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甘蔗与黑穗病菌互作的叶片差异蛋白分析


第 29 卷 第 2 期

热 带 作 物 学 报
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS

Vol.29 No.2 Apr.2008

2008 年 4 月

甘蔗与黑穗病菌互作的叶片差异蛋白分析
阙友 雄 林剑伟 徐景升 阮秒鸿 许莉萍


张木清



陈由强
50002

陈如凯

农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室
摘 要

福州

( 以 高 抗 和 高 感 黑 穗 病 (Ustilago scitaminea Syd) 的 甘 蔗 Saccharum complex) 品 种 NCo376 和 Ya71- 374

为供试材料, 在接种甘蔗黑穗病菌后分离叶片全蛋白, 采用双向电泳技术, 分析甘蔗黑穗病菌侵染后甘蔗叶 片 蛋 白 质 表 达 谱 的 变 化 。研 究 结 果 表 明 , 病 菌 侵 染 后 , 品 种 间 、 一 品 种 接 种 与 对 照 间 的 叶 片 蛋 白 质 表 达 谱 均 同 存在明显差异, 部分表达上调, 有些表达下调。对抗感病品种接种组中 2 个上调表达的蛋白质点的质谱进行 进 一 步 分 析 , 其 中 一 个 是 NBS 类 型 的 抗 性 蛋 白 , 另 一 个 是 rieske Fe- S precursor protein , 推 测 它 们 可 能 在 甘 蔗 对 黑穗病菌侵染的应答中起不同的重要作用。 关键词 甘蔗 甘蔗黑穗病菌 双向电泳 串联质谱

中图分类号

S566.101

S435.661

有 关 甘 蔗 黑 穗 病 (Ustilago scitaminea Syd) 尤 其 是 甘 蔗 与 黑 穗 病 菌 之 间 互 作 的 研 究 越 来 越 受 到 重 视 , 有 关 该 领 域 已 经 发 表 的 研 究 报 道 基 本 是 集 中 两 者 互 作 后 甘 蔗 生 理 生 化 变 化 方 面 [1] , 而 有 关 两 者 互 作 后 在蛋白水平上的变化尚未见报道。差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的一个主要内容, 研究者应用差 异 蛋 白 组 学 研 究 了 植 物 在 生 物 胁 迫 下 蛋 白 质 表 达 [2 ̄7] 。 笔 者 拟 借 助 差 异 蛋 白 质 组 学 技 术 , 也 即 利 用 蛋 白 分 双向电泳和生物质谱技术相结合, 通过分离、 析甘蔗与黑穗病菌互作后甘蔗叶片的蛋白质谱的变化, 寻 找 差 异 表 达 蛋 白 , 并 进 一 步 通 过 MALDI- TOF- MS 技 术 , 初 步 鉴 定 差 异 表 达 的 蛋 白 , 预 期 研 究 结 果 将 有助于从蛋白水平上了解不同抗性水平的甘蔗基因型对黑穗病菌侵染的分子应答差异, 提供抗性形成 的蛋白水平上的依据。


1.1

材料 与 方 法
供试材料 植 物 材 料 为 甘 蔗 Saccharum complex) 品 种 NCo376 高 抗 甘 蔗 黑 穗 病) 和 Ya71- 374 高 感 甘 蔗 黑 穗 ( ( (

( ( 病) , 接 种 用 的 病 原 菌 为 甘 蔗 黑 穗 病 菌 Ustilago scitaminea Syd) 小 种 1 采 集 自 甘 蔗 品 种 F134 , 该 品 种 感 小 种 2 , 抗 小 种 1) 由 福 建 农 林 大 学 农 业 部 甘 蔗 生 理 生 态 与 遗 传 改 良 重 点 开 放 实 验 室 提 供 。

