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植物组织培养技术(一)


植物组织培养技术

Plant tissue culture

植物组织培养简介
定义:离体(in vitro)条件下利用人 工培养条件在无菌情况下培养、生长、 发育再生出完整植株的过程。

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植物组织培养是二十世纪发展起来的 新技术,近三十年来由于组织培养基础 理论研究的深入,发展

极为迅速,发表 的文献浩如烟海,几乎以植物为研究对 象的各个分支学科都在广泛进行组织培 养。

发展简史
? 1838-1839年,德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学 说,奠定了组织培养的理论基础。 1902年,德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说,提出单个 细胞的植物细胞全能性(totipotency)理论。 1904年,Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。 1922年,Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 1934年,White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁 殖系,从而使非胚器官的培养首先获得成功。 1958年,英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞 进行悬浮培养,成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株,不但 使细胞全能性理论得到证实,而且为组织培养的技术程序奠定了 基础。 1962年,Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍 被广泛使用的MS培养基。 1964-1966年,印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花 药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年,Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养,获 得了第一个体细胞杂交的杂种植株。……

应用领域
? 1、快速繁殖 运用组织培养的途径,一个单株一年可以繁殖几 万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株,一株兰 花一年繁殖到400万株。 2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害,通过组织 培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马 铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得 成功,从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这 种方法获得苹果与梨的杂交种。 4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、 抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐 步加大培养基中盐的浓度,直接获得耐盐的杨树株系。 5、基因工程 基因工程主要研究DNA的转导,而基因转导后 必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品,如抗癌首选药物--紫 杉醇等,可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红 豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW/(gFW· d)的细胞系, 每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。

植物组织培养的分类
? 外植体(explant):由活体(in vivo)植物体上 提取下来的,接种在培养基上的无菌细胞、组 织、器官等。 ? 广义的组织培养依外植体不同,可分为:器官 培养(organ culture)、茎尖分生组织培养 (shoot tip culture,shoot apex culture,apical meristem culture)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养 (protoplast culture) ? 愈伤组织(callus)在人工培养基上由外植体上 形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。

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植物组织培养的理论基础—— 植物细胞的全能性
? 植物细胞的全能性(totipotent):植物细胞具有该植物 体全部遗传的可能性,在一定条件下具有发育成完整 植物体的潜在能力。 ? 原理:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的 全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部 基因,从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。 ? 差异:(1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后 的细胞中,体细胞的全能性比生殖细胞的低。 ? 潜在全能性的原因:基因表达的选择性 ? 科学研究表明,处于离体状态的植物活细胞,在一定 的营养物质、激素和其他外界条件的作用下,就可能 表现出全能性,发育成完整的植株。人工条件下实现 的这一过程,就是植物组织培养。

植物细胞全能性的表达
? 脱分化(dedifferentiation):将来自已分 化组织的已停止分裂的细胞从植物体部 分的抑制性影响下解脱出来,恢复细胞 的分裂活性。 ? 再分化(redifferentiation):经脱分化的组 织或细胞在一定的培养条件下可有转变 为各种不同细胞类型的能力。

植物组织培养过程
离体的植物 脱分化 器官、组织、 细胞 愈 再分化 伤 组 织 根 植 物 体



植物组织培养条件:
含有全部营养成分的培养基、一定的温度、 空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。

植物组织培养特点
? ①培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下 进行生长,摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响, 且条件均一,对植物生长极为有利,便于稳定地进行周年培养生产。 ? ②生长周期短,繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件,根据不同植物不同部位的不同要求 而提供不同的培养条件,因此生长较快。另外,植株也比较小,往往20— 30d为一个周期。所以,虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗,但由 于植物材料能按几何级数繁殖生产,故总体来说成本低廉,且能及时提供 规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 ? ③管理方便,利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下,人为提供一定的温度、光照、湿度、 营养、激素等条件,既利于高度集约化和高密度工厂化生产,也利于自动 化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培 等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动,可以 大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。

