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乳酸菌细菌素的分子生物学研究进展


董慧

什么是乳酸菌?细菌素?
? 乳酸菌是一类能够发酵糖类产生大量乳酸 的革兰氏阳性菌耐氧或碱性厌氧菌。包括 主要包括乳杆菌(Lactobacillus )、乳 球 菌 ( Lactococcus )、明 串 珠 菌 ( Leuconostoc )、 片 球 菌 ( Pediococcus )、 链 球 菌 (Streptococcus )、肠

球 菌 ( E nterococcus )、双 歧 杆 菌 (Bifidobacterium )等至少23个属。

? 许多乳酸菌能够产生具有杀菌或抑菌作用 的细菌素。 ? 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核 糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的 多肽或前体多肽, 抑菌范围不仅仅局限于同 源的细菌, 产生菌对其细菌素有自身免疫性。

1、乳酸菌细菌素的分类
基于分子量、 热敏感性和是否含修饰性氨 基酸, 可将乳酸菌细菌素大致分为四类: 小分子热稳定肽( small heat- stable peptide, SHSP) 大分子热不稳定蛋白( largeheat - labile p ro tein, LHL P ) 羊 毛 硫 抗 生 素( lantibiotics) 赖于两个或两个以上小肽分子协同作用的 细菌素

? ? ? ?

2、小分子热稳定肽(SHSP)

? ? ? ?

2.1遗传学分析 2.2结构上的共性 2.3转运机制 2.4作用机制

2.1、遗传学分析
对乳酸菌细菌素的分子遗传学研究表明许多 细菌素的产生与质粒相关。下面分析六种 质粒编码细菌素的遗传图谱,对于每一种细 菌素, 其结构基因总是与两个或多个相关基 因紧密排列构成一个类操纵子结构模块。

质粒编码细菌素的遗传图谱
? lactococcin A
lcnA 75 lciA 98

? lactococcin B
lcnB 68 lciB 91

? lactococcin M

lcnM 69

lcnM/b 77

lciM 154

乳脂乳球菌 9B4 产生的 lactococcin A、 B 和 M , 其结构( lcn)与免疫( lci)基因均定位于一个 60kb 大小的接合质粒(P9B4- 6)上。

对乳酸乳球菌双乙酰亚种WM 4 的 lactococcin A 操纵子的研究结果证实该细 菌素的结构与免疫基因位于一个 136kb 的 质粒(pN P2)上, 序列分析表明这两个基因 与 9B4 的 lactococcin A 的结构与免疫基 因相同。值得一提的是,WM 4 的 lactococcin A 操纵子结构中除 lcn A 和 lciA 基因外, 其上游还含有 lcn C 和lcn D 基因,在lactococcin A 的表达及分泌中起 重要作用

嗜酸乳杆菌11088的细菌素基因
? lactacin F
laf 75 ORFX ORFY 32 62 ORFZ 124

后三个读码框可能与细菌素的表达分泌 有关,有待研究。 利用穿梭载体将该接合质粒上一段包含 lactacin F 结构和免疫基因在内的 212kb 的DNA 片段克隆、 导入不产 lactacin 的同源乳杆菌中, 表达成功

明串珠菌的细菌素基因
? leucocin A - UAL 187
leuA 58-61 ORF2 113

ORF2可能负责 免疫性

? pediocin PA - 1
pedA 62 pedB 112 pedC 174 pedD 724

将此操纵子在重组质粒中克隆并导入E.co li表达, 则产 生并分泌出了有生物活性的pediocin ped编码的724个氨基酸的蛋白,参与运输与传递。

2.2结构上的共性
? N - 末端信号肽长度均为 18~ 21 氨基酸 ? 前体肽的起始氨基酸为Met, 紧随其后的氨 基酸残基通常为Lys残基 ? N - 末端信号肽的- 1 和- 2 位置上为两个 Gly 残基 ? 成熟的细菌素其N - 末端+ 1 位置上通常是 Lys 或Arg 残基

L actococcin A、 B、 M 的N - 末端信号 肽呈现高度同源, 提示其操纵子结构可能受 同一类启动子调控,而信号肽酶切位点 G—G 后的氨基酸序列则无明显类似性, 基 于启动子和N - 末端信号肽的高度同源性, 可以确定此三种细菌素生物学功能上的变 异并非源于转录水平的

研究表明, 大量分泌蛋白前体的信号肽序列 都有一个保守的三联结构: 一个带正电荷的 N - 端区域, 一个中央疏水区域和一个极性 的C- 端区域, 三个区的长度分别为 1~5、 7~ 15 和3~ 6 个残基, 其中C- 末端为信号 肽酶的识别位点, 其模式为XXA (G)↓(X 为 任意一种氨基酸, ↓为酶切位点) 二级结构预测显示 lactacin F 分子N - 端有 一段 A - 螺旋, 信号肽酶切位点处则有一个 B - 转角

值得一提的是, lactococcin A、 B 和M 的 前体肽- 3 位置上均为Asn 残基, 这在其它 分泌蛋白前体的信号肽中极为罕见。Holo 等人认为 lactococcin A 的成熟过程是两 步行为: 信号肽酶首先水解 Gly- Gly 之间的 肽键, 移去前体细菌素N - 端 20 个氨基酸大 小的信号肽, 然后再水解去除剩余肽段的N 端 Gly 残基, 最后形成一个 54 氨基酸大小 的成熟细菌素

