引物序 列, 用 锚 定 引 物 再 NA 以 Oio d ) l (T 为引物进行逆转录, g 对逆转录产物进行长距离 P R( n - itneP R, D P R) 则产物包含样品中所有 mR C l gdsa c   C L - C 扩增, o NA 对 应 的 全 长 , c NA。将产物稀释 1 0 倍作为通用模 板 c NA (nvra c NA) 此 通 用 模 板 用 于 对 各 步 序 列 拼 接 结 果 进 行 D 0 D uiesl D   验证。 在拼接所得序列两端设计验证引物, 对通用模板进行 P R 扩增, 回收目的送交测序, 每段序列至少测 3 个转 C 并进行双向测序。利用 1. 所 述 方 法 分 析 测 序 结 果, 验 证 拼 接 结 果、 析 拼 接 所 得 序 列 中 C S 的 完 整 以 分 化子, 3 D 性、 获得目的片段的确切序列。 以上各步骤涉及的具体操作方法参见文献[9 。全长基因的克隆完成于 2 0 年。 1] 09 1. 基因产物的生物信息学分析 7  利用 Pi e r me 软件( e . 0, r meBoot开发) 将目的基因 C S 翻译成蛋白质。 rm rPe ir V r 5. Pe ir isf D 用目的基因氨基酸序列利用“lsP” 下 用 lsa  Bat 程序进 行 相 似 性 比 对, 载 与 之 匹 配 的 氨 基 酸 序 列, CutlX 软 件 ( e . 8 , uo enBono m t s nt ue开发) 进行多重比对, 用进化树表 示 目 的 基 因 编 码 产 物 与 已 知 同 V r 1.1 E r pa  iifr a c  s tt i I i 类蛋白质的序列相似性。 用D 分子量、 等电点、 亲/疏水性、 跨膜结构域。 NAm n 预测基因产物长度、 a 利用 E I提供的整合了多个数据库的 Itr r Sa 工具, 分析基因产物的保守结构域。 B neP o cn 2  结果与分析 2. 目的 E T 的确定及其电子克隆 1  S 相应芯片探针的 注 释 信 息, 野 生 大 豆 盐 胁 迫 从 2. 1 P E1 2 的电子延伸   根据野生大豆 E T 的表达信息、 1. T - 03 S 高盐和干旱 3 种胁迫下表达量均上调的 E T, T - 03 (e B n : T 8471 , E T 库中筛选出了 1 个在低温、 S S P E12 G n a k D 041 .) 相似性比对结果显示, E T 编码 P P 基因, 该 S 包含基因 C S 的 3 末端。目的基因可命名为 G P P。 I D ′ sI 为获得目的基因 C S5 一侧的未知序列, P E1 2 为种子序列进行了电子延伸。电子延伸在 2 轮后终 以 T - 03 D  ′ 止, 结果见图 1。 经过电子延伸, 获得了 8 4b 的 目 的 基 因 片 段 G P P- - o t 。 该 片 段 与 原 E T 序 列 相 比, 3 端 增 加 在 ′ 6 p s I E C ni S g 了约 9 p, 5 端增加了约 3 0b , 0b 在 ′ 5 p 但仍未到达目的基因 C S 的 5 末端。 D ′

图 1 P E1 2 的电子延伸结果 T - 03 Fg1  nsioe na o    T - 0 3 i . I l   o gt no P E1 2 ic l i f
S : i2 9 7 8; 2: i8 2 8 1; 3: i8 2 7 5; 4: i2 8 8 9; 5: i8 2 6 1; 6: T - 0 3 S : i2 9 7 5; 8: i6 0 0 0 1 g1 4 6 8 S g1 7 9 8 S g1 7 9 8 S g1 4 8 5 S g1 7 8 3 S P E1 2 ; 7 g1 4 0 2 S g2 0 4 1

