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蛋白质含量测定方法比较
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四 种古老的经典方法,即考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法(Lowry 法)和紫外吸收法。另外还 有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法, 即考马斯亮蓝法 (Bradford 法) 其中 B

radford 。 法和 Lowry 法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏 10~20 倍,比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。在 选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存 在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 Folin—酚试剂法(Lowry 法) (一)实验原理 在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中 的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原, 产生深兰色 (钼兰和钨兰 的混合物) 。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。
(这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间, 标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、 甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%) ,硫酸纳(1%) ,硝酸纳(1%) ,三氯乙酸 (0.5%) ,乙醇(5%) ,乙醚(5%) ,丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校 正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会 色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度 1~2 倍。 进行测定时,加 F olin—酚试剂时要特别小心, 因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定, 但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生, 故当 Folin 一酚试剂加到 碱性的铜—蛋白质溶液中时, 必须立即混匀, 以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前, 还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达 5mg。通常测定范围是 20~250mg。 )

(二)试剂与器材 1.试剂 (1)1. 试剂甲:碱性铜试剂溶液中,含 0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和 0.05% 硫酸铜,配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后,最后加入。 2. 试剂乙:与前面的基本法 相同。临用时加蒸馏水稀释 8 倍。 3. 标准蛋白质溶液: 2. 器材 (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)秒表 (4)试管 16 支 (三)操作方法
标准曲线的测定:取 16 支大试管,1 支作空白,3 支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入 0,0.1, 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 毫升标准蛋白质溶液(浓度为 250mg/ml) 。用水补足到 1.0 毫升,然后每支试管加 入 5 毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20~25℃)放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂 乙(Folin—酚试剂) ,同样立即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30 分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于 700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白 质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。注意:因 Lowry 反应的显色随时间不断加深,因 此各项操作必须精确控制时间,即第 1 支试管加入 5 毫升试剂甲后,开始计时,1 分钟后,第 2 支试管加 入 5 毫升试剂甲,2 分钟后加第 3 支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟,则第 1 支 试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙,1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙,2 分钟后加第 3 支试管,余此 类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置 30 分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多 试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加 入的量 (毫升) 并按由左至右, , 由上至下的顺序, 逐管加入。 最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量 (微

克)和测得的吸光度值。 Folin—酚试剂法实验表格:

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4

0.6 0.8 1.0 (250mg/ml) 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 (约 250mg/ml) 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质 的量(mg) 吸光度值(A700)

(二)操作步骤 样品的测定:取 1 毫升样品溶液(其中约含蛋白质 20~250 微克) ,按上 述方法进行操作, 1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。 取 通常样品的测定也可与标准曲线 的测定放在一起,同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面,再增加 3 个试管。如上表中 的 8、9、10 试管。 根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而 计算出样品溶液的蛋白质浓度。 注意,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸, 显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。 因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度 (相对于标准蛋白质) 。 考马斯亮兰法(Bradford 法) (一)实验原理 考马斯亮兰 G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收 峰的位置(max) ,由 465nm 变为 595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为, 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在 595nm 下测定的吸光度值 A595,与蛋白质浓度成正比。
Bradford 法的突出优点是: (1)灵敏度高,据估计比 Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达 1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而 光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。 (2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个 样品的测定,只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要 2 分钟即可完成,其颜色可以 在 1 小时内保持稳定,且在 5 分钟至 20 分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费 时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和 蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨 酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差, 在制作 标准曲线时 通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的 干扰物质有: 去污剂、 Triton X-100、 十二烷基硫酸钠 (SDS) 0.1N 的 NaOH。 和 (如同 0.1N 的酸干扰 Lowary 法一样) (3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用 Beer 定律进行计算,而只能用标准曲线来测定 。 未知蛋白质的浓度。

(二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液,用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA),配制成 1.0mg/ml 和 0.1mg/ml 的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰 G—250 染料试剂:称 100mg 考马斯亮 兰 G—250,溶于 50ml 95%的乙醇后,再加入 120ml 85%的磷酸,用水稀释至 1 升。 2. 器材: (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管 16 支 (三)操作方法 1. 标准方法 (1)取 16 支试管,1 支作空白,3 支留作未知样品,其余试管分为两
组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用 1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1ml, 然后用无离子水补充到 0.1ml。 最后各试管中分别加入 5.0ml 考马斯亮兰 G—250 试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除) 。未知样 品的加样量见下表中的第 8、9、10 管。 (2)加完试剂 2~5 分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计 上测定各样品在 595nm 处的光吸收值 A595,空白对照为第 1 号试管,即 0.1mlH2O 加 5.0mlG—250 试剂。 注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色) ,可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量 95%的乙醇 荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格: 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约 1.0mg/ml) 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 G-250 试剂 5.0 5.0 5.0 5.0

5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量(mg) 光吸收值 (A595)

(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值 A595 为纵座标,作图,即得到一条标 准曲线。 由此标准曲线, 根据测出的未知样品的 A595 值, 即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 A595 约为 0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时 (10 -100mg/ml),可将取样量(包括补加的水)加大到 0.5ml 或 1.0ml, 空白对照则分别为 0.5ml 或 1.0ml H2O, 考马斯亮蓝 G-250 试剂仍加 5.0ml, 同时作相应的标准曲线, 测定 595nm 的 光吸收值。 紫外吸收法 (一)实验原理 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使 蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质 含量成正比。此外,蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下, 蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如生化制备中常 用的(NH4)2SO4 等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只 需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物 质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质, 有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核 酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适 当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一 定的误差。 此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因 pH 的改变而有变化,因此要注意溶 液的 pH 值,测定样品时的 pH 要与测定标准曲线的 pH 相一致。

1. 280nm 的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸在 280nm 处具有最大 吸收,且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大,因此测定蛋白质溶液在 280nm 处的 吸光度值是最常用的紫外吸收法。 测定时,将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中,用配制 蛋白质溶液的溶剂(水或缓冲液)作空白对照,在紫外分光度计上直接读取 280nm 的吸光 度值 A280。蛋白质浓度可控制在 0.1~1.0mg/ml 左右。通常用 1cm 光径的标准石英比色皿, 盛有浓度为 1mg/ml 的蛋白质溶液时,A280 约为 1.0 左右。由此可立即计算出蛋白质的大致 浓度。
标准曲线的测定:取 6 支试管,按下表编号并加入试剂: 管号 1 2 3 4 5 6 BSA(1.0mg/ml) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280 用第 1 管为空白对照,各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定 吸光度 A280,以 A280 为纵座标,各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横座标作图,标准曲线应为直线, 利用此标准曲线,根据测出的未知样品的 A280 值,即可查出未知样品的蛋白质含量,也可以用 2 至 6 管 A280 值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的 A1%1cm,280nm 2. 280nm 和 260nm 的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收, 280nm 处的吸收比蛋白质强 10 倍 在 (每克) 但核酸在 260nm 处的吸收更强, , 其吸收高峰在 260nm 附近。核酸 260nm 处的消光系数是 280nm 处的 2 倍,而蛋白质则相反,280nm 紫外 吸收值大于 260nm 的吸收值。通常: 纯蛋白质的光吸收比值:A280/A260 ? 1.8 纯核酸的光吸收比值: A280/A260 ? 0.5 含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其 A280 和 A260,由此吸收差值,用下面的经验公 式,即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度=1.45×A280-0.74×A260 (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已 知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。


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