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检测转基因水稻中PPT抗性表达的快速简便方法


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植物生理学通讯   36 卷 第 1 期 , 2000 年 2 月 第

讨    论
   尽管从有机体中提取 DNA 是分子遗传 学研究中的简便工作 , 但是 , 有些情况下 , 对 于不同植物 ,同种植物不同组织 ,或不同贮藏 状态的材料 ,提取 DNA 时常会出现难以预知 的问题 。正是由于各种因素的影响 , 所以

不 能机械地将一种 DNA 的提取方法应用于其

他例外情况 。本文就是其中一例 。CATB 法 优于微量法 , 可从贮藏较久的番茄叶中提取 到适于 PCR 扩增的 DNA 样品 ,其原因尚待研 究。 参考文献
1  Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acid Res , 1980 ,8∶ ~4325 4321

检测转基因水稻中 PPT 抗性表达的快速简便方法1
陈  游  程世军  王  江  沈革志  安林升  张景六
200032) ( 中国科学院上海植物生理研究所 , 上海

A Rapid and Simple Method for Assaying PPT Resistance in Transgenic Rice Plants
CHEN Y , CHENG Shi2Jun , WANGJiang , SHEN Ge2Zhi , AN Lin2Sheng , Zhang Jing2Liu ( Shanghai Institute of Plant ou
Physiology , The Chinese Academy of Sciences , Shanghai 200032)

   提要   该方法只需用毛笔在水稻叶片上涂抹 1
2 - 1

cm 大小的 20 mg? L

PPT 溶液 , 正常光照下 2 d 后

就能观察到 PPT 抗性表达与否的清晰结果 , 具有快 速、 简便 、 经济的优点 。实验中还发现 PPT 对敏感水 稻叶片的药害反应随着光照强度的增大而加速 。    关键词  PPT  bar 基因   检测   转基因水稻

害反应 [2 ,7 ] ; 将叶尖剪下插入含有 PPT 的选 择培养基上培养以观察药害反应[3 ] 等 。但这 些方法都还不够简便 , 检测周期一般在 3 至 7 d 之间 ,而且 PPT 用量也比较大 。本文介绍 一种快速简便的可用于检测转基因水稻中 PPT 抗性的方法 。

  PPT ( phosphinothricin) 是商用广谱除草剂

材料与方法

Basta 和 Herbiace 中的主要活性成分 。 bar 基

因编码 PPT 乙酰转移酶 ( PAT) [1 ] ,通过将 PPT 上的游离氨基乙酰化而使之失活 。 bar 基因 已在多种植物中 ( 包括玉米 、 、 、 小麦 大麦 水稻 和豌豆等 ) 用作转化时的选择标记[2 ,3 ] 。目 前在转基因植物中 bar 基因表达的检测方法

   材料为对 PPT 敏感的粳稻 ( Oryza sativa )

主要有 : 在含有 PPT 的选择培养基上观察种 子的萌发能力 [4 ] ; 用商用 PPT 溶液进行全株 喷洒 ,观察植株的生存能力[5 ,6 ] ; 将一张叶片

品种 “中花 11” 及其带有 bar 基因的转基因植 株 ( 其表型显示为 PPT 抗性) 。种植于人工气 候室 ( 光 强 200 μ ? - 2 ? - 1 , 相 对 湿 度 mol m s ) 人工气 70 % ,光/ 暗为 12 h/ 12 h ,温度 25 ℃ 、 ( NK System Biotron , Japan ; 光 强 30 候箱
收稿   203212      1999 修定   209202 1999 和中国科学院基金资助项目 。

    1 国家 863 计划 、 国家自然科学基金 ( 批准号 39789020)

的全部或部分浸入 PPT 溶液 , 观察叶片的药

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) μ ? - 2 ? - 1 , 光/ 暗 12 h/ 12 h , 温度 37 ℃ s mol m 或 大 田 中 。药 品 PPT ( DL2phosphinothricin , ammonium salt , Sigma ) 配 制 成 水 溶 液 ( 含 0. 2 %Triton X2100 ) 。用毛笔把不 同 浓 度 的 PPT 溶液涂抹于水稻叶片 ( 每株取 1 叶 ) 中