1.2 1.2.1

试验方法 病原菌接种方法 采用人工针刺接种法, 每品种取 60 个芽, 双芽苗茎段, 平均分为 2 份, 其中 1 份

在 蔗 芽 部 位 针 刺 接 种 浓 度 为 5× 5 个 孢 子 /mL 的 甘 蔗 黑 穗 病 菌 悬 浮 液 , 接 种 后 置 25 ℃ 下 保 湿 24 h , 再 10 种 植 于 田 间 。空 白 对 照 是 以 无 菌 水 代 替 病 菌 孢 子 悬 浮 液 , 其 余 操 作 相 同 。待 甘 蔗 生 长 到 出 现 黑 穗 病 菌 症 状 后 , 分 别 采 集 空 白 对 照 组 和 处 理 组 的 甘 蔗 +1 叶 , 各 组 以 6 片 +1 叶 混 合 样 作 为 下 一 步 提 取 叶 片 全 蛋 白 的 材 料 , 其 中 NCo376 处 理 组 发 病 率 为 0 , Ya71- 374 处 理 组 发 病 率 为 100 % 。

1.2.2

叶片全蛋白提取方法

采 用 TCA- 丙 酮 沉 淀 法 提 取 全 蛋 白 。 方 法 是 取 1 g 甘 蔗 叶 片 鲜 样 , 按

( PVP : 样 品( 1 : 10 , m: m) 用 液 氮 磨 成 粉 状 , 加 入 10 mL 10 % TCA 丙 酮 配 制 , 内 含 体 积 分 数 0.07 % β 巯 - 基 乙 醇) , - 20 ℃ 沉 淀 1 h , 30 000× , 4 ℃ 离 心 15 min , 沉 淀 悬 浮 于 冷 丙 酮 内 含 0.07 % β 巯 基 乙 醇) , ( g - ( - 20 ℃ 静 置 过 夜 , 其 间 用 冷 丙 酮 内 含 0.07 % β 巯 基 乙 醇) 洗 2 次 , 离 心 后 沉 淀 悬 浮 于 质 量 分 数 80 % 丙 - 酮 中 , - 20 ℃ 静 置 1 h 再 离 心 , 沉 淀 低 温 真 空 干 燥 成 粉 , 置 - 80 ℃ 保 存 备 用 。
国 家 863 ” 划 2007AA100701) 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 30170639) 和 农 业 部 948 项 目 甘 蔗 良 种 和 技 术 引 进 与 推 广 ” 2006- G37) “ 计 ( ( “ ( 阙友雄


男 , 1980 年 生 , 博 士 研 究 生 。 研 究 方 向 : 植 物 分 子 生 物 学 相 关 研 究 。 电 话 : 0591- 83768242 , E- mail : queyouxiong@yahoo.com.cn 修 回 日 期 : 2007- 12- 18

通讯作者

收 稿 日 期 : 2007- 06- 26

2期

阙友雄等: 甘蔗与黑穗病菌互作的叶片差异蛋白分析

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1.2.3

蛋白裂解和含量测定

称 取 50 mg 的 蛋 白 干 粉 , 加 入 600 μ 样 品 裂 解 液 (7 mol/L 尿 素 , 2 mol/L L

硫 脲 , 体 积 分 数 4 % CHAPS , 1 % pH 3.5- 10 两 性 电 解 质 , 40 mmol/L DTT) , 30 ℃ 水 浴 裂 解 2 h , 20 , 000× g 离 心 20 min , 上 清 液 用 于 双 向 电 泳 分 析 。 上 清 液 中 蛋 白 含 量 采 用 Bradford 法 [8] 测 定 。

1.2.4

第 1 向等电聚焦

用 pH 4 ̄7 , 24 cm 长 的 IPG 干 胶 条 (Amersham Biosciences 公 司 ) 在 Amersham

EttanIPGphorⅡ 仪 器 上 进 行 第 1 向 等 电 聚 焦 , 采 用 主 动 水 化 , 水 化 液 (6 mol/L 尿 素 , 2 mol/L 硫 脲 , 2 %
上样总体积为 450 μ , L CHAPS, 体积分数 0.5 % IPG buffer , 体积分数 0.4 % DTT , 体积分数 0.002 % 溴酚蓝 ) 。 上 样 量 1 , 000 μ 蛋 白 , 样 品 加 到 持 胶 槽 后 , 剥 去 胶 条 上 的 塑 料 保 护 膜 , 胶 面 朝 下 , 胶 两 端 紧 贴 槽 底 电 极 , g 注意正负极不要放反, 避免胶条与样品液间的产生气泡, 在胶条上覆盖 1.5 mL 的覆盖油, 防止样品液挥发, 盖上盖子, 放到 Amersham Ettan IPGphorⅡ 仪器上开始电泳。等电聚焦的运行参数为: 20 ℃ 、 μ 胶条、 50 A/

