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苦豆子内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[1]


第 18 卷   4 期 第 塔            里 木 大 学 学 报 Vol 18 No. 4 .                                         2006 年 12 月 Journal of Tarim University Dec. 2006

   文章编号 : 1009 - 0568 ( 2006 ) 04 -

0068 - 02

苦豆子内生细菌的分离及拮抗菌的筛选
龚明福
(1   新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室 ,新疆 阿拉尔   843300 ) (2   西北农林科技大学生命科学学院 ; 西北农林科技大学微生物研究中心 ,陕西 杨陵  712100 )
摘要  从塔里木盆地不同地点采集苦豆子 ,从不同组织中分离内生细菌 ,并用分离得到的内生细菌对病原真菌做皿内拮抗试 验 ,筛选有生物拮抗活性的内生菌菌株 。结果表明 ,不同来源的苦豆子内生细菌数量上有较大差异 , 苦豆子不同组织内生细 菌的种类和数量也有差异 。从苦豆子各种组织中分离得到 129 株内生细菌 ,其中 5 株对多种植物病原真菌具有拮抗作用 ,这 些菌株在苦豆子植株内均可定殖 ,属于芽孢杆菌 。 关键词   苦豆子 ; 内生细菌 ; 分离 ; 拮抗菌 中图分类号 : S436. 412. 15              文献标识码 : A
1, 2 3

 林世利   贺江舟  孙晓棠   韦革宏

1

1

1

2

Isola tion of en tophytic bacter ia in S opho ra a lopecu ro ides and screen in g of An tagon istic bacter ia
  L in Shili  J iang Zhouhe  Sun Xiaotang  W ei Gehong ( 1 Key Laboratory of Protection & U tilization of B iological Resources in Tari B asin of Xinjiang m Production & Construction Group , A lar, Xinjiang 843300 )
Gong M ingfu ( 2 College of L ife Sciences, Institute of M icrobiology, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100 )
Abstract 129 strains of entophytic bacteria were isolated from different p lant tissues of S ophora a lopecu roides distributing in Tarim Ba2 sin. Among these bacteria, 5 strains showed good antagonistic effectiveness to some p lant pathogenic fungi, could be colonized in the p lants, and were identified as B acillus The results also showed that the number of entophytic bacteria differed in different tissues of S o2 .
phora a lopecu roides and in S ophora a lopecu roides from different samp le p laces .
1, 2 3 1 1 1 2

Key words  S ophora a lopecu roides; ntophytic bacteria; isolation; antagonistic bacteria

   苦豆子别名草本槐 、 苦豆根 ,为豆科多年生耐盐 旱生草本植物 。苦豆子含有多种单体生物碱 , 并具 [1] 有抗癌 、 提高免疫力等活性 。它由于能与根瘤菌 共生固氮而含有丰富的蛋白质 , 具有较高的饲用价 值。 苦豆子的内生细菌由于长期存在于苦豆子内 , 与苦豆子建立了和谐的关系 , 有可能产生与苦豆子 产生的相同或相似的生物碱 , 或者与苦豆子植物较

高的抗逆能力有关 , 因此系统研究苦豆子内生细菌 对于合理开发苦豆子资源具有重要的意义 。我们对 塔里木盆地苦豆子内生细菌进行了分离 , 并测定了 苦豆子内生细菌对多种病原真菌的拮抗性 , 现将结 果报道如下 。

1  材料与方法

收稿日期 : 2006 - 04 - 28 资助项目 : 塔里木大学校长基金重点资金项目 (编号 : TDZKZD06001) ; 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课 题 (编号 : BR0607BR0605) ; 教育部新世纪优秀人才支持计划 (编号 : NCET - 04 - 0953 ) ; 新疆生产建设兵团科技攻关计划项目 (编号 : 2006GG26) 。 作者简介 : 龚明福 ( 1970 - ) ,男 ,副教授 ,硕士 ,主要从事微生物资源研究 。      3 为通讯作者