第二章 组织培养实验技术
第一节 实 验 室
在进行植物组织培养工作之前,首先应对工作中需 要哪些最基本的设备条件有个全面的了解,以便因地 制宜地利用现有房屋,或新建、改建实验室。实验室 的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目 的,实验室规模太小,则会限制生产,影响效率。在 设计组织培养实验室时,应按组织培养程序来没计, 避免某些环节倒排,引起日后工作混乱。植物组织培 养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件, 需要一定的设备、器材和用具,同时还需要人工控制 温度、光照、湿度等培养条件。

1 实验室设计原则:保证无菌操作,达到工

作方便,防止污染。 2 实验室组成: 化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室 (接种室)、培养室、细胞学实验室。

? 化学实验室(准备室):完成所使用的 各种药品的贮备、称量、溶解、配制、 培养基分装等。 主要设备: 药品柜、防尘橱(放置培养 容器)、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度 计及常用的培养基配制用玻璃仪器. ? 洗涤、灭菌室:完成各种器具的洗涤、 干燥、保存、培养基的灭菌等。 主要设备:水池、操作台、高压灭菌锅、 干燥灭菌器(如烘箱)等。

? 无菌操作室(接种室):主要用于植物材料的消毒、接
种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一 切需要进行无菌操作的技术程序。 主要设备:紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接 种器械(接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针)等。 接种室宜小不宜大,一般7~8平米,要求地面、天花板 及四壁尽可能密闭光滑,易于清洁和消毒。配置拉动门,以 减少开关门时的空气扰动。 接种室要求干爽安静,清洁明亮。在适当位置吊装1~2 盏紫外线灭菌灯,用以照射灭菌。最好安装一小型空调,使 室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与外界空气对流。 接种室应设有缓冲问,面积1m2为宜。进入无菌操作室 前在此更衣换鞋,以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最 好也安一盏紫外线灭菌灯,用以照射灭菌。

? 培养室:培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根
据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空 间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜,周围墙壁要求有绝热防火 的性能。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成,一般设5层,最 低一层离地高约lOcm,其他每层间隔30cm左右,培养架即高1.7m左右。 培养架长度都是根据日光灯的长度而设计, 如采用40W日光灯,则长 I.3m,30W的长lm,宽度一般为60cm。 培养室最重要的因子是温度,一般保持在20—27℃左右,具备产热装置, 并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同 温度,最好不同种类有不同的培养室。 室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在70%~80%为好,可安装加湿器。 控制光照时间可安装定时开关钟,一般需要每天光照10-16h,也有的需要 连续照明。短日照植物需要短日照条件,长日照植物需要长日照条件。现 代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以 节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活。在阴雨天可用 灯光作补充。 主要设备:培养架(控温控光控湿)、摇床、培养箱、紫外光源等。

? 细胞学实验室:用于对培养物的观察分 析与培养物的计数等。 主要设备:双筒实体显微镜、显微镜、 倒置显微镜等。 ? 其他小型仪器设备:分注器、血球计数 器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热 器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。

第二节 植物组织培养的培养条件
一、营养条件——培养基(culture medium) 培养基:是植物组织培养的重要基质。在离 体培养条件下,不同种植物的组织对营养有不 同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对 营养的要求也不相同,只有满足了它们各自的 特殊要求,它们才能很好地生长。因此,没有 一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器 官,在建立一项新的培养系统时,首先必须找 到一合适的培养基,培养才有可能成功。

培养基的种类
? 培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的 培养目的需选用不同的培养基。 ? 培养基的产生最早是Sacks(1680)和Knop(1681),他们对绿 色植物的成分进行了分析研究,根据植物从土中主要是吸收 无机盐营养,设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液, 至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据 不同目的进行改良产生了多种培养基,White培养基在40年 代用得较多,现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS 等高浓度培养基,可以保证培养材料对营养的需要,并能生 长快、分化快,且由于浓度高,在配制、消毒过程中某些成 分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡。 ? 培养基的名称,一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字 来命名,如White培养基,Murashige和Skoog培养基(简称MS 培养基),也有对某些成分进行改良称作改良培养基。