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2. 2  电子延伸结果的 P R 验证   为验证电子延伸 1. C 结果的可 靠 性, 据 G P P- - o t 设 计 了 验 证 引 根 s I E C ni g 物, 扩增产物约为 7 0b 。 5 p 用 G P P- - o t 的 验 证 引 物 扩 增 通 用 模 板, s I E C ni g 得到了约 7 0b 的目的条带, 如图 2 所示。 回收目的 5 p 条带并测序, 测 序 结 果 与 原 E T 及 G P P- - o - 将 S s I EC n 结果见图 3。 t 序列进行比对, i g 测序结果与电子 延 伸 所 得 序 列 基 本 一 致, 有 若 仅 干处单碱基替 换。 表 明 电 子 延 伸 结 果 G P P- - o - s I EC n 且 t 确为野生大 豆 中 真 实 存 在 的 序 列, 通 过 P R 及 i C g 测序获得 了 其 确 切 序 列。G P P- - o t 未 到 达 目 s I E C ni g 的基因 C S 的 5 末端, 5 末 端 约 4 0b , 要 进 行 距 ′ D ′ 2 p需 5 -R C 以获得目的基因的全长编码区。 ′ A E
图 2 G P P-E ot 的 P R 验证结果 s I -C n g i C Fg2 Vr ia o    s I -E ot  i  C i. ei ct no G P P -C n gwt P R f i f i h
M: L 0 0 分子量标记 D 2 0 akr 1:模板为水 H2Oa D 20 L 0 0m r e ;  s t m lt ; :模板为通用模板 U iesl D  s e pae e pae 2 nvra c NAa  m lt t  

图 3 G P P-E ot 验证测序产物与 P E1 2 的比对结果 s I -C n g i T - 03 Fg3 Ain et fG P P-E ot  ei ct na dP E1 2 i. l m n   s I -C n gvr ia o  n  T - 0 3 o i f i g
S : s I -Ec ni 验证 P Rvria o  fG P P-Ec ni ; 2: s I -Ec ni ; 3:上游验证引物 1 G P P - ot C  eict no  s I f i - ot S G P P - ot S g g g S nepi e   C ; 4:下游验证引物 A t e s rm ro C ; 5: T - 0 3 e s rm ro P R S f ni nepi e  P R S P E1 2 s f

2. G P P 全长序列的获得 2  s I 2. 1  通 过 5 -R C 获 得 未 知 部 分 序 列   根 据 2. ′ A E

G P P- - o t 序 列 可 靠 部 分,设 计 了 用 于 5- s I E C ni ′ g
R C 的 G P 共 5 条,其中 G P T1 条,用于巢式 A E S S -R   按其 结 合 位 点 距 C S5- 末 端 距 离 P R 的 G P4 条, C S  D  ′ 由远到近, 依次 称 为 G P S 1~G P 。 通 过 预 备 试 验 淘 S4 汰了 5 -A 1 5 -A 2 和 G P , 5 -A 3 与 G P 、 ′ P 、′ P S3 将 ′ P S1 通 G P 、 S 4 搭配, 过 半 巢 式 P R 进 行 了 目 的 基 因 S2G P C 的 5 -R C , ′ A E 各轮 P R 结果见图 4。 C 根据引物 设 计 位 置 及 G P P- - o t 序 列 分 析 s I E C ni g 结果, 从各轮 P R 所得条带长度上推断, 各轮 P R 所 C C 且 得的主带均为目的片 段, 各 对 引 物 扩 增 所 得 的 条 带 已到达目的 O F 的 5 末端。 为得到较长序列以便于 R ′ 回 R C 后的序列拼 接, 收 了 G P A E S 1+5 -A 3 的 扩 增 ′ P 产物送交测序。 2. 2 G P P 全 长 序 列 的 获 得  G P P- - o t 2. sI s I E C ni g 序列与 R C 所得序列 的 拼 接 结 果 见 图 5, 拼 接 所 用 A E 得序列进行相似性比对, 结果见图 6。
图 4 G P P5 -R C 各轮半巢式 P R 结果 sI ′ A E C Fg4 Rsl    e e  C   at n   s I 5 -R C i. eu so ns dP Rr c oso G P P ′ A E t f t e i f
M: L 0 0 分子量标记 D 2 0 akr 1:引物为 5 -A 35 -A 3a D 20 L 0 0m r e ; ′ P  ′ P s S 1G P spi e ; S 1+5 -A 3 ′ P rm r 2 pi e ; :引物为 G P S 1a rm r 3:引物为 G P GP S 1+5 -A 3a rm rpi ; :引物为 G P ′ P spi e a 4 S 2+5 -A 3G P ′ P S 2+ r 5 -A 3a rm rpi ; :引物为 G P ′ P spi e a 5 r S 4+5 -A 3G P ′ P S 4+ 5 -A 3a rm rpi ′ P spi e a r