30 V 、 h ; 500 V , 1 h ; 1 000 V , 2 h ; 3 000 V , 1 h ; 8 000 V , 7.5 h 。 总 运 行 65 860 Vh 。 12 1.2.5
第 2 向 SDS- PEGE 第 1 向 等 电 聚 焦 完 成 后 , 接 着 进 行 胶 条 的 平 衡 , 含 1 % DTT 的 平 衡 液 ( 6 mol/L 尿 素 , 50 mmol/L Tris- HCl pH8.8 , 体 积 分 数 2 % SDS , 质 量 分 数 30 % 甘 油 , 质 量 分 数 0.002 % 溴 酚 蓝) 平 衡 15 min 后 , 用 含 质 量 分 数 2.5 % 碘 代 乙 酰 胺 (IAA) 的 平 衡 液 再 平 衡 20 min , 去 除 多 余 DTT ; 经 两 步 平 衡 进 行 第 2 向 SDS- PAGE 电 泳 , 胶 浓 度 为 质 量 分 数 12.5 % T , 2.6 % C , 待 胶 凝 固 后 , 将 胶 条 轻 轻 推 入 玻 璃 板 中 , 与 胶 面 良 好 接 触 避 免 产 生 气 泡) , 然 后 用 含 痕 量 溴 酚 蓝 的 质 量 分 数 0.5 % 琼 脂 糖 用 电 ( ( ( 泳 缓 冲 液 配 制) 进 行 封 胶 , 再 开 始 电 泳 15 mA/ 板 , 当 溴 酚 蓝 前 沿 进 入 凝 胶 后 加 大 电 流 达 30 mA/ 板) , 直 至 溴 酚 蓝 前 沿 跑 到 离 胶 底 部 0.5 cm 处 , 停 止 电 泳 。 电 泳 结 束 后 , 取 出 凝 胶 , 采 用 Neuhoff 胶 体 考 染 法 [9] 染 色 。

1.2.6

胶内酶解和质谱分析

本项内容委托复旦大学生物医学研究院进行。质谱分析与数据库检索,

具 体 操 作 如 下 : 将 完 全 干 燥 的 肽 段 重 新 溶 解 于 0.7 μ 0.5 g/L CHCA 溶 液 ( 溶 剂 , 体 积 分 数 0.1 % TFA+ L 体 积 分 数 50 % ACN) 中 , 并 将 其 全 部 点 到 不 锈 钢 MALDI 靶 板 上 , 并 在 室 温 下 自 然 干 燥 。样 品 用 4700 型 串 联 飞 行 时 间 质 谱 仪 [4700 Proteomics Analyzer (TOF/TOFTM)(Applied Biosystems , USA)] 进 行 质 谱 分 析 , 激 光 源 为 355 nm 波 长 的 Nd : YAG 激 光 器 , 加 速 电 压 为 20 kV , 采 用 正 离 子 模 式 和 自 动 获 取 数 据 的 模 式 采 集 数 据 。 PMF 质 量 扫 描 范 围 为 700 D - 3 , 500 D , 且 强 度 最 大 的 5 个 峰 进 行 串 联 质 谱 分 析 ; 谱 图 用

myoglobin 酶 解 肽 段 进 行 外 标 校 正 。所 得 结 果 用 GPS(GPS Explorer TMsoftware , Applied Biosystems , USA)
! MASCOT(Matrix Science , London , UK) 进 行 数 据 库 检 索 。搜 索 参 数 设 置 : 数 据 库 为 NCBI(nr) ; 检 索 种 属 为 : all , 数 据 检 索 的 方 式 为 combined ; 最 大 允 许 漏 切 位 点 为 1 ; 酶 为 胰 蛋 白 酶 。 质 量 误 差 范 围 设 置 : PMF