第 4期

龚明福等 : 苦豆子内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

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1. 1   分离材料

从塔里木盆地不同地点采集苦豆子植株 , 包括 根瘤 、 、 、 、 、 、 。 根 茎 叶 花 果 种子 1. 2   培养基 细菌分离培养用牛肉膏蛋白胨培养基 ( NA 培 养基 ) ,根瘤菌分离培养用 Y 培养基 、 MA 真菌培养 及拮抗性测定用 PDA 培养基 。 1. 3   内生细菌分离与纯化 从塔里木盆地不同地点采集长势良好 、 无病虫 害的苦豆子植株 ,其根 、 、 、 、 、 茎 叶 花 果 种子分别用自 来水冲洗晾干后 ,各称取 5 g (果 10 g) ,用无菌水反 复冲洗 4 次 ~5 次 , 用 70 %乙醇浸泡消毒用 5 m in ~10 m in,用 2 %次氯酸钠表面消毒 5 m in~30 m in, 无菌水冲洗 3 次 ~4 次 , 取最后一次冲洗液 0. 1 m l 涂布无菌 NA 平板进行无菌检验 。每样品加 50 m l 无菌水在无菌研钵中研磨 ,静止 15 m in后 ,各取 0. 1 m l涂 NA 平板 。每处理重复 3 次 , 28 ℃ 黑暗培养 72 h,计算菌落数 ,根据菌落形态 、 颜色等挑选单菌落转 接 NA 斜面保存备用 。根瘤菌的分离培养方法参照 龚明福的方法 进行 。 1. 4   皿内拮抗细菌的筛选 在直径为 9 cm 的 PDA 平板中加入 0. 1 m l菌 液 ,涂布均匀后 ,在平板上接入直径为 0. 7 φ 的病原 真菌菌丝块 , 28 ℃ 黑暗培养 4 d,测量抑菌圈 。取 0. 每处理重复 3 次 。靶标病原真菌包括 : 棉花黄萎病 菌、 甘兰黑斑病菌 、 西瓜枯萎病菌 、 小麦赤霉病菌 、 棉 花枯萎病菌 、 白菜黑斑病菌 、 辣椒枯萎病菌 、 苹果轮
CK 40 24 38 47 41 48 37 43 KDNB2 KDNB4 38% 54% 45% 23% 56% 52% 65% 77%
[3] [2]

纹病菌 。 1. 5   细菌检测 常规革兰氏染色 、 芽孢染色 。 1. 6   菌株在苦豆子内定殖测定
- 4 - 1 用含有苦豆子 10 μg m l 浓度的 NB 培养液 . 培养内生细菌 24 h,用涂抹叶片 、 注射茎秆等方法接 种 ,分别于不同时间取根 、 、 、 , 经 2 %次氯酸 茎 叶 花 [4]

钠表面消毒后 ,分离菌株 , 测定其定殖情况 , 以清水 处理组织为对照 。

2   结果与分析
2. 1   不同采样点苦豆子内生细菌数量

对塔里木盆地不同地点采集的苦豆子进行内生 细菌分离 ,结果表明来源不同的苦豆子植株 ,内生细 菌的种类和数量存在一定的差异 (见表 1 ) 。
表 1  不同采样点苦豆子各种组织部位 分离到的内生细菌菌株数 采样点 根瘤 乌恰 15 温宿 阿拉尔 合计
20 25 60

根 6
8 8 22

茎 4
6 7 17

叶 3
4 4 11

花 3
3 2 8

果 2
2 2 6

种子 合计 2 35
1 2 5 44 50 129

2. 2   苦豆子不同组织部位内生细菌数量

对分离自苦豆子不同组织部位的内生细菌数量 进行分析 ,结果表明 ,苦豆子不同组织部位的内生细 菌种类和数量也存在一定的差异 ,总体上来看 ,内生 细菌数量在苦豆子植株中的分布规律为沿根 、 、 茎 叶、 、 、 花 果 种子递减 (见表 1 ) 。

1 m l 无菌水涂布平板后接种真菌菌丝块为对照 。

表 2  五株内生细菌对常见植物病原真菌的拮抗作用 (单位 : mm )
KDNB5 25 10 10 25 17 27 13 10 38% 58% 74% 47% 59% 44% 65% 77% 10 10 10 17 10 10 10 10 KDNB6 75% 58% 74% 64% 76% 79% 73% 77% RKZ11261 22 10 11 20 15 15 10 10 45% 58% 71% 57% 63% 69% 73% 77%

病原真菌

菌落直径 菌落直径 抑菌率 菌落直径 抑菌率 菌落直径 抑菌率 菌落直径 抑菌率 菌落直径 抑菌率
26 14 26 35 33 35 27 34 35% 42% 32% 26% 20% 27% 27% 21% 25 11 21 36 18 23 13 10

棉花黄萎病菌 甘兰黑斑病菌 西瓜枯萎病菌 小麦赤霉病菌 棉花枯萎病菌 白菜黑斑病菌 辣椒枯萎病菌 苹果轮纹病菌

2. 3   拮抗病原真菌的内生细菌筛选

从不同采样点苦豆子的各种组织中分离得到内 生细菌 129 个菌株 。通过对峙生长法 , 测定了内生

细菌各菌株对 8 种病原真菌的皿内拮抗作用 , 其中 5 株内生细菌 ( RKZ11261 分离自根瘤 ) 对 8 种病原 真菌都有拮抗作用 (见表 2 ) 。 (下转第 80 页 )

