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21947019567.3-2004苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂


I CS 5.1 6 00.1 0 G 2 5


G / 15 73 2 0 B T 9 6 .- 0 4

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

苏 云金芽胞 杆菌 可湿 性粉剂
B c ls  r g i s w t b p w r aiu tui ge i e a l o e l h n n s  t e 

2 0-6 2 布 040- 发 2

2 0 -20 0 4 1- 1实 施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中 国 国家 标 准 化 管 理 委 员 会

发 布

GB T  5 73 2 0 / 1 6 .- 04 9





苏云金芽      胞杆菌(aiut r ge i Bt 是目 B cl h i i s ,. ) 前应用最广泛的 l s  n n s u 一种微生物杀虫剂, 它的主要
杀虫成分是伴胞 晶体 中的毒素蛋白 , 中, 其 本标准所检测的对鳞翅 目害虫有毒力的毒素蛋白的相对分子 量为 10  a 3 k 。生物测定 中甜菜夜蛾用于检测对鳞翅 目贪夜蛾属害虫有特性 的苏云金芽胞杆菌 可湿 性 D 粉剂 的毒力 , 小莱峨和棉铃虫用于检测对其他鳞翅 目害虫有活性的苏云金芽胞杆菌 可湿性粉剂的毒力 。 本标准是根据我 国以往制定 的苏云金芽胞杆 菌行业和企业标 准等有关材料 ,      结合我 国的实 际情 况
制定 的。

本标准对苏云金芽胞杆菌 可湿性粉剂 的要求 、      试验方法 、 抽样 以及 包装 、 输等作 了具体要求和 规 运 定, 从而为苏云金芽胞杆菌生产提供了统一的技术依据 。 本标 准的附      录 A是资料性附录 , 附录 B是规 范性附录。 本标准 由中华人 民共和 国农业部提 出。      本标准起草单位 : 部农药检定所 、 中农业 大学微 生物农药 国家工程研究 中心 、      农业 华 湖北省生物农 药工程研究 中心。 本标准主要起草人 : 辉、      姜 喻子牛 、 陈守文、 王开梅 、 王晓军、 吴新平 、 顾宝根。 本标准 由农业部农药检定所负责解释 。     

GB/ 1 5 73 2 0 T  6 .- 0 4 9

苏 云金芽胞 杆菌可湿性 粉剂
范围

本标准规定了苏云金芽胞 杆菌可湿性粉剂 的要求、      试验方法以及标志 、 标签、 包装 、 贮运。 本标准适用于由防治鳞翅 目害虫的苏云 金芽胞杆 菌原粉 和助剂等 制成的苏 云金芽胞 杆菌可湿 性     
粉剂。 2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标 准的引用 而成 为本标准的条款 。凡是 注 日期 的引用文件 ,      其随后所 有 的修改单( 不包括勘误的 内容) 或修订 版均不适用 于本标准 , 然而 , 鼓励根据 本标准达成协议的各方研 究 是否可使用这些文件的最新版本 。凡是不注 日 的引用文件 , 期 其最新版本适用于本标准 。

G / 15      极限数值的表示方法和判定方法 BT  。 2
G / 1 0 01     0-20 农药水分测定方法 B T  6 G/ 1 1     0 农药 p B T  6 H值的测定方法

G / 10      商品农药验收规则 BT  4 6 G / 10 01      -20 商品 BT  5 6 农药采样方法
GB 9      农药包装通则 3 6 7

G / 55     1 01 农药可 BT  -20 4 湿性粉剂湿润 性测定方法
GB/ 1 10 9 5     6 5 - 1 9 农 药 粉 剂 、 湿 性粉 剂 细 度 测 宁方 法 T  可

3 31 32

要求

外观: 白色或棕褐色疏松粉末 , 可有团块。 灰 不 苏云金 芽胞 杆菌可湿性 粉剂应符合 表 1 要求。 表 1 苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂控制项 目指标                     
项 目 指 标
2 0 .  1 0 0 6 0

毒 素蛋 白(3 k a/ 写) 10  ) ( D 毒力效价 ( 二 , a ,../I / ) P..H. Se)(U mg . p H值 水分/ %) ( 悬浮率 ( 有效成分) ( / %) 湿润时间/ n mi 细度(5  /%) 7p ( m)

) )

4 0 .