的 PPT 依次涂抹于健康无病斑的水稻叶片
( 苗期或分蘖期 ) 中段 , 面积约 1 cm2 , 间隔 1 cm 宽 。定期观察 ,至涂抹后第 3 d 取下拍照 ( 图 1) 。从图 1 可见 ,对照植株在 10 mg? - 1 L PPT 的作用下出现了较明显的黄色枯斑 , 随

段 ,面积约 1 cm2 。自涂抹后 2 h 起 , 每隔一 段时间观察涂抹处的叶色变化 。一般将涂抹 后第 3 d 时涂抹处出现黄褐色枯斑的植株判 定为对 PPT 敏感植株 ; 而涂抹处仍保持原有 绿色的判定为 PPT 抗性植株 。

着 PPT 浓度的提高 , 枯斑面积增大 , 颜色加 深 ;到 1 000 mg? - 1 时 , 整个叶段完全枯黄 。 L 而转基 因 植 株 叶 片 在 PPT 浓 度 高 达 1 000
mg? - 1 时仍保持绿色 。在实验中未观察到 L

苗期与分蘖期的 “中花 11 ” 叶片对 PPT 涂抹 的反应有显著不同 。从经济 、 实用角度考虑 , 我们选择 20 mg? - 1 PPT 溶液为常规检测浓 L 度。

结果与讨论

1  PPT 最适浓度的筛选    将不同浓度 ( 0 、 、 、 、 000 mg? - 1 ) 10 20 40 1 L

图1  水稻叶片对不同浓度 PPT 溶液的药害反应

2  敏感水稻植株对 PPT 涂抹的药害反应时

迟缓 ,在涂抹相同浓度 PPT 1 周后叶片没有 明显的变化 ; 而把这些植株移入人工气候室
3 d 后 ,涂抹处出现了明显的枯斑 。在盛夏大

间及其影响因素

   对在人工气候室中以 20 mg? L

- 1

PPT 涂

抹的 “中花 11 ” 植株叶片定期观察的结果表 明 ,2 h 后涂抹处叶色无变化 ; 次日涂抹处出 现浅黄色枯斑 ,而转基因植株叶片仍为绿色 , 二者的区别很清楚 ; 到涂抹后第 3 d 时 ,枯斑

田 ( 光照强度 2 000 μ ? - 2 ? - 1 ) 所作的相 mol m s 同实验反应最为迅速 , 涂抹后仅 2 h 即出现 清晰的枯斑 ,1 d 后所有敏感植株叶片上的枯 斑均达到最显著的状态 。 一般认为 , PPT 强烈抑制谷氨酰胺合成 酶活性 ,以致细胞内游离氨迅速积累 ,从而导 致细胞死亡 [2 ] 。我们的实验结果初步表明 , 当光照强度增大时 , PPT 对水稻叶片的药害

的面积进一步扩大 , 颜色也变成更醒目的枯 黄色 ; 此后随着时间的延长枯斑的颜色深浅 及范围大小变化不大 。同时放在人工气候箱 中的敏感植株叶片对 PPT 涂抹的反应却比较

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植物生理学通讯   36 卷 第 1 期 , 2000 年 2 月 第
1986 ,205∶ ~50 42 2  Rathore KS , Chowdhury VK, Hodges TK. Use of bar as a se2 3  Wang MB , Waterhouse PM. A rapid and simple method of as2 saying plants transformed with hygromycin or PPT resistance genes. Plant Mol Biol Rep , 1997 ,15∶ ~215 209 4  Hiei Y, Ohta S , K omari T et al . Efficient transformation of 7  Huang DN , Zhu B , Yang W et al . Introduction of cecropin B quence analysis of the boundaries of the T2DNA. Plant J , 1994 ,6∶ ~282 271 619~629 plants. Plant Physiol , 1992 ,100∶ ~1507 1503 1996 ,39∶ ~661 652 dica rice plants from IRRI breeding line IR72 after PEG medi2 2 biquitin gene promoter2 bar chimeric gene in transgenic rice gene into rice ( Oryza sativa L. ) by particle bombardment and analysis of transgenic plants. Science in China ( Series C) , 5  Datta SK, Datta K, Soltanifar N et al . Herbicide2resistant In2 6   oki S , Takamastu S , Nojiri C et al . Expression of a maize u2 T lectable marker gene and for the production of herbicide2resis2 871~884