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目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下: (1)MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。 特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比 例较合适,可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基 为高,广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好。 有些培养基是由它演变而来的。 (2)B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要 特点是含有较低的铵,这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得 知有些植物在B5培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物。 (3)White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作 了改良,称作White改良培养基,提高了MsSO4 的浓度和增加了硼素。其 特点是无机机盐数量较低,适于生根培养。 (4)N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 其特点是成分较简单,KNO3 和(NH4)2SO4 含量高。在国内已广泛应用 于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 (5)KM—8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机 成分较复杂,它包括了所有的单糖和维生素,广泛用于原生质融合的培养。

培养基的成分
培养基的成分主要可以分水、无机盐、 有机物、天然复合物、培养体的支持材 料等五大类。

? 水是植物原生质体的组成成分,也是一 切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活 动过程中不可缺少的物质。配制培养基 母液时要用蒸馏水,以保持母液及培养 基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变 质。大规模生产时可用自来水。但在少 量研究上尽量用蒸馏水,以防成分的变 化引起不良效果。

无机元素(inorganic element)
大量元素,指浓度大于0.5mmol/L的元素等。其作用是:

? (1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分, 是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3—N和NH4—N两种形式供应。 大多数培养基既含有N03—N又含NH4—N。NH4—N对植物生长较为有利。供 应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时,也添加氨基酸来补充氮素。 ? (2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也 是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不 仅增加养分、提供能量,而且也促进对N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积 累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 ? (3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时,蛋 白质合成增加,维管束、纤维组织发达,对胚的分化有促进作用。但浓度不 易过大,一般为1—3mg/L为好。制备培养基时,常以KCI、KN03等盐类提供。 ? (4)Mg、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分,又是激酶的活化剂;S是含S氨基 酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO4· 7H20提供。用量为1—3mg/l较为 适宜;Ca是构成细胞壁的一种成分,Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显 著作用,常以CaCl2· 2O提供。 2H

微量元素 指小于0.5mmol/L的元素,Fe,B, Mn,Cu,Mo,Co等。 ? 铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢 酶等的组成成分。同时,它又是叶绿素形成的 必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分 化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不 用Fe2SO4,和FeCl3(因其在pH值5.2以上,易 形成Fe(OH)3的不溶性沉淀),而用FeSO4· 20 7H 和Na2—EDTA结合成合物使用。B,Mn,Zn, Cu,Mo,Co等,也是植物组织培养中不可缺 少的元素,缺少这些物质会导致生长、发育异 常现象。

有机化合物(organic compound)
? 培养基中若只含有大量元素与微量元素, 常称为基本培养基(basic medium)。为 不同的培养目的往往要加入一些有机物 以利于快速生长。常加入的有机成分主 要有以下几类:

碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果 糖也是较好的碳源,可支持许多组织很好的生 长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培 养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%—3%,常 用3%,即配制一升培养基称取30g蔗糖,有时 可用2.5%,但在胚培养时采用4%-15%的高浓 度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水 稻根培养的影响来看,以葡萄糖效果最好,果 糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些。不同植物不同 组织的糖类需要量也不同,实验时要根据配方 规定按量称取,不能任意取量。高压灭菌时, 一部分糖会发生分解,制定配方时要给予考虑。 在大规模生产时,可用食用的绵白糖代替。

? 维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要 是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动,对生 长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的 植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素, 但在数量上,还明显不足,通常需加入一至数 种维生素,以便获得最良好的生长。主要有 VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟 酸)、Vc(抗坏血酸)、有时还使用生物素、 叶酸、VB12等。一般用量为0.1—1.0mg/L。 有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活 力有重要作用,VB6能促进根的生长,Vpp与植 物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织 变褐的作用。

? 肌醇 (myo—inosltol)又叫环己六醇,在 糖类的相互转化中起重要作用。通常可 由磷酸葡萄糖转化而成,还可进一步生 成果胶物质,用于构建细胞壁。肌醇与6 分子磷酸残基相结合形成植酸,植酸与 钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁,植酸 可进一步形成磷脂,参与细胞膜的构建。 使用浓度一般为lOOmg/L,适当使用肌 醇,能促进愈伤组织的生长以及胚状体 和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分 化有促进作用,对细胞壁的形成也有作 用。