0.3 D , MS/MS 0.4 D ; 在 数 据 库 检 索 时 胰 酶 自 降 解 峰 和 污 染 物 质 的 峰 都 手 工 剔 除 。


2.1

结果 与 分 析
甘蔗黑穗病菌胁迫下甘蔗叶片蛋白质组双向电泳图谱分析 提 取 黑 穗 病 菌 接 种 前 后 甘 蔗 高 抗 和 高 感 品 种 NCo376 和 Ya71- 374 叶 片 全 蛋 白 , 用 pH 3 ̄10 的 IPG

胶条进行双向电泳, 结果表明, 甘蔗叶片全蛋白主要集中于等电点弱酸性到中性之间, 等电点在 4 以下 对 极 酸 性 蛋 白 和 8 以 上 的 碱 性 蛋 白 较 少 。 高 抗 品 种 NCo376 和 高 感 品 种 Ya71- 374 接 种 前 后 蛋 白 质 双 向 电泳图谱的比较可以看出, 抗、 品种间甘蔗叶片蛋白表达存在一定差异; 同一品种的对照和处理间也 感 存 在 一 定 的 差 异 。 于 叶 片 蛋 白 在 PI 弱 酸 性 到 中 性 较 多 , 用 pH 3 ̄10 的 IPG 胶 条 未 能 充 分 分 开 , 进 一 步 由 用 窄 pH 的 胶 条 pH 4 ̄7) 进 行 双 向 电 泳 。 通 过 双 向 电 泳 和 银 染 , 获 得 蛋 白 二 维 凝 胶 图 谱 , 用 蛋 白 识 别 软 ( ( 件 进 行 图 谱 分 析 , 每 块 胶 上 可 以 分 离 得 到 500 ̄700 个 左 右 的 蛋 白 质 点 见 图 1 和 图 2) 。 电泳结果还表明, 用 pH 4 ̄7 的 IPG 胶 条 分 离 叶 片 蛋 白 效 果 较 好 , 从 图 中 可 以 看 出 , 无 论 是 高 抗 品 种

NCo376 还是高感品种 Ya71- 374 , 其对照和处理叶片蛋白表达表现出明显的差异, 这既体现在蛋白表达量
上, 也表现在出现一些诱导或者缺失的蛋白; 另外高抗和高感品种之间的对照和处理的蛋白表达差异不 同, 这也一定程度上说明了高抗和高感品种在接种黑穗病菌前后对黑穗病菌胁迫的分子应答是不同的。

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热 带 作 物 学 报

29 卷

2.2

两 个 差 异 蛋 白 点 的 MALDI- TOF - TOF MS 分 析 挑取高抗和高感品种接种黑穗病菌后差异表达明显上调的蛋白质点各一个进行串联质谱分析, 其

肽 指 纹 图 谱 和 串 联 质 谱 图 见 图 3, 对 应 编 号 见 表 1。

高 抗 品 种 NCo376 接 种 甘 蔗 黑 穗 病 菌 后 , 上 调 特 异 表 达 的 蛋 白 为 NBS 类 型 的 抗 性 蛋 白 ( NBS- type

resistance protein ) , 在 已 经 分 离 克 隆 的 植 物 抗 病 基 因 中 , 有 9 种 植 物 共 19 个 基 因 编 码 含 有 NBS 的 序 列 ,
该 蛋 白 的 NBS 结 构 域 具 有 核 酸 结 合 的 功 能 。 在 高 感 品 种 Ya71- 374 接 种 处 理 的 材 料 中 , 上 调 特 异 表 达 的 蛋 白 为 rieske Fe- S precursor protein , 该 蛋 白 是 叶 绿 体 内 细 胞 色 素 b6/f 复 合 体 的 亚 基 , 是 叶 绿 体 光 合 传 递 链 中 必 不 可 少 的 组 成 部 分 , 因 此 , 该 蛋 白 的 上 调 表 达 可 能 与 叶 绿 体 内 积 累 较 多 的 H2O2 , 从 而 改 变 了 叶 绿 体 内 的 氧 化 还 原 状 态 有 关 , 可 能 也 是 Ya71- 374 对 黑 穗 病 菌 胁 迫 所 作 出 的 一 种 蛋 白 水 平 的 应 答 。以 上