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图 5 G P P R C 所得序列与电子克隆所得序列的拼接结果 sI A E Fg5 Ain et   s I R C   sl a dG P P-E ot i. l m nso G P P A Er u  n  s I -C n g f e t i g
S : s I -E ot 验证结果 V ridG P P-Ec ni ; 2: C 所得序列 RA Ersl ; 1 G P P -C ni eie  s I f C  eu t - ot S RA E g g P : S 1; 2: S 2; 3: S 3; 4: S 4; 5: ′ P 1 G P P G P P G P P G P P 5 -A 3

图 6 G P P 拼接所得序列的相似性比对结果 sI Fg6 T eBat   sl    s I - se b d i. h  lsXr u so G P Pas m l e t f e

   相似性比对结果表明拼接所得序列包含目的基因 的完整 C S, D 将该基因命名为 G P P。 sI 在所 预 测 的 C S 两 端 设 计 全 长 验 证 引 物, 过 通 D 扩 P R 验证了 R C 结 果 的 可 靠 性, 增 结 果 见 图 7。 C A E 回收了约 10 0b 的目的条带, 送交测序。  0 p 用 G P P 全长验证 P R 产物的测序结果进行相 sI C 似性比对及开放读码框分析, 结果见图 8 和 9, 明 经 表 电子 延 伸、′ A E 和 序 列 拼 接 已 得 到 了 G P P 基 5 -R C sI 因的完整编码区序列, 并通过全长验证 P R 获得了基 C 因的完整编 码 区 片 段 及 其 确 切 序 列。G P P 基 因 编 sI 码区序列的 G n a k 登 录 号 为 F 8 5 6 。 该 基 因 编 eBn J2 7 6 码产物与已 知 的 P P 类 基 因 所 编 码 的 氨 基 酸 序 列 相 I 似度不超过 9 , 0% 是一个全新的基因。 2. G P P 蛋白产物的生物信息学分析 3  s I 将所得的 G P P O F 序 列 翻 译 成 蛋 白 质, 其 对 sI R 进行生物信息学分析, 以分析蛋白产物 G P P 的性质。 sI 图 0。 2. 1 G P P 与已知 M P 的比较   按 1. 所 述 方 法 分 析 了 G P P 与 已 知 各 M P 序 列 的 相 似 性 ( 1 ) 与 3. sI I 7 sI I 其中, 相似性最高的 3 个序列均为豆科植物的 P P, G P P 相似的 P P 大都属于 P P 类, sI I I2 I 而相似性相对最低的是 玉米中的 P P。 I
图 7 G P P 全长验证 P R 结果 sI C Fg7 Fllnt ei ct no s I wt  C i. u - eghvr ia o   G P P i P R l f i f h
M: L 0 0 分子量标记 D 2 0 akr 1:模板为水 H2Oa D 20 L 0 0m r e ;  s t m lt ; :模板为通用模板 U iesl D  s e pae e pae 2 nvra c NAa  m lt t  

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图 8 G P P 全长验证所得序列的相似性比对结果 sI Fg8 Bat    s I fllnt ei ct n i . lsXo G P P u - eghvr ia o f l f i

图 9 G P P 全长验证所得序列的开放读码框分析结果 sI Fg9 O Ff dn   s I fllnt ei ct n i. R   nigo G P P u - eghvr ia o i f l f i

