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不对称水溶性菁染料的简便制备与纯化方法


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     华 东 理 工 大 学 学 报      Jou rnal of East Ch ina U n iversity of Science and T echno logy

DNA labeling, w a s syn thesized from p 2hyd razino 2benzenesu lfon ic aci

d by 6 step s. A terna ry so lven t w ere w ere a s good a s tha t of the H PL C m ethod tha t had been repo rted.

develop ed and u sed a s eluan t in p u rifica t ion of in term ed ia tes and fina l dyes by PTL C m ethod. T he yield s Key words: w a ter 2so lub le cyan ine; syn thesis; p u rifica t ion; PTL C
[2 ]

收稿日期: 2001204218 作者简介: 楼开炎 (19752) , 男, 硕士生, 研究方向为药物化学。

  文章编号: 100623080 ( 2002) 0220212204

不对称水溶性菁染料的简便制备与纯化方法
( 华东理工大学药物化工研究所, 上海 200237)

  摘要: 以对肼基苯磺酸为起始原料, 经 6 步反应合成了 2 个可用于 DNA 荧光标记的不对称水 溶性菁染料。 采用三元展开剂体系, 用制备薄层色谱方法分离提纯各中间体和产物, 得到了与文献 报道制备液相色谱方法相当的收率。 关键词: 水溶性菁染料; 合成; 纯化; 制备薄层色谱 中图分类号: TQ 614. 4 文献标识码: A

Syn thesis and Pur if ica tion of Un symm etr ica l W a ter- soluble Cyan ine D yes
L OU K a i 2y an ,  Q IA N X u 2hong ,  S ON G G ong 2hua
3

( I nstitu te of P esticid es and P ha rm aceu tica ls E CU S T , S hang ha i 200237, C h ina )

  水溶性菁染料是性能优良的荧光标记染料, 广 泛 用 于 抗 体、 酸 及 其 他 生 物 分 子 的 标 记 和 检 核 测[ 1~ 2 ]。通过改变次甲基链的长度, 可改变其荧光发 射波长。Am ershan Pha rm acia B io tech 公司首先将

荧光发射波长不同的菁染料应用于基因芯片的双色 荧光检测, 目前已有商品化的成套仪器和试剂出售, 价格昂贵 。 菁染料已成为基因芯片测试用的首选 荧光标记物, 但由于菁染料, 尤其是不对称菁染料的 合成副反应多, 副产物极性相近, 产物的分离提纯相

当困难。 水溶性菁染料分子极性大, 分离提纯越加困 难。文献 [ 1 ] 报道用 H PL C (C 218 反相柱) 纯化, 而国 内实验室一般没有相应的条件。 本文对文献 [ 1 ] 的合成路线进行了部分简化修 改, 用简便的制备薄层色谱分离提纯不对称水溶性

Abstract: Tw o w a ter 2so lub le un symm et rica l cyan ine dyes, w h ich can be u sed a s fluo rescence tag in

楼开炎,  钱旭红3 ,  宋恭华

菁染料, 并通过了严格的核磁验证。

1 实验部分

1. 1 试剂和仪器

V o l 28 N o. 2 . 2002204

对 肼 基 苯 磺 酸、 2溴 代 己 酸, A cro s 公 司; 32 6 甲基222丁酮, F luka 公司; 其他试剂均为分析纯。 B rucker AM 2500 核磁共振仪。 TL C ( 薄层色谱) 分析和 PTL C ( 制备薄层色谱) 用青岛海洋化工有限公司的 GF 254 涂板, 正丁醇∶冰 醋酸∶水= 2∶1∶5 (V V , 取上层) 为展开剂。
1. 2 合成方法

合成反应的过程如下:

第2期

楼开炎等: 不对称水溶性菁染料的简便制备与纯化方法   

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KO H 。混合物加热回流, 粉红色迅速褪去, 冷却有大