2.3转运机制
? 分析SHSP 的N - 端先导序列发现并没有典 型的信号肽结构, 除 lactacin F 外, 其它 SHSP 的N - 端先导序列中缺乏分泌蛋白信 号肽所共有的中央疏水区, 其前导序列较短, 且含有数个酸性氨基酸残基。由此提示 SHSP 中可能存在一种新型的转运机制

? 由前面讨论可知,WM 4 的 lactococcin A 结构基因上游的 lcn C、 lcn D 基因可能参 与细菌素表达及分泌 ? lcn C 和 lcn D 基因与G-菌中负责蛋白分泌 的基因高度同源

研究发现 I L 1403 染色体上部分序列与WM 4 的 lactococcin A 基因簇序列高度同源, 提示I L 1403 染色体上可能含有类似于 lcn C、 lcn D 的基因。 由此,将携有 lactococcin A 结构和免疫基因的穿梭质粒 导入I L 1403, 借助 I L 1403 染色体上相应 lcn C 和 lcn D 基因的互补作用, 就可以合 成有生物活性的 lactococcin A。

2.4作用机制
? 发现纯品 lactococcin A 能够增加敏感株 的膜通透性, 导致膜电势崩溃, 使胞内和膜 质体内的氨基酸、 ATP 等营养物质外流, 但对脂质体无效 lactococcin 在细胞膜上形成亲水性通透孔 道是经膜上特定受体蛋白介导, 与膜电位无 关, 因此又称这类细菌素为非能量依赖型细 菌素, 其作用主要是破坏膜功能的稳定性(如 能量转导)。

两种细菌素对脂质体无效进一步证实其抑菌 作用依赖于膜上特定受体蛋白。携有 lactococcin A 和lactococcin B 免疫基因 的细胞能对这两种细菌素产生抗性,推测免疫 蛋白可能就定位于细胞膜上。 免疫蛋白与细 胞膜表面特定受体蛋白的靶位点结合后, 使 该受体蛋白不能再介导细菌素在细菌细胞膜 上形成亲水孔道, 致使细菌对细菌素产 生抗性。 简言之, 细菌素免疫蛋白的存在抑制了膜上 亲水孔道的形成。

 3、大分子热不稳定蛋白细菌素 (LHL P)
这类细菌素都是产生于乳杆菌属, 包括 helveticin J、lacticin A、 lacticin B、 acidophilucin A、和caseicin 80 等, 其分子量较大(> 30kDa) , 对热敏感 (90℃处理 30m in, 失活)。目前, 对这 类细菌素的研究不多, 仅 helveticin J 的研究较为深入。

? helveticin J 是由 lactobacillus helveticus (瑞士乳杆菌)481 产生的一个 染色体编码的 37kDa 的细菌素, 抑菌谱较 窄, 仅对一些同源乳杆菌有效
1 2 3 4 5 6

1-启动子 2-反向重复序列,可能与调控有关 3-核糖体结合区域 4-开放读码框ORF2,315bp , 编码一个 1118kDa 的未知功能蛋白 5-开放读码框ORF3,999bp,结构基因 6-ρ- 终止子

4、羊毛硫抗生素( lantibiotics)
? lantibiotics 的显著特点是分子内含有非编 码氨基酸, 包括羊毛硫氨酸、 B - 甲基羊毛 硫氨酸、 脱氢丙氨酸(DHa)和脱氢丁氨酸 (DHb )。非编码氨基酸的存在侧面提示了 lantibiotics 在形成过程中必定经过了翻译 后的酶修饰与加工。 ? 根据 lantibiotics 的分子结构可将其细分 为两类: 一类是线型的, 另一类是环型的。

线性分子nisin ? nisin 前体肽由57个氨基酸组成, 其中 N - 端 23 个残基构成信号肽区; 信号肽 在细胞表面被信号肽酶水解去除后, 释 放出成熟的、 有生物活性的nisin。 ? nisin 是一种含 34 个氨基酸的小肽, 分 子量约为3500Da, 分子内不含芳香氨 基酸, 但含有DHa、 DHb、 羊毛硫氨 酸和 B - 甲基羊毛硫氨酸。

? nisin 的结构基因(nis A )位于染色体的可接 合转座子上, 转座子大小为70kb, 其中在 10kb的片段上分布着 nis A、 B、 T、 C、 Z、 P 和K 基因, 构成一个长度约为815kb 的多顺反操纵子, 其中5′ - 端有一个核糖体 结合位点, 3′ - 端有一个终止密码子和不依 赖于ρ因子的转录终止子; 多顺反子mRNA 含有RNA 修饰、 加工信息, 加工后产生一 个267kb 的mRNA 转录产物。

nisin的作用机制
? nisin 是一个疏水的带正电荷的小肽, 其作 用机制与其它 lantibiotics 相似, 作用靶位 点是细菌细胞膜。在一定膜电位存在的条 件下, nisin 与细菌细胞膜结合形成通透性 孔道结构, 使A TP、 K+等小分子和离子通 过孔道流失, 造成细胞膜渗漏和去极化, 膜 内外能差消失, 因其作用需膜电位的存在, 故又称为能量依赖性细菌素。

环形分子lactocin S
? 分子中有 2 个羊毛硫氨酸, 3 个Dha 和 1个 DHb ? lactocin S 的结构及免疫基因定位在粟酒 乳杆菌L 45 的一个50kb 质粒上, 负责 lactocin S 前体肽翻译后修饰及跨膜转运 的基因也都位于同一质粒上


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