2. 2 G P P 蛋白的物理性质分析   根据 D 3. sI NAm n 的分析结果, s I 蛋白长度为 2 4a , a G PP 8 a 分子量约3  9 6 03 4. D, a 预测等电点为 8.1, 3 具有 6 段高度疏水 的 跨 膜 区 域。 已 发 现 的 植 物 P P 类 基 因 的 编 码 产 物 等 电 点 大 都 在 9 I 左右, 只有水稻中的 O P P - 等电点约 7.9, s I 22 4 大豆 P P 的 等 电 点 约 8.9。 等 电 点 的 差 异 有 可 能 使 G P P 与 其 I 2 sI 他 P P 在功能或调控上存在差异。 I 结果见图 1 。G P P 具有 M P 2. 3 G P P 保守结构域预测   利用 Itr r Sa 工具分析 G P P 的结构域, 3. sI neP o cn sI 1 sI I — , , 家族的保守结构域— —6 段跨膜结构( 图中第 2 行) 以 及 M P 保 守 序 列 N A 盒 ( 中 第 6 行) 且 不 含 信 号 肽, 图 I P 均与已报道的 P P 类基因一致。 I 3  讨论 近年来分子生物学与植物基因工程迅速发展, 技术也日趋成熟, 通过分子育种提高作物的胁迫耐性成为培育 耐逆作物品种的一种越来越有效的手段。然而, 可用于作物耐胁迫基因工程的基因资源比较缺乏。获得充足的、 具有独立知识产权的基因资源, 是进行作物分子育种的重要前提。植物对胁迫的耐受反应分子机制比较复杂, 且 研究基础并不丰富, 已知的能提高植物胁迫耐受性的基因种类非常有限, 如何从大量的转录本中筛选出与胁迫关 系比较密切的基因, 是基因资源挖掘中的一个关键问题。 本研究以具有丰富耐逆基因资源、 且已有基因信息较少的耐盐东北野生大豆为试材, 利用野生大豆与栽培大 豆进化上和序列上的同源性, 借助商品化的大豆表达分析芯片分析 野 生 大 豆 E T 的 表 达 情 况, 选 择 在 胁 迫 早 并 S 期表达量上调的 P P 基因进行 了 克 隆 和 研 究。 本 研 究 所 获 得 的 P P 基 因 是 一 个 全 新 的 基 因, 有 独 立 知 识 产 具 I I 权, 且基因与胁迫有较密切的关系, 很有可能提高转基因植物对胁迫的耐性。 3. 1 G P P 在 M P 蛋白家族中的地位 sI I 根据 G P P 的 E T 序列及完整编码序 列 的 相 似 性 比 对(lsX) 果, 及 G P P 氨 基 酸 序 列 的 相 似 性 比 以 sI S Bat 结 sI 对(lsP) 可确定编码产物属于 M P 家族的 P P 类, 即结合于原生质膜的水通道蛋白类。 Bat 结果, I I 可 G P P 与豆科植物 P P 氨基酸序列的相 似 性 高 于 与 禾 本 科 植 物 P P 的 相 似 性, 见 物 种 间 该 基 因/蛋 白 质 sI I I 序列的相似性与物种间的进化关系有一定的相关性。

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图1 0 G P P 与已知 M P 蛋白的进化树 sI I Fg1 i .0 P yoee c reo s I  n   hr M P hlgnt   e  G P Pa do e   I s it f t
P lcn m x p tt e w trc a nlpoen S AQ 2 P   a a e   a  q a oi a n i  GmAQ :大豆水通道蛋 白 G yie a  ua v   ae h n e rti ; s P :雨 树 AQ 2S m nas m n a u pr ;M P P ; : 羞 草 pI2 3 含

u P P ;  i oap dc  I 2; ; c I 22:西洋梨 P P -   y u   mm nsP P - ; t I 2; :拟南芥 P P ;  .hla aP P ; ; v I 2; : I 2 3 M m s   ia P P 3 P P P - I 22P rs o ui I 22 A P P 5 c I 2 5A tain I 2 5 V P P 4 葡萄
P P ; i svnfr   I 2; ; M M p :冰 叶 午 时 花 M p   ee by nh m m  ytl n m  i C;R P P - :山 杜 鹃 P P -   h d dn rn I 2 4Vt   i ea P P 4 i i c iC i C M s m r ate u c sal u M p r i c I 21 I 21 R o o e do