反应加速 。 综上 所 述 , 与 以 前 的 各 种 方 法 相 比 , PPT 叶片涂抹法有以下较突出的优点 : ( 1 ) 快速 。 在大田日光下完成 1 次检测只需 1 d , 人工气候室中最多只需 3 d , 而且根据枯斑 的出现与否很容易区分抗性植株与敏感植 株 , 结果与分子检测的结果 ( 数据略 ) 相吻 合 。( 2) 简便 。 此方法操作很方便 , 可直接在 活体植株上进行 , 叶片不需消毒 , 不需要特 殊昂贵的仪器和用具 , 效率很高 , 可在较短 时间内检测大量个体 , 特别适用于筛选转基 因植物的分离群体 。( 3 ) 经济 。PPT 用量很 小 , 每株只需选取 1 张叶片 , 在 1 cm2 范围 内涂抹 20 mg? - 1 PPT 即可 , 而且对整个植 L 株的生长无伤害 。 参考文献
1  Murakami T , Anzai H , Imai S et al . The bialaphos biosyn2 thetic genes of Streptomyces hygroscopicus : Molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mol Gen Genet ,

tant rice plants from protoplast . Plant Mol Biol , 1993 , 21 ∶

ated transformation of protoplasts. Plant Mol Biol , 1992 ,20 ∶

江苏省植物生理学会成立廿周年暨 第六次会员代表大会简讯

   江苏省植物生理学会成立廿周年暨第六次会员代表大会于 1999 年 10 月 29~30 日在南京召开 。出席代

表 87 人 ,另有在读研究生 20 余人列席 。92 岁高龄的仲崇信教授及刘芷宇 、 曹日强 、 汪安琳 、 徐钟吾 、 聂毓琦等 文摘要 30 篇 ( 已编入会议论文摘要汇编) 。

老理事 、 老会员参加了会议 。会议收到论文 28 篇 ( 已刊入南京师大学报 1999 年 22 卷 3 期) ,专题报告 5 篇 ,论 中国植物生理学会秘书处向大会发来了贺电 。江苏省农科院院长 、 江苏省科协副主席王荣和学会挂靠单

位江苏省农科院遗传生理所所长余文贵出席了开幕式并向大会祝贺 。第五届理事长刘友良向大会作了 《江苏 省植物生理学会二十年》 的专题报告 ,秘书长汤日圣代表第五届理事会作工作报告 。大会还邀请美国华盛顿 州立大学植物学系古森本教授作了 《从生理看作物生产 ,新方法与新技术》 的学术报告 。综述报告有 《植物激
( ( 素研究评析》夏凯) 《生物信息与计算机分子生物学》杨永华) 《厌氧和有氧条件下水稻胚芽鞘的钾吸收与 、 、 ( 渗漏》黄少白) 。

会议分二组进行学术交流 ,共交流论文 33 篇 ; 评选出优秀学术论文报告奖 11 篇 。最后 ,会议选出第六届

理事会理事 19 名 。刘友良任理事长 ,丁家宜 、 王忠 、 刘蔼民任副理事长 ,汤日圣任秘书长 ,侯喜林 、 杨永华任副 秘书长 。理事会设立学术 、 科普与教育 、 青年 、 江苏植生通讯四个工作委员会和组织培养 、 植物生长物质 ( 筹 ) 两个专业委员会 。( 汤日圣   杨芳彬)

rice ( Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacterium and se2


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