1. 2. 1   2, 3, 32三甲基吲哚252磺酸盐 ( 1 ) 的合成  1 000mL 三 口 烧 瓶 中, 依 次 加 入 150mL 冰 醋 酸, 84mL ( 0. 80m o l) 32甲基222丁酮, 和 50g ( 0. 26m o l) 对 75% , R f = 0. 58。 1. 2. 2   2, 3, 32三甲基吲哚252磺酸钾 ( 2 ) 的合成  250mL 圆底烧瓶中依次加入 50mL 甲醇, 50mL 异 丙 醇, 48g ( 0. 20m o l) 化合物 ( 1) 和 12. 3g ( 0. 22m o l)

量黄色固体析出。 过滤, 真空干燥, 得化合物 ( 2 )
54g, 产率 97% 。 R f = 0. 58。 1. 2. 3   12乙基22, 3, 32三甲基吲哚252磺酸盐 ( 3 ) 的

肼基苯磺酸。 混合物加热回流 3h, 冷却后有粉红色 固体析出。 过滤, 真空干燥, 得化合物 ( 1 ) 48g, 产率

合成  50mL 圆底烧瓶中依次加入 5. 5g ( 20mm o l) 化合物 ( 2) 和过量的碘乙烷 20mL , 氩气保护下回流 反应 24h。旋转蒸发除去未反应的碘乙烷, 残余物用
20mL 冰醋酸重结晶, 过滤, 用丙酮洗涤数次, 得淡

肉色 固 体 4. 2g, 产 率 78% 。 R f = 0. 07, 1H 2 R NM
(dd, 1H , J 1 = 8. 5, J 2 = 1. 5, 62 ) , 7. 76 ( d, 1H , J = H

(D 2O ) ? ( × 10- 6 ) : 7. 97 ( d, 1H , J = 1. 5, 42 ) , 7. 88 H

214

    华 东 理 工 大 学 学 报

第 28 卷

2 CH ) , 4. 14 ( q, 2H , J = 7. 1, 12Α CH 2 ) , 1. 70 ( s, 6H ,
322CH 3 ) , 1. 33 ( t, 3H , J = 7. 1, 12Β2 3 ) 。 CH
- 6

8. 5, 72 ) , 4. 38 ( q, 2H , J = 7. 4, 12Α CH 2 ) , 1. 93 ( s, 2 H 3H , 22 3 ) , 1. 44 ( s, 6H , 322CH 3 ) , 1. 39 ( t, 3H , J = CH 7. 4, 12Β2 3 ) 。 CH 2. 0 1. 3 ( 3m + s, 12H , 12Β, Χ ?23CH 2 , 322CH 3 ) 。 ~ ,
1

1. 2. 4  12( Ε 2羧戊基) 22, 3, 32三甲基吲哚252磺酸盐
1 - 6 约 70% 。 f = 0. 16。H 2 R NM R (D 2O ) ?( ×10 ) : 8. 06 ( s, 1H , 42 ) , 7. 97 ( d, 1H , J = 8. 4, 62 ) , 7. 76 ( d, H H

50mL 邻二氯苯, 氩气保护下在 110℃下反应 12h。

有棕黑色块状固体在瓶底析出。 冷却后倾倒出邻二 氯苯, 小心刮出块状固体, 用滤纸吸去残留表面的溶 剂, 置研钵中捣碎, 放入真空干燥器中抽去残留的邻 二氯苯 ( 可直接用于下一步反应) , TL C 跟踪, 产率

1H , J = 8. 4, 72 ) , 4. 43 ( t, 2H , J = 7. 5, 12Α CH 2 ) , 2 H 2. 17 ( t, 2H , J = 7. 4, 12Ε CH 2 ) , 2. 13 ( s, 3H , 22 2 ) , 2 CH 8. 3, J 2 = 1. 8, 6, 6′ ) , 7. 31 ( d, 2H , J = 8. 3, 7, 22H 12Ε CH 2 ) , 1. 77, 1. 54, 1. 35 ( 3p , 6H , J = 7. 3, 12Β, Χ 2 ,

1. 2. 5 12乙基222( Β2苯胺基) 乙烯基23, 32二甲基吲 1. 2. 6  12( Ε 2羧戊基) 21′ 2乙基23, 3, 3′3′ , 2四甲基吲

