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考马斯亮蓝法测定蛋白质含量


实验三 量

考马斯亮蓝法测定蛋白质含

一.目的: 目的: 掌握考马斯亮蓝G 250染色法测定蛋白质的 掌握考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的 原理和操作; 原理和操作;了解分光光度法测定蛋白质的几种 方法;进一步熟悉分光光度计的使用。 方法;进一步熟悉分光光度计的使用。

二、原理 分光光度法测定蛋白质的几种方


1、双缩脲法:在碱性条件下,蛋白质能与铜离子结合形成紫红色 、双缩脲法:在碱性条件下, 络合物, 络合物,540nm,1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸 , 。 组成无关,快速,不受硫酸铵干扰。灵敏度低,需要样品量大; 组成无关,快速,不受硫酸铵干扰。灵敏度低,需要样品量大; 2、Folin-酚试剂法(Lowry法):在碱性条件下,蛋白质首先与 酚试剂法( 在碱性条件下, 、 酚试剂法 法):在碱性条件下 铜离子形成紫红色络合物,该络合物以及Tyr,Trp残基还原 铜离子形成紫红色络合物,该络合物以及 , 残基还原 Folin试剂,产生深蓝色。750nm,0.03-3g/L或500nm, 试剂, 试剂 产生深蓝色。 , 或 , 0.05-0.5g/L。灵敏度高,需要样品量少;但干扰因素多,操作 。灵敏度高,需要样品量少;但干扰因素多, 试剂配制麻烦,不同蛋白质之间差异大。 试剂配制麻烦,不同蛋白质之间差异大。 3、考马斯亮蓝染色法:在酸性环境下,棕红色的考马斯亮蓝与蛋 、考马斯亮蓝染色法:在酸性环境下, 白质通过疏水力相结合,蓝色化合物, 白质通过疏水力相结合,蓝色化合物,595nm,颜色深浅与蛋 , 白质含量成正比。 白质含量成正比。 0.01-1g/L,灵敏度高,需要样品量少,不 ,灵敏度高,需要样品量少, 同蛋白质之间差异大。 同蛋白质之间差异大。 4、紫外分光光度法:280nm,不同蛋白质之间差异大 、紫外分光光度法: ,

三、仪器
721分光光度计(使用前预热20min); 分光光度计(使用前预热 分光光度计 ); 移液管: 移液管:

四、实验试剂
标准蛋白质溶液: 标准蛋白质溶液:用牛血清白蛋白配成含蛋白质 0.1mg/mL的标准蛋白溶液; 的标准蛋白溶液; 染色液(考马斯亮蓝 - 溶液): 染色液(考马斯亮蓝G-250溶液):称取 溶液):称取 0.1mg考马斯亮蓝 -250,溶于 考马斯亮蓝G- 考马斯亮蓝 ,溶于50 mL 90% % 乙醇中,加入85%的磷酸100 mL ,蒸馏水定容 乙醇中,加入 %的磷酸 贮放在棕色瓶中, 到1000 mL ,贮放在棕色瓶中,此溶液在常温 下可放置1个月 个月。 下可放置 个月。 待测蛋白质溶液

五. 实验操作
1、标准曲线 蛋白质含量为 ~0.1mg/mL)的绘制 、标准曲线(蛋白质含量为 蛋白质含量为0~ 的绘制: 的绘制
利用1, , , , , 号试管数据绘制 号试管数据绘制。 号试管调零 号试管调零。 利用 ,2,3,4,5,6号试管数据绘制。1号试管调零。 2 、样品提取液中蛋白质浓度的测定 7,8好试管数据取平均值。 好试管数据取平均值。 , 好试管数据取平均值

调0
试管号 蛋白质标准溶液( ) 蛋白质标准溶液(ml) 蒸馏水( ) 蒸馏水(ml) 待测蛋白质溶液( ) 待测蛋白质溶液(ml) 蛋白质含量(? 蛋白质含量 ?g) 考马斯亮蓝溶液(ml) 考马斯亮蓝溶液( ) 1 0 1.0 0 0 5 2 0.2 0.8 0 20 5 3 0.4 0.6 0 40 5 4 0.6 0.4 0 60 5 5 0.8 0.2 0 80 5 6 1.0 0 0 100 5 7 0 0 1.0 未知 5 8 0 0 1.0 未知 5

混合,放置 光径比色杯在595nm下比色,测得 595nm 。 下比色, 混合,放置5min后,用1cm光径比色杯在 后 光径比色杯在 下比色 测得A 以蛋白质浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 以蛋白质浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

注意事项:
如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收,因为这段时间内颜色最稳定。 测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比 色杯壁上,但此复合物的吸附量可以忽略。测定 完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

思考题

比较该法与其他几种常用蛋白质的定量测定方 法。


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