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SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定1


植物组织中 SOD、POD、CAT、MDA 和可溶性蛋白的测定 、 、 、
磷酸缓冲液的配制: 一、 磷酸缓冲液的配制: A 液:0.2M 的 KH2PO4 溶液 称取分析纯 KH2PO427.216 克,用蒸馏水定容至 1000 毫升。 B 液:0.2M 的 K2HPO4 溶液 称取分析纯 K2HPO4?3H2O45.644 克,用蒸馏水定容至 1000 毫升。 或

(A 液:0.2M 的 NaH2PO4 溶液 称取分析纯 NaH2PO4?2H2O 31.21 克,用蒸馏水定容至 1000 毫升。B 液:0.2M 的 Na2HPO4 溶液 称取分析纯 Na2HPO4?12H2O 71.64 克,用蒸馏水定容至 1000 毫升。 ) 酶液的制备: 二、酶液的制备:称取 0.5g 放入研钵中,加 5 毫升 PH=7.8 的磷酸缓冲液,冰浴研磨,匀 浆倒入离心管中,冷冻离心 20 分钟(若做可溶性蛋白,转速为 4000 转/分钟,若不做,则 10000 转/分钟) ,上清液(酶液)倒入试管中,置于 0~40C 下保存待用。 的测定: 三、 SOD 的测定: 1.SOD 反应液的配制: 反应液的配制: 母液的配制: (1)0. 05M 磷酸缓冲液(PH=7.8) 液 21.25ml+B 液 228.25ml 定容至 1000ml; :A (2) 130mM Met(甲硫氨酸):取 1.9399 克 Met 用磷酸缓冲液定容至 100ml; (3)750μM 四氮唑蓝(NBT) :取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml; (4) 100μM EDTA-Na2: 取 0.0372g EDTA-Na2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml, 避光保存; (5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD 用磷酸缓冲液定容至 1000ml。 SOD 反应液:磷酸缓冲液:Met:NBT:EDTA-Na2:核黄素(FD) 2O 的比例为 15: :H 3:3:3:3:2.5,按母液顺序配制。 2.SOD 的测定 的测定:取型号相同的试管,吸取 20 微升的酶液,加入 3 毫升,4000Lux 照光 30 分钟,同时取四支试管,三支做对照,一支做空白(不加酶液,以缓冲液代替) ;空白 置暗处,对照(CK)与酶液同置于 4000Lux 条件下照光 30 分钟,遮光保存,以空白调 零,560nm 比色。 3.结果计算 结果计算 SOD 总活性(吸光度/g·FW)=(ACK—AE)×V/(W×0.5×ACK) 单位:NBT 光还原 50%为单位 SOD 比活性(酶单位/mg 蛋白)= SOD 总活性/蛋白质浓度 的测定: 四、POD 的测定: 1. 0.1M PH6.0 磷酸缓冲液的配制:A 液 219.25+B 液 30.75,定容至 500 毫升; 磷酸缓冲液的配制 的配制: 2. POD 反应液的配制 反应液的配制:0.1M PH 6.0 的磷酸缓冲液 50 毫升于烧杯中,加入愈创木酚 28 微 升,磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解,冷却后加入 30%H2O219 微升混合,保存于冰 箱中。 3. POD 的测定 20 微升酶液+3 毫升反应液于比色皿中, 470nm 下每隔 1 分钟读数一次, 的测定: 在 共读三次,以每分钟吸光度变化值(ΔA470/min·mg pr 或ΔA470/ mgFW)表示酶活力 的大小。 4. 结果计算 结果计算:POD 活性(ΔA470/min·gFW)=ΔA470×V/Va/W=ΔA470×5/0.02/0.5 =ΔA470×500 的测定: 五、CAT 的测定: 1. CAT 反应液的配制: 反应液的配制: 0.1MH2O2 溶液:0.568 毫升 30% H2O2 定容至 100 毫升。 0.1MPH7.0 磷酸缓冲液:97.5 毫升 A 液+152.5 毫升 B 液,定容至 500 毫升。

0.1M 的 H2O25 毫升+0.1M 的 PH7.0 的磷酸缓冲液 20 毫升(即按 1:4 的比例)混匀, 即为 CAT 反应液。 2.CAT 的测定 的测定:0.1 毫升(或 50 微升)酶液+2.5 毫升反应液,240 纳米下比色,每隔 1 分钟 读数 1 次,共读数 3 次。 3.结果计算 结果计算: 3.结果计算:CAT 活性(Δ240/min·gFW)=Δ240×/0.05/0.5=Δ240×200=Δ240×V/Va/W 的测定: 六、MDA 的测定: 1.MDA 反应液的配置 0.6 克 TBA 反应液的配置: (硫代巴比妥酸) 先用少量 1MNaOH 溶解, 10%TCA , 用 (三氯乙酸)定容至 100 毫升。 2. MDA 的测定:1 毫升酶液+2 毫升 0.6%的 TBA,封口沸水浴 15 分钟,迅速冷却后再离 的测定: 心,取上清液,在 600、532、450nm 三个波长下比色。 3. 结 果 计 算 : MDA ( μ mol/gfw ) =(6.45 × (D532-D600)-0.56D450) × 0.015/W 或 (6.45 × (D532-D600)-0.56D450) ×0.03/W 七、可溶性蛋白的测定 反应液配制: 反应液配制:0.1 克 G-250 溶于 50 毫升 90%乙醇中,加入 100 毫升 85%磷酸,定容至 1000 毫升,过滤。 测定:20 微升酶液+3 毫升 G-250 放置 2 分钟,595 纳米比色,同时做空白(20 微升缓 测定 冲液+3 毫升 G-250) 。 结果计算: 结果计算:可溶性蛋白(mg/Gfw)=(C×V/Va)/W 八、脯氨酸含量的测定 试剂配制: 试剂配制: 0.6 克磺基水杨酸,定容至 200 毫升: 酸性茚三酮(现配) :3.75 克茚三酮+90 毫升冰醋酸+36 毫升蒸馏水 测定: 测定:0.3 克叶片,加入 5 毫升磺基水杨酸,加盖,沸水浴 10 分钟,过滤,吸取滤液 2 毫升(同时作空白,吸取 2 毫升蒸馏水) 毫升冰醋酸和 3 毫升酸性茚三酮,沸水浴 40 分 、2 钟,冷却,加入 5 毫升甲苯,充分振荡,静止分层,取上层甲苯溶液于比色皿中,520 纳米 下比色。 结果计算: 结果计算:脯氨酸含量(μg/g 鲜重)=C×V/Va/W


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