? 氨基酸(almino acide) 是很好的有机氮源, 可直接被细胞吸收利用。培养基中最常 用的氨基酸是甘氨酸,其他的如精氨酸、 谷氨酸,谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、 丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白 或水解酪蛋白,它们是牛乳用酶法等加 工的水解产物,是含有约20种氨基酸的 混合物,用量在10-1000mg/L之间。由 于它们营养丰富,极易引起污染。如在 培养中无特别需要,以不用为宜。

天然复合物
? 其成分比较复杂,大多含氨基酸、激素、 酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织 的增殖与分化有明显的促进作用,但对 器官的分化作用不明显。它的成分大多 不清楚,所以一般应尽量避免使用。

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1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天 然复合物。一般使用浓度在10%—20%,与其果实成熟度及产地 关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯 茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组 织的大小若超过1nun时,椰乳就不发生作用。 2)香蕉 用量为150-200ml/L。用黄熟的小香蕉,加入培养基后变 为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用, 对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后,加水煮30min,再经过过滤,取 其滤液使用。用量为150—200g/L。对pH值缓冲作用也大。添加 后可得到健壮的植株。 4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度 为100—200mg/L。受酸和酶的作用易分解,使用时要注意。 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%),主要成分为氨基酸和维生 素类;麦芽提取液(0.01%~0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果 实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定,大多在培养困难时使用,
有时有效。

植物生长调节物(hormone)
? 植物激素是植物新陈代谢中产生的天然 化合物,它能以极微小的量影响到植物 的细胞分化、分裂、发育,影响到植物 的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、 衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理 生化活动,在培养基的各成分中,植物 生长调节物是培养基的关键物质,对植 物组织培养起着决定性作用。

生长素类(auxin) 在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,
诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面,根对生长 素最敏感。在极低的浓度下,(10-5—10-8rng/L)就可促进生长,其次是茎 和芽。天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏。在植 物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物 质。 IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活 力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小、,高温 高压易被破坏,也易被细胞中的1AA分解酶降解,受光也易分解。 NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高 出3-4倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所 以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽 的增殖和生长。 IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍,特别在促进愈伤 组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育。适 宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效应。

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细胞分裂素类 ( cytokinin ) 这类激素是腺嘌吟的衍生
物,包括6—BA(6—苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动 素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强,但非常昂 贵,常用的是6—BA。 ? 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:①诱导芽的 分化促进侧芽萌发生长。②促进细胞分裂与扩大。③ 抑制根的分化。因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽 的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或 用量较低。

GA ( gibberellic acid赤霉素) 有20多种,生 理活性及作用的种类、部位、效应等各 有不同、培养基中添加的是GA3,主要用 于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚 发育成小植株;赤霉素和生长素协同作 用,对形成层的分化有影响,当生长素 /赤霉素比值高时有利于木质部分化, 比值低时有利于韧皮部分化;此外,赤 霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、 鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后, 添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。 ?

激素配比模式
? 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈 伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化, 应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中生长 素与细胞分裂素的比例。 高 有利于根的形成和愈伤组织 的形成 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成 ? 生长调节物质的使用甚微,一般用mg/L表示浓度。 在组织培养中生长调节物质的使用浓度,因植物的种 类、部位、时期、内源激素等的不同而异,一般生长 素浓度的使用为0.05-5mg/L,细胞分裂素0.05—10mg /L。

Growth medium is optimised for regeneration of plantlets
The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface

No sucrose (0%)
Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.

tissue culture in the African Violet
Sucrose reduced to 1%
Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured

Sucrose increased to 5%
Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium

No BAP
Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant

BAP reduced to 0.1 mg. l-1

More balanced development of roots and shoots. However undifferentiated callus is developing at the edges of the explant

No NAA Poor shoot development and no roots

NAA reduced to 0.1 mg. l-1 Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation

NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus

No MS salts No sign of regeneration from explant at all.

MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots

MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.