2 个 表 达 上 调 的 蛋 白 已 经 克 隆 测 序 , 经 过 氨 基 酸 序 列 比 对 , 分 离 自 NCo376 的 上 调 特 异 表 达 蛋 白 与 已 登
录 的 木 薯 ( Manihot esculenta ) NBS- type resistance protein 同 源 性 最 高 , 分 离 自 Ya71- 374 的 上 调 特 异 表 达 蛋 白 与 已 登 录 的 水 稻 ( Oryza sativa ) rieske Fe- S precursor protein 同 源 性 最 高 , 见 表 1 。

2期
表1
蛋白编号

阙友雄等: 甘蔗与黑穗病菌互作的叶片差异蛋白分析 高抗和高感甘蔗黑穗病品种接种甘蔗黑穗病菌后上调表达的蛋白质点
来 源 登录号 鉴定的蛋白名称 物 种

139

P1 P2

NCo376 Ya71- 374

gi|30408003 gi|50508582

NBS type resistance protein rieske Fe- S precursor protein

Manihot esculenta Oryza sativa







植物受病原体侵染后, 在病原体刺激下, 植物细胞会产生的防御反应, 出现一些生化变化, 特别是 一些抗病相关蛋白的表达。笔者利用双向凝胶电泳技术, 发现不同抗性类型的品种在对照组和处理组 之 间 叶 片 全 蛋 白 的 2D 图 谱 存 在 差 异 。 进 一 步 对 上 调 差 异 表 达 的 2 个 蛋 白 进 行 质 谱 鉴 定 , 发 现 NCo376 和 Ya71- 374 接 种 甘 蔗 黑 穗 病 菌 后 , 上 调 表 达 的 蛋 白 分 别 为 NBS type resistance protein 和 rieske Fe- S