哚252磺酸盐 ( 5) 的合成 在 50mL 烧瓶中依次加入 2. 0g ( 7. 5mm o l) 化合物 ( 3 ) , N , N ′ 2二苯基二甲脒 1. 6g ( 8. 2mm o l) 和冰醋酸 20mL , 氩气保护下反应 剂溶解后用 PTL C 板分离 R f = 0. 67 黄色展开带, 得 气保护下反应 15m in。 用 50mL 乙酸乙酯沉淀反应 在 PTL C 板上上样, 展开后, 分离 R f = 0. 48 的红色 展开带, 洗脱后浓缩, 重复用 PTL C 板提纯两次得 1 水溶性菁染料 ( 6) 0. 36g, 产率 17% 。H 2 NM R (D 2O ) ? ( × 10 ) : 8. 48 ( s, 1H , J = 13. 5, 22Β2 ) , 7. 82 CH ( 2d, 2H , J = 1. 8, 4, 4′ ) , 7. 77 ( 2dd, 2H , J 1 = 22H 22CH 3 ) , 1. 30 ( t, ?23CH 2 ) , 1. 68 ( 2s, 12H , 322CH 3 , 3′
(m , 4H , 12Α CH 2 , 1′ 2 2 ) , 2. 10 ( t, 2H , J = 7. 4, 2 2Α CH 7′ ) , 6. 31 ( 2d, 2H , 22Α CH , 2′ 2 ) , 4. 1~ 4. 0 22H 2 2Α CH

4h, 反应结束, 冷却后用旋转蒸发仪蒸去冰醋酸, 溶

化合物 ( 5 ) 1. 2g, 产率为 43% 。 H 2 R (DM SO ) ? NM - 6 ( × 10 ) : 8. 68 ( d, 1H , J = 12. 3, 22Β2 ) , 7. 85 ( s, CH ~ 1H , 42 ) , 7. 70 ( d, 1H , J = 7. 7, 62 ) , 7. 6 7. 2 (m , H H 哚碳菁25, 5′ 2二磺酸单钾盐 ( 6) 的合成 在 25mL 圆 底烧瓶中依次加入化合物 ( 5) 1. 2g ( 3. 2mm o l) , 化合 物 ( 4 ) 1. 4g ( 4. 0mm o l) , 5mL 醋酸酐, 5mL 吡啶, 氩 液, 静置后倒去上层清液, 用甲醇溶解沉淀, 过滤后

6H , 72 , 苯胺基上 5H ) , 6. 17 ( d, 1H , J = 12. 3, 22Α 2 H

( 4 ) 的 合 成   50mL 圆 底 烧 瓶 中 依 次 加 入 5. 5g ( 20mm o l) 化合物 ( 2 ) , 4. 9g ( 25mm o l) 62溴代己酸和

CH ) , 6. 34 ( t, 1H , J = 12. 0, 22Β2 ) , 4. 17 ( q, 2H , CH 2 J = 7. 0, 12Α CH 2 ) , 1. 69 ( s, 6H , 322CH 3 ) , 1. 28 ( t, , CH 2 ) , 1. 71, 1. 51, 1. 32 ( 3p , 6H , 12Β, Χ ?23CH 2 ) , 1. 54 ( 2s, 12H , 322CH 3 , 3′ 22CH 3 ) , 1. 25 ( t, 3H , J = 7. 3, 1′ CH 3 ) 。 2Β2 3H , J = 7. 0, 12Β2 3 ) 。 CH 2′ CH ) , 7. 73 ( 2d, 2H , 4, 4′ ) , 7. 68 ( 2dd, 2H , 2Β2 22H 6, 6′ ) , 7. 23 ( d, 2H , J = 8. 5, 7, 7′ ) , 6. 44 ( t, 22H 22H 1H , J = 13. 0, 22Χ H ) , 6. 17, 6. 13 ( 2d, 2H , 22Α CH , 2 2 2′ 2 ) , 4. 00 ( q, 2H , J = 7. 3, 1′ 2 2 ) , 3. 95 ( t, 2Α CH 2Α CH