? 琼脂(agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海 藻中提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。琼脂能 溶解在热水中,成为溶胶,冷却至40~C即凝固为固体状凝胶。通 常所说的“煮化”培养基,就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。 琼脂的用量在6—10g/L之间,若浓度太高,培养基就会变得很 硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低,凝固性 不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色 浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家 的加工方式有关外,还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素 有关,长时间的高温会使凝固能力下降,过酸过碱加之高温会使 琼脂发生水解,丧失凝固能力。时间过久,琼脂变褐,也会逐渐 丧失凝固能力。
加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便,通气问题易于解 决,便于经常观察研究等,但它也有不少缺点,如培养物与培养基的接触(即吸收) 面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,同时培养物排出的 一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都 含有杂质,特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问 题时,则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥, 然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。

培养材料的支持物

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其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等,总的 要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。

抗生物质(antibiotic)

? 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量在5— 20mg/L之间。 添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失, 尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养 物,采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤 其对大量通气长期培养,效果更好。对于刚感染的组织 材料,可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各 有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素混用。 但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用, 可能某些植物适宜用青霉素,而另一些植物却不大适应。 值得提醒的是,在工作中不能以为有了抗菌素,而放松 灭菌措施。此外,在停止抗生素使用后,往往污染率显 著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。

活性炭(active carbon)
? 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构,它 结构疏松,孔隙大,吸水力强,有很强的吸附 作用,它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越 小,吸附能力越大。温度低吸附力强,温度高 吸附力减弱,甚至解吸附。通常使用浓度为 0.5—l0g/L。它可以吸附非极性物质和色素等 大分子物质,包括琼脂中所含的杂质,培养物 分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产 生的5—羟甲基糖醛及激素等。

活性炭的应用

? 茎尖初代培养,加入适量活性炭,可以吸附外植体产生的致死性褐化物,其 效力优于Vc和半胱氨酸;在新梢增殖阶段,活性炭可明显促进新梢的形成和 伸长,但其作用有一个阈值,一般为0.1%—0.2%,不能超过0.2%。 ? 活性炭在生根时有明显的促进作用,其机理一般认为与活性炭减弱光照有关, 可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA,但IAA易受可见光的光氧化而破坏, 因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA,从而间接促进了根的 生长,由于根的生长加快,吸收能力增强,反过来又促进茎、叶的生长。 ? 此外,在培养基中加入0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产 生玻璃苗有良好作用。 ? 活性炭在胚胎培养中也有一定作用,如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1% 的活性炭,可减少组织变褐和培养基变色,产生较少的愈伤组织。 ? 但是,活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生 长调节物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节 物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂。很 细的活性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培养瓶。总之,那 种随意抓一撮活性炭放人培养基,会带来不良的后果。因此,在使用时要有 其量的意识,使活性炭发挥其积极作用。

Callus culture

- creation of genetic variants via somaclonal variation
and/or in vitro selection

- elimination of pathogens esp. viruses
- gene transfer (eg via Agrobacterium, microprojectiles

2. Meristem culture
- clonal propagation - elimination of pathogens

- germplasm collection and long-term storage
(eg cryopreservation)

Virus elimination
? why does the meristem have low/ virus titre? no
virus-free tissue

virus particles found here
Tobacco meristem

– virus spreads primarily through vascular system - this is not developed in the meristem – mitosis and chromosome replication compete with virus replication – high auxin in meristem inhibits virus replication – a virus “inactivating” system has greatest activity in meristem

Virus elimination
?virus elimination most useful for vegetatively reproduced species - banana, sugarcane, potato, strawberry, sweet potato
?chemotherapy and/or thermotherapy may also be used ?NB: disease-free planting material may be rapidly rapidly re-infected by insect vectors, contaminated soil or implements ?the only long-term solution is genetic resistance

3. Embryo culture
- shortening breeding cycles - creating wide hybrids (interspecific/intergeneric) - haploid production via chromosome elimination

4. Anther/pollen/ovule culture
- production of haploids for genetic analysis and shortening breeding programmes - creation of genetic variants via gametoclonal variation

5. Protoplast culture

- gene transfer
- creating wide hybrids via somatic hybridization

Plant protoplasts


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