ct w ine P P - ; c I 21:西洋梨 P P -   .o ui I 21;Am I :黄芪 P PAta au   m r n cu  I ;V P P ; : 萄 P P ;  . aa bes I 21 P P P - I 21P c mm nsP P - PP I  s g lsm ba aes P P v I 2 3 葡 r e I 2 3V vnfr  I 2; ;M M P: ii ea P P 3 t I 蒺藜苜蓿 M P M dc g   u ctl   I ;G P P :棉 花 P P   os pu   ruu P P ;A P P A: 南 芥 P P A A. I   e ia o r naua M P h I 2 t I 2G sy i mh st m I 2 t I 2 拟 i I2 tain  I 2 ; s AQ :萝卜质 膜 水 通 道 蛋 白 2 R p a u   tv s pa m   e ba ea u pr   ;B P P :油 菜 P P   rs c   p s P P ; hla a P P A R P 2 s n I 1 B as an u   I 1 i a   a h n s aiu  ls a m m rn q a oi 2 n I 1
R PP b s I 2 :萝卜 P P bR.aiu  I 2 ; s I 2 :萝卜 P P cR.aiu  I 2 ; n I 2:油 菜 P P   . a u  I 2;A P P B: 南 芥 P P B A. I2 stv sP P b R P P c I2 stv sP P c B P P I 2B n p sP P tI 2 拟 I2

tain  I 2 ;A P P C:拟南芥 P P CA.hla aP P C; g I 2:粉蓝烟草 P P   . luaP P ;M M p :冰叶午时花 M p M .r sal - hla a P P B t I 2 I2 tain I 2 N P P I 2N ga c I 2 c i H iH cytl i n m M p ; c P :桐花树 AQ 2A gcrs onclt m AQ 2; r P:甜叶菊 AQ   ei  b u in   P; e I :橄榄 P POe   r p e u i H A AQ 2 P  e iea  riuau c P S AQ PS va ea da a AQ O P P t r I  la uo aa e
P P;V P P : I v I 2 葡萄 P P   . ii ea P P ; r I 2; :胡桃 P P ; u ln   ga P P ; ; r I 2; :胡桃 P P ;  .e i  I 2; ; m I 21: I 2V vnfr  I 2 JP P 2 I 2 2J gas e i  I 2 2 JP P 1 r I 2 1J rgaP P 1 Z P P - 玉 米 P P -   . a sP P - ; m I 22:玉米 P P -   . a sP P - ; m I 24:玉 米 P P -   . a sP P - ; m I 23:玉 米 P P -   . a s I 21Z m y  I 21 Z P P - I 22Z m y  I 22 Z P P - I 24Z m y  I 24 Z P P - I 23Z m y PP - I 23

在许 多 植 物 中 都 存 在 不 止 一 种 P P, 成 一 个 蛋 白 质 亚 家 族; 于 氨 基 酸 序 列 相 似 性 比 对 结 果 中 的 匹 配 序 对 I 形 列, 不同的 P P 成员与 G P P 均有一定相似 性, 各 成 员 与 G P P 的 相 似 程 度 差 异 并 不 大, 因 物 种 而 异。 但 且 又 I sI sI 是, 由于相似性最高的序列均属于豆科植物的 P P , I 2 因此可以初步断定本研究所获得的基因编码 产 物 G P P 属 sI 于 P P 亚家族中的 P P 类。 I I2 3. G P P 翻译产物的结构及物理性质 2  s I 并且具有 M P 高度疏水 G P P 翻译产物 G P P 具有 M P 家族的保守序列以及 M P 特征性的跨膜结构域, sI sI I I I 的性质。与同家族其他成员不同的 是, s I 的 等 电 点 比 大 部 分 已 发 现 的 植 物 P P 蛋 白 偏 低。p 会 影 响 蛋 白 G PP I H
2 质的构象和功能, 且有研究表明水通道的开关受细胞内 p 值的调节 [0], 因此等电点的差异表明, s I 与其他 H G PP

植物的 P P 在蛋白稳定性、 功能或者调控方式上有可能有所差异。 I

18 3

A  I I A 2 1 ) A TA P A C L C   R TA U TUR ES N C (0 1

V l2 , o 1 o .0 N .