80

塔            里 木 大 学 学 报

第 18 卷

围内没有发现波的散射及反射波的同相轴发生错断 现象 。基础以下 0 —15m 的深度范围内不存在空洞 及塌方现象 。 4. 2. 3   在基础纵向 III— III方向 ,可以判定该剖面
10m 深度的范围内不存在空洞 ,但在剖面线 9 ~14m 之间深度在 (已开挖的基坑底面线为 0 点 ) 4 ~7. 5m

为了保证建筑的使用安全 , 对地基处理的要求也提 出了更高的要求 ,我们需要了解空洞 、 采空区以及不 良的地质条件 , 并采取相应的处理方法 。本文详细 介绍了瞬态瑞雷面波在基础勘探中的数据采集 、 处 理及解译方法 。利用地震映象资料 , 叙述在该区域 的地质展布的情况 , 从而为整个建筑物的安全评价 供了科学依据 。
参考文献
[1 ]  杨成林 . 瑞雷波勘探 . 北京 : 地质出版社 , 1993. [2 ]  宋先海 ,肖柏勋 ,黄荣荣 ,. 用等厚薄层权重自适应迭代

之间有夹层 , 其剪切波速为 200m / s, 该剖面也不存 在空洞及塌方现象 。 4. 2. 4   在纵向的 V I—V I方向 ,在 200m s的波幅范 围内 ,也就是深度在 20m 的范围内 , 不存在软弱夹 层及不良地质体存在 。 根据以上四点可以确定在库车县国贸购物中心 大楼的地基范围内 , 基础下没有发现防空洞及塌方 现象 ,也不存在软弱夹层及其它不良的地质体 。

阻尼最小二乘法反演瑞雷波频散曲线 . 物探与化探 ,
2003, 27 ( 3 ) : 212 ~216. [3 ]  刘云祯 ,王振东 . 瞬态面波法的数据采集处理系统及应

用实例 . 物探与化探 , 1996, 20 (1) : 28 ~33.
[4 ]  肖柏勋 . 工程地球物理学进展 . 武汉 : 武汉水利电力大

5  结语
现代社会快速发展 ,城市建设的规模日益增大 ,
(上接第 69 页 ) 2. 4   拮抗内生细菌的初步鉴定

学出版社 , 2000.

对拮抗作用较强的 5 个菌株进行了形态观察和 [4] 常规染色 ,参照东秀珠等 的方法 ,将 5 个菌株均鉴 定为芽孢杆菌 (B acillus sp. ) 。

菌是否也具有较强的抗逆能力 , 还需进一步进行研 究。 3. 3   五株苦豆子拮抗性内生细菌对病原真菌的田 间防效还需进一步研究确定 。
参考文献
[1]  秦学功 ,元英进 . 苦豆子生物碱的研究与苦豆子的综

3   讨论
3. 1   从苦豆子上分离到 5 株内生细菌对 8 种植物

病原真菌有拮抗作用 , 其中 RKZ11261 分离自苦豆 子根瘤 。 5 株内生细菌均为 B acillus属 ,它们的种名 还待进一步研究确定 。 RKZ11261 为革兰氏阳性的 芽胞杆菌 ,不是根瘤菌 , 这表明在苦豆子根瘤中 , 存 在根瘤菌以外的内生细菌 。 3. 2   苦豆子根瘤中内生细菌数量较多 , 但多数为 [3] 根瘤菌 。苦豆子根瘤菌都具有较强的抗逆能力 , 苦豆子非根瘤内生细菌或根瘤内非根瘤菌的内生细

合利用 [ J ]. 中国野生植物资源 , 2000, 19 ( 4 ) : 30 ~32.
[ 2 ]  van Buren A M , Andre C, Ishim ru C A. B iological con2 83: 1406. [3]   龚明福 ,韦革宏 ,刘江华等 . 新疆苦豆子根瘤菌的数值 trol of the bacterial ring rot pathogen by endophytic bac2 teria isolated from potato [ J ]. phytopathology, 1993,

分类研究 [ J ]. 生物多样性 , 2005, 13 ( 1 ) : 75 ~80. 出版社 , 2001.

[4]   东秀珠 ,蔡妙英 . 常用细菌鉴定手册 [M ]. 北京 : 科学


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