precursor protein , 表 明 确 实 有 抗 病 蛋 白 表 达 并 参 与 了 寄 主 对 黑 穗 病 菌 的 抗 性 响 应 , 是 甘 蔗 对 甘 蔗 黑 穗 病
菌侵染应答的蛋白基础。 普 遍 认 为 分 子 水 平 上 植 物 的 抗 病 性 是 由 抗 病 基 因 编 码 的 抗 病 蛋 白 介 导 的 防 御 反 应 。在 已 经 分 离 克 隆 的 植 物 抗 病 基 因 中, 有 9 种 植 物 共 19 个 基 因 编 码 含 有 NBS 结 构 域 的 序 列 , 该 结 构 域 具 有 核 酸 结 合 的 功 能 。 在 RAS 族 、 ATPase 延 伸 因 子 、 蛋 白 等 蛋 白 家 族 中 都 发 现 有 NBS 位 点 , 而 这 些 蛋 白 家 族 广 泛 参 G 与 细 胞 生 长 、 化 、 胞 骨 架 构 成 、 泡 转 运 和 对 病 原 体 防 御 反 应 [10] , NBS 出 现 在 很 多 ATP GTP 结 合 蛋 分 细 小 / 白中, 虽然这些基因产物本身没有激酶活性, 但它们可能激活激酶或 G 蛋白, 参与蛋白质磷酸化, 从而 放 大 抗 病 反 应 信 号 , 使 植 物 对 病 原 产 生 过 敏 反 应 (hypersensitive response , HR) [11] 。 研 究 中 甘 蔗 高 抗 黑 穗 本 病 品 种 中 NBS 类 蛋 白 基 因 的 大 量 表 达 可 能 正 是 其 具 有 高 抗 病 性 的 基 础 。 进一步的研究除对更多的差异表达蛋白进行质谱分析外, 还同时结合生理生化分析, 以及从蛋白 水平综合解析甘蔗品种对黑穗病菌抗性的蛋白基础与生理生化反应。
参 考 文 献
1 龚 得 明 , 陈 如 凯 , 林 彦 铨 . 甘 蔗 受 黑 穗 病 菌 侵 染 后 苯 丙 烷 类 代 谢 变 化 及 与 其 抗 性 的 关 系 [J]. 福 建 农 业 大 学 学 报 , 1995 , 24 ( 4 ) : 394 ̄398 2 朱 友 林 , 吴 健 胜 , 王 金 生 . 水 稻 对 白 叶 枯 病 菌 抗 性 相 关 蛋 白 的 双 向 电 泳 分 析 [J]. 中 国 农 业 科 学 , 2000 , 33 (4) : 91 ̄93 3 李 跃 建 , 姬 红 丽 , 彭 云 良 . 应 用 双 向 电 泳 技 术 研 究 条 锈 菌 侵 染 后 小 麦 蛋 白 质 的 改 变 [J]. 四 川 大 学 学 报 , 2005 , 37 (2) : 80 ̄85 4 Zhou W , Eudes F , Laroche A. Identification of differentially regulated proteins in response to a compatible interaction between the pathogen Fusarium graminearum and its host , Triticum aestivum [J]. Proteomics. 2006 , 6 (16) : 599 ̄609 5 Mehta A , Rosato Y B. Differentially expressed proteins in the interaction of Xanthomonas axonopodis pv. citri with leaf extract of the host plant[J]. Proteomics , 2001 , 1(9) : 111 ̄118 6 Rep M , Dekker H L , Vossen J H , et al. Mass spectrometric identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus- infected tomato[J]. Plant Physiol. , 2002 , 130 (10) : 904 ̄917 7 Chen R Z , Weng Q M , Huang Z , et al. Analysis of resistance-related proteins in rice against brown plant hopper by two-dimensional elec- trophoresis[J]. Act Botani Sinica , 2002 , 44 : 427 ̄432 8 Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding [J]. Anal. Biochem. , 1976 , 72 : 248 ̄254 9 Candianol G , Bruschil M , Musante L. Blue silver : A very sensitive colloidal Coomassie G - 250 staining for proteome analysis [J]. Elec- trophoresis , 2004 , 25 : 1 327 ̄1 333 10 Baker B , Zambryski P , Staskawicz B , et al. Signaling in plant-microbe interactions[J]. Science , 1997 , 276 : 726  ̄ 733 11 Traut T W. The functions and consensus motifs of nine types of peptide segments that form different types of nucleotide binding - sites [J]. Eur J Biochem , 1994 , 222 (1) : 9 ̄19

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热 带 作 物 学 报

29 卷

Analysis of Pr otein Expr ession Patter ns of Leaves of Sugar cane Infected by Ustilago scitaminea
Que Youxiong Lin Jianwei Xu Liping Xu Jingsheng Zhang Muqing Ruan Miaohong Chen Rukai Fuzhou 350002 Liao Sufeng

Ministry of Agriculture Key Lab.of Eco- physiology & Genetic Improvement for Sugarcane Abstr act

Two sugarcane varieties, NCo376 (highly resistant), and Ya71- 374(highly susceptible), were inoculat-

ed with Ustilago scitaminea in an experiment.Two dimensional (2- D) electrophoresis was employed to analyze the protein expression patterns of the sugarcane leaves after inoculation. The results showed that there were significant differences in protein expression pattern between varieties, and between the inoculated and the control of the same varieties. Some protein expressions, either up- regulated or down- regulated, were observed. Additional analysis of two up - regulated proteins by means of the Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time - of - Flight Mass Spectrometry (MALDI - TOF - MS) was carried out in the inoculated varieties NCo376 and Ya71 - 374. Results showed that two proteins were NBS type resistance protein and Rieske Fe- S precursor protein, respectively.It was possible that these two proteins played an important but different role in the reaction to Ustilago scitaminea infec- tion. Key wor ds sugarcane Ustilago scitaminea two dimensional electrophoresis MALDI- TOF- MS


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