图1 1 G P P 的结构域分析结果 sI Fg1 i .1 D m iso s I  rdc db nePocn o an  G P Ppei e  yItr rSa f t

3. 3 G P P 在耐胁迫分子育种及理论研究方面的应用前景 sI 本研究所获得的基因编码产物 G P P 属于 M P 家族, 该家族在水分的跨膜快速运输中起着重要作用, 参与 sI I
6 3 形态保持、 水分调节等多种过程 [-1 ]。 植物的生长发育、

本研究所得基因为耐盐野生大豆中的胁迫诱导基因, 且其编码产物本身的功能也与胁迫反应有相关性, 因此 基因产物很可能会影响植物对胁迫的耐性。目前也有少数研究分析了 M P 类基因对植物胁迫耐性的影响, 不同 I
1 7 不同类型的 M P 基因, 对植物在不同胁迫下反 应 的 影 响 也 不 尽 相 同 [4-1 ]。 野 生 大 豆 中 功 能 已 知 的 胁 迫 相 来源、 I

关基因数量非常有限, 分析该基因对植物胁迫耐性的影响, 有望为耐逆分子育种提供新的基因资源。 目前, 植物的胁迫反应机制也尚未明确, 胁迫的感知、 传导、 调控过程都有待研究。本研究所得基因的表达受 盐胁迫以及低温、 干旱胁迫诱导, 分析其上游序列有希望挖掘到对某种或多种渗透胁迫响应较快的启动子或顺式 作用元件。通过在体内瞬时表达, 或分离蛋白进行体外试验, 分析基因产物所受的修饰、 降解等调控, 有希望发现 则可推断出 一 部 分 胁 迫 信 号 传 导 参与胁迫响应过程的调控蛋白。进一步寻找与这些元件或蛋白互作的蛋白质, 通路, 为植物胁迫反应的分子机理研究提供理论基础。 此外, 还可借助这些调控序列及元件构建植物表达载体卡盒, 使耐胁迫基因在转基因植物受到胁迫的早期即 迅速表达, 以培育胁迫耐性较强的转基因植物品种( , 系) 有助于植物耐渗透胁迫基因工程的研究。 4  结论 本研究通过电子延伸和改进的 5 -R C , ′ A E 从耐盐东北野生大豆中获得了一个响应胁迫的质膜结合蛋白 基因

G P P, s I 基因编码产物与已知的 P P 类蛋 白 的 氨 基 酸 序 列 相 似 度 不 超 过 9 。 基 因 的 翻 译 产 物 具 有 M P 家 族 I 0% I
特征性的跨膜结构域和疏水性质, 无信 号 肽, 已 发 现 的 植 物 P P 蛋 白 一 致。 生 物 信 息 学 分 析 结 果 表 明 G P P 与 I sI 蛋白长度为 2 4a , 通过进一步的功能分析, 8 a 分子量约 3  9 6D , 03 4. a 等电点约 8.1。G P P 是一个全新的基因, 3 sI 可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源, 并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据。 参考文献:
[ ] 刘一明,程凤枝,王齐,等 .四种暖季型草坪植物的盐胁迫反应及其耐盐阈值[] 草业学报, 0 9, 8 3 : 9 - 9 1  J. 2 0 1 ( ) 1 21 9.