3H , J = 7. 3, 1′ CH 3 ) 。 2Β2

1. 2. 7  12乙基222( ?2苯胺基) 乙烯基23, 32二甲基吲
- 6 30% 。 1H 2 NM R (DM SO ) ? ( × 10 ) : 8. 85 (m , 1H , 22?2 ) , 8. 40 ( t, 1H , J = 13. 2, 22Χ CH ) , 7. 85 ( s, 2 CH

哚252磺酸盐 ( 7) 的合成 缩合剂用 Β2苯胺基丙烯醛 缩苯胺盐酸盐, 反应条件与纯化方法完全与 ( 5 ) 相 同, PTL C 分离 R f = 0. 67 的深土黄色展开带, 产率
1H , 42 ) , 7. 67 ( d, 1H , J = 8. 2, 62 ) , 7. 5 7. 2 (m , ~ H H 1. 2. 8  12( Ε 2羧戊基) 21′ 2乙基23, 3, 3′3′ , 2四甲基吲 0. 47 的 蓝 色 展 开 带 3 次。 收 率 15% , 1H 2 NM R

6H , 72 , 苯胺基上 5H ) , 6. 47 ( d, 1H , J = 14. 0, 22Α 2 H

哚二碳菁25, 5′ 2二磺酸单钾盐 ( 8 ) 的合成 合成条 件与纯化方法完全与 ( 6) 相同, PTL C 反复纯化 R f =

2H , J = 7. 8, 12Α CH 2 ) , 2. 08 ( t, 2H , J = 7. 4, 12Ε 2 2

2 结果与讨论

产品的分离提纯, 因为分子含有强极性的磺酸基, 用

通常的有机溶剂组成的展开剂体系如乙酸乙酯石油

醚或甲醇氯仿二元体系难以分离, 所以寻找合适的 极性展开剂是必要的。 一方面可以用 TL C 跟踪反应 进程, 另一方面在难以找到合适的重结晶溶剂提纯 时, 可采用柱层析或制备薄层色谱纯化。 在尝试了数

十种展开剂后, 我们发现正丁醇2冰醋酸2水体系是 相当好的极性展开剂, 特别适合本文报道的不对称 菁染料的各步合成反应的 TL C 跟踪。 以化合物 ( 5) 的合成为例, 原料化合物 ( 2 ) 的 R f 值为 0. 07, 缩合 剂N , N ′ 2二甲基甲脒由于极性小, R f 值接近 1, 位于 大, 均可得到有效分离。

溶剂前沿, 随着反应的进行 R f = 0. 67 的产品点越来 产物的 R f 值为 0. 47, 由于各物质的 R f 值差别相当

越浓, 同时也有少量的副产物对称菁染料的生成, 副

(D 2O ) ? ( × 10- 6 ) : 7. 90 ( t, 2H , J = 13. 0, 22Β2 , CH

水溶性菁染料合成中的主要困难是各中间体及

第2期

楼开炎等: 不对称水溶性菁染料的简便制备与纯化方法   

215

尽可能地提纯每一中间体对于改善后续反应的 分离难度相当重要。 以化合物 ( 5) 的合成为例, 如果 中间体 ( 3 ) 按文献 [ 1 ] 不经提纯直接用于下一步反 应, 则其中未乙基化的原料 ( 2) 与缩合剂也能发生类 似的缩合反应, 生成化合物 22( Β2苯胺基) 乙烯基23, 32二甲基吲哚252磺酸盐, 结构与性质与 ( 5 ) 相似, 这 就给中间体 ( 5) 的分离带来了困难。 本文的合成路线 中各中间体均提纯, 经 TL C 检验后用于下一步反 ( ( 应。 文献 [ 1 ] 的合成路线, 中间体 ( 3) 、 4) 、 5) 均未提 纯, 直到最后一步使用制备高效液相色谱纯化, 省时 省力, 但对设备的要求高, 分离需消耗大量的色谱纯
( 上接第 163 页)

溶剂, 成本高。 本文的合成纯化路线由于每一步中间 体都作纯化, 实际上降低了最后产品的分离难度, 因 而用通常的制备薄层色谱就可以得到纯化。 最后两 步缩合反应的总收率为 7. 3% , 与文献 [ 1 ] 的收率 ( 7. 5% ) 相当。 参考文献:
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( 上接第 207 页)

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