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SOD POD CAT酶活测定


0.067mol/L pH7.0 磷酸缓冲液 分子量 0.067mol PH7.0(1000ml 磷酸缓冲液)所需量(g) 7.1184g Na2HPO4.2H2O 178.05 Na2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g KH2PO4 136.09 3.6292g Na2HPO4.2H2O 7.1184g (或Na2HPO4.12H2O 14.4004g)+ K

H2PO4 3.6292g 定容到 1000ml 容量瓶中 一 根系活性的测定

1、实验材料、试剂与仪器设备 、实验材料、
1.实验试剂 乙酸乙酯(分析纯, 次硫酸钠(Na2S2O4, 分析纯), 粉末, 1%TTC 溶液, 磷酸缓冲液(1/15mol/L, pH7.0), 1mol/L , 硫酸。 2.仪器设备 小烧杯 3 个,研钵 1 个,移液管:0.5mL1 支、10mL1 支、5mL3 支,刻度试管 6 支,分光光度计,电子天 平,温箱,试管架,药勺,石英砂适量,滤纸。

2、实验内容操作步骤 、
2、定量测定 (1)TTC 标准曲线的制作 取 0.4%TTC 溶液 0.2ml 放入大试管中, 9.8 ml 乙酸乙酯, 加 再加少许 Na2S2O4 粉末摇 匀, 则立即产生红色的 TTF 。 此溶液浓度为每毫升含有 TTF80μg。 分别取此溶液 0.25ml、 0.50ml、 1.00ml、 1.50ml、 2.00ml 置 10ml 刻度试管中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含 TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg 的 系列标准溶液,以乙酸乙酯作参照,在 485nm 波长下测定吸光度,绘制标准曲线。 (2)称取根尖样品 0.5g,放入小烧杯中,加入 0.4%TTC 溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各 5ml,使根充分浸没在溶液 内, 37℃下暗保温 1—2h, 在 此后立即加入 1mol/L 硫酸 2ml , 以停止反应。(与此同时做一空白实验, 先加硫酸, 再加根样品,37℃下暗保温后不加硫酸,其溶液浓度、操作步骤同上)。 (3)把根取出,用滤纸吸干水分,放入研钵中,加乙酸乙酯 3—4mL,充分研磨,以提出 TTF。把红色提取液 移入刻度试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤 2—3 次,皆移入刻度试管,最后加乙酸乙酯使总量为 10ml,用分 光光度计在波长 485nm 下比色,以空白试验作参照测出吸光度,查标准曲线,即可求出 TTC 原量。 2.计算结果 C W×h×1000

根系活力[mgTTF/(g.h)] =

式中:C ——四氮唑还原量,μg; W——根重,g; h——时间,h 。 叶绿素含量测定: 二 叶绿素含量测定: 95%乙醇溶液,在 665、649、470nm 处有最大吸收峰 Ca=13.95D665-6.88D649 抗氧化酶活性的定: 三 抗氧化酶活性的定: Cb=24.96D649-7.32D665 Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245

0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 (PBS) pH=7.8) ( 溶液的配制: 65.5506g Na2HPO4· 12H2O + 2.65285g NaH2PO4· 2H2O, 定容到 4L。 (参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》 ,P134) 。 取低温保存的鲜样,称 2g 左右的叶片(或根)放在 50ml 的离心管,加入 20ml 浓度为 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 (pH=7.8) (最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活) ,研磨(用磨碎机磨) ,8000r/min 的冷 冻离心机下离心 20 分钟,上清液为粗酶液。 2.1 丙二醛(MDA)的测定 丙二醛( )的测定: 20%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:称 200g 三氯乙酸,用蒸馏水定容到 1000ml。 (参考陈建勋,王晓峰主编的 《植物生理学实验指导》,P124) ; 0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:称 5g 硫代巴比妥酸(TBA),用 20%三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定 容到 1000ml。 (参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124) (先加少量的氢氧化钠 1mol/L 溶解) ; 0.5ml 酶液(对照用 0.5ml 的 0.05mol/L pH=7.8 的磷酸缓冲液代替酶液) (做三个重复)+ 3mlTBA――振荡―― 沸水浴上反应 30min――冷却(至少 30min)――比色(OD600、OD532、OD450)(参考陈建勋,王晓峰主编 。 的《植物生理学实验指导》 ,P124) 2.2 超氧化物歧化酶(SOD)的测定 超氧化物歧化酶 )的测定: NBT(400ml)混合反应液: 392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na 溶液 (100mlPBS 缓冲溶液中含 0.01204g 核黄素) 。 (另配)100ml PBS 溶液加 EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na 测试时:取 3ml 反应液+0.05ml(根)或 0.02 ml(叶)粗酶液,于光照培养箱中 6-10 分钟,OD650 下测定吸光度。 2.3 过氧化物酶(POD)的测定: 过氧化物酶( )的测定: 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.0)溶液的配制:10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O, 定容到 1000ml。 0.3%H2O2 溶液的配制:吸 2.5ml 30%H2O2,用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml。 0.2%愈创木酚溶液的配制:称 0.5g 愈创木酚,用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml。 2ml 0.3%H2O2 溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml 酶液(原 来为 0.01)酶液(根加 0.05ml 酶液) (对照用 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液代替酶液) (做三个重复) ,记录 470nm 处 OD 降低速度。将每分钟 OD 增加 0.01 定义为 1 个活力单位。 (参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指 导》P121) 比色时加酶液,混合后即刻计时。 2.4 过氧化氢酶(CAT)的测定: 过氧化氢酶( )的测定: 0.3%H2O2 溶液的配制:吸 5ml 30%H2O2,用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 500ml。 1 ml 0.3%H2O2 溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定 240nm 处 OD 降低速度。将每分钟 OD 减少 0.01 定义为 1 个活力单位。 (参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121)


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