第 2 卷第 1 期 0

草业学报 2 1 年 01

19 3

[ ] 秦峰梅,张红香,武祎,等 .盐胁迫对黄花苜蓿发芽及幼苗生长的影响[] 草业学报, 0 0, 9 4 : 17 2  J. 2 1 1 ( ) 7 - 8. [ ] 秦文静,梁宗锁 .四种豆科牧草萌发期对干旱胁迫的响应及抗旱性评价[] 草业学报, 0 0, 9 4 : 17 3  J. 2 1 1 ( ) 6 - 0. [ ] 梁慧敏,夏阳,王太明 .植物抗寒冻、 抗旱、 耐盐基因工程研究进展[] 草业学报, 0 3, 2 3 : - 4  J. 2 0 1 ( ) 17. [ ] 吴金霞,陈彦龙,何近刚,等 .生物技术在牧草品质改良中的应用[] 草业学报, 0 7, 6 1 : - 5  J. 2 0 1 ( ) 19. [ ] 张渝洁,全先庆,李新国 .植物水孔蛋白研究进展[] 安徽农业科学, 0 6, 4 2 ) 5 6 - 1 0. 6  J. 2 0 3 (0 : 1 85 7 [ ] 张渝洁,全先庆,李新国 .植物水通道蛋白活性的调节机制[] 生命的化学, 0 6, 6 4 : 2 - 3 7  J. 2 0 2 ( ) 3 93 1. [ ] 李兵 .植物水通道蛋白生理作用的研究进展[] 现代农业科技, 0 0,( ) 1 31 5. 8  J. 20 7 :4- 4 [ ] ags , c a nrA  ,Afne e     ,t l. ln q a oisJ . h s lgaPatr m, 0 2, 1 : 7 - 8 9  Bie  S hf e   R f zl r M J e  Pat u pr [] P yi oi lnau 2 0 1 5 1 51 2. I f e l a a n o [0  J h no   ,K r s n M, o a so  ,t l. h  m lt  t f e e noigm jr nr s  rtis nA ai o s   o 1 ] o a s n U al o   J h ns n e  T e o pee e    ns c dn  ao  t ni poen   rbd pi p - s I a c s og e i i c i sr vdsa r m w r  r  e  o ec tr  rm jr nr s  rtis npat [] PatP yilg , 0 1, 2 : 3 81 6 ie  fa e ok o  n wn m nl ue o  ao  t ni poen    nsJ . ln h s o y 2 0 1 6 1 5 - 3 9. f a a f i i c i l o   [1  L   W, e g Y  ,Y   ,t l. rnpr f nt n n  x rsina ayi fvc oa  e ba ea u pr s nrs o s 1 ] iG  P n   H uX e  T a s ot u c o sa de pes  nls o aulrm m rn q a oi     p ne a i o s ni e   t aiu  rse    c [] PatP yilg , 0 8, 6 : 8 91 8 ovr ss ess nr eJ . ln h s o y 2 0 1 5 1 7 - 8 8. o t i i o [2  P sa eO, ed uqL,M ue  A u pr s npat : r m oeua  rcue    tgae  nt n [] A v ne  1 ] oti   V ro c   r arl C. q a oi     ns Fo m lclr tutrs o nertd u c o sJ . d a cs n ni l s ti f i i B tn a eerh 2 0 , 6: 51 6. oai lR sac , 0 8 4 7 - 3 c [3  Q ilyF, oe br    , hc a -Hl  ,t l. r mg n m     nt n T eA ai o s   u pr sJ . e o eBo- 1 ] uge   R sn egJ M S ahr i Y e  Fo  e o e o u c o : h rbd pi a a oi [] G n m   l l a tf i sq n i o y 2 0 , :- 7. g , 0 1 3 11 [4  Jn    ,K m    ,K m  O,t l.A  x rsina ayi fag n a i  noigpa m   e ba ea u pr s nr - 1 ] a gJY i D G i Y  e  a ne pes  nls o  e ef ml ec dn  ls a m m rn q a oi    e o s ni y s o s oait   rse   rbd pi  ain [] Pat M lclrBoo y 2 0 , 4 5 : 1 - 2 t i t i sh p ne  bo cs ess nA ai o s t la a J . ln   oeua ilg , 0 4 5 ( ) 7 37 5. [5  H     ,H o YJ H n aC,t l. ua v  I 1g ns sltdfo  pl : x rsina aye uigfu  eeo m n 1 ] uC G a    , o d   e  P tt eP P e e  oae  m a pe E pes  nlssd r   i dvlp et a i i r o n rt i t o a du dro m t   rs [] J unl fE prm na oa y 2 0 , 4: 1 32 9 n  n e s o cs esJ . o ra   x ei etlB tn , 0 3 5 2 9 - 1 4. [6  G oL,W n    , i   ,t l. x rsina d u c o a nls     e iepa m -m m rn  t ni  oeng n  ml 1 ] u  a gZY Ln H e  E pes  n  nt nl ayi o t  c  s a e ba e nr s p ti e e a i a o f i a s fh r l i i cr f y [] Cl eerh 2 0 , 6 3 : 7 - 8 J . e R sac , 0 6 1 ( ) 2 72 6. l [7  Jn    , e    , he   ,t l. rng n   rbd pi n  bcopat vrx rsiga  q a oi  s o dd fr 1 ] a gJY L eS H R e  Y e  T a sei A ai o s a dt ac   nso ee pesn  na u pr r p n   f - J a c s o ne ie l et  ovr u bo csrse [] Pat M lclrBoo y 2 0 , 4 6 : 2 - 3 nl t ai sait   essJ . ln   oeua ilg , 0 7 6 ( ) 6 16 2. o i t y [8  J  , iY, i ,t l. e ea o  n  nls  f x rse e u ne as r m a l rae  lcn  j [ ] BMC Pat 1 ] iW L   L  e  G nrt na da ayi o  pesdsq ec  g  o N C- etdG yie oa J . J a i s e t f t s  ln Boo y 2 0 , : ilg , 0 6 6 4. [9   萨姆布鲁克 .分子克隆实验指南( 版) M] 北京:科学出版社, 0 2. [ . 1] 3 20 [0  T unie o xC, uk   , a o   ,t l. yoo cp   glts otw tr rnpr uiga oi  rs  ru hgt g 2 ] o ra -R u   S ta M JvtH e  C tsl   Hr uae  o  ae  a s ot r  n x s es ho g  a n r a i e r t d n ct t i a n o q a oisJ .N tr , 0 3, 2 : 9 - 9 f u pr [] aue 2 0 4 5 3 33 7.

Ioa o  n   q ec nls  f h a   rs- n ue eeG P Po lcn   j slt na ds unea ayi o  e l s es d cdgn s I fGyie o a i e s t s tt i s WANG X , IY n , A  i C IH a J   e , HU a -mn Y n ig  i L   o g B IX , A   u , I W i Z (o e eo i  c ne ,N rhatA r utr   nvriy H ri 5 0 0, hn ) C l g  fLf Si cs ot es  gi lueU ies , abn1 0 3 C ia l e e c t l g it fr A s at Sl srs  fcspat r w ha dd vlp et n   d cspo ut iyo  o s G yie oai n bt c : a   es fet  n  o t n  eeo m n  dr ue r d c v   c p . lcn  j s r tt a a e s a e cl n   aeil o  oa o  f boi  rs eae  e e ea s f t oea c osvrlkn so te - xe etm tr   r slt no  it s esrltdg nsbcueo i tlrnet eea id fsrs l af i i a ct  s ss nE Tdtbs    sl tlrn ait    .oa w s o sr ce   rvo sw r , n   e e x rs e .A  S  aa aeo a a   eat r yo G sj a  ntutd npeiu  ok a dag n  pe - f   to v e f c i e s npo l  a ban db  e e hpasy E pes no  l .oaE T  ee nlzd a do e ′E Ti - i  rf ew s tie  yg n  i  a . x rsi   a   sj S sw r  aye , n  n  - S   o o c s o f lG a 3 n i d cdb  od hg   l a ddo g t tesw s h sn. hsE Trpeet   a m  e ba e nrni r - ue  ycl , ihs t n  r u h  rs  a  oe T i S   rsns p s am m rn  t s po a  s c e al i i c ti (I ) e e w ihbln s ot em jr nrni rti ( I )a i .  o peeC So hsg n  a en P P g n , hc  eo g   h  ao  t s poen M P f ml Ac m lt   D  f i e ew s t i i c t y ic l h rnl i  r d c fti e ehs9 ao o tie  ihsiocoiga d w sd vlp d wt  ′ A E.T eta s t npo uto hsg n  a 0% ban d wt  l   nn  n   a eeo e  ih5 -R C smlr y wt  I  rti   i oap dc n  a a e  s I . h  a s t npo uth d h hrc i i i  ihaP Ppoeno M m s uiaa dw sn m dG P P T e rnl i  r d c a  e aa - at f t ao t c tr t  o ano   I  u a osg a et e T i i o s tn  ihP P  fohrpat .W   oae h ei i d m i f M Pb thsn   nl pi : hs sc ni etwt  I so t e lns e sltdt e sc i s i   p d

G P P g n  no ro na dw  a ea   tl cul r pryr hs I ol eo ean wg n o re o e s I e eo  u w  n  eh v  l ne eta  o et  g t .t udbc m   e  e es uc  rg - li l i c f p
nt  niern  f tes oea c . ut e  nt nl nls  ol  s t eerho   em c ai m    s e ce gneigo  rs  lrne F rhr u c o a  ayi w uda i   sac  n h  eh ns s f - i s t f i a s s sr t oo m t   rs oea c . oi s es lrne ct t K yw rs G yie oa; a ysrs ;m jr nrni rti ( I ) G P P; ′ A E e  od : lcn  j sl   es ao  t s poen M P ; s I 5 -R C s t t i i c


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