3 0 0 2 0

6 0 7 5 .  - . 

( 妻

4. 0

7 0





9 8

注 : . .H.  Se分别为小菜蛾 ( uea l tl)棉铃虫 ( l tiamgr ) P 二 , a和 .  . . Pltl s o ea  l ysl 、 Heihs  iea 和甜菜夜蛾( pdp o r S o ot e 。咭u )     a  a r 二 缩写.

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4 试验方法

除非另有说      明, 本方法所用试剂均 为分析纯 , 所述溶液均为水溶液 。
4 1 抽样

按照 G / 6 -20 中 固      1 5 01 “ 体制剂采样” BT  0 进行, 用随机数表法确定抽样的包装件, 最终抽样量不
少于 10  0 g , 42 毒康蛋白含f . 用十二烷基硫 酸钠一      聚丙烯酞胺(D -A E  图像处理 法进行测定 。 S SP G ) 凝胶 42 1 方法提要 .. 用碱性溶液处 理苏 云 金芽 胞杆 菌 可湿 性 粉剂 伴胞 晶体 ,      使其 降解 为 毒 素蛋 白, 然后 通 过 S S D- P E, 白质相对分子质量 的差异 , AG 依蛋 使毒素蛋 白与其他杂蛋 白分 离, 之后 用电泳图像扫描 蛋白区带
面积 , 行定量。 进

422 仪器、 .. 设备 a 电泳仪      ; ) b 垂直式      电泳槽 (.  ) 15  mm凹形带槽橡胶模框)凝胶板面积 10  X10  15  2 , 7 m m  7 m m(. mm,0孔样 品槽模具 )          ; C 电泳     凝胶成像系统 ; )

d 离心机: 0 r n      1 00  i ) 0  / ; m e 分析天平:      ) 精确至。00 o . 1  0 g 
423 试 剂和溶液 ..
4 2 3 1 过 硫 酸钱 ( S , ... AP )

4232 十二烷基硫 酸钠(D ) ... S S, 4233 四甲基 乙二胺( E D , ... T ME ) 4234 氢氧化钠 。 ... 4235  0 ...  3 %丙烯 酞胺凝 胶母 液: 称取丙烯 酞胺 3 g 亚 甲基双丙烯 酞胺 ( 称 : 0  . 原 甲叉 双丙烯 酞胺 )

。8  g溶于 10  蒸馏水中, , 0m L 过滤, ℃暗处贮存备用。 于4
4236 分 离胶缓 冲液 : ... 称取三 经基 甲基氨基 甲烷 ( r )81 g和 S S 4  T i 1.  s 7  D 0 g溶于蒸馏 水中 , 浓盐 .  用 酸调至 p 88用蒸馏 水定容至 10  , H .  , 0 mL 4237 浓缩胶缓 冲液 : ... 称取 T i60 g S S 4  r .  和 D 0 g溶于蒸馏水 中, s  6  .  用浓盐 酸调至 p .  蒸馏 H68用 ,

水定容至 10 。 0m l
4238 电极缓 冲液 : ... 称取 T i306 甘氨酸 1.2 S S  , r .  g s  3 , 44 g D 1 用水溶解并定容至 1 0  , , g 0 m 0 L 4239  X样 品稀 释 液 : mo/ , H68 i HC 1.  m S S g 甘油 3 m 琉 基 乙醇 ...    3 1  l p . T s 1  7 L,D 6  L  r- 8 5  , 0  L, 1 mL 少许澳酚蓝 , 5  , 用蒸馏 水定容至 10  , 0 mL 42 31 固定液 : ...  0 量取 9 %乙醇 50  , 5 0 mL 冰乙酸 10  , 6 mL 用蒸馏水定容至 1 0  . 0 m 0 L 42 31 染色液 : 考马斯亮 蓝( B ) -5 g加人 9%乙醇 20  , 乙酸 8 mL 蒸馏水 定 ... 1 称取 C B R201  , 5 5 ml 冰 0  , 容至 1 。 。。mL 溶解过滤后使用 。 , 42 31 脱色液 : ...2 量取 9 %乙醇 20  , 5 5 mL 冰乙酸 8 mL用蒸馏水 定容至 1  mL 0  , 00  . 0 42 31 毒素蛋 白标样 : ...3 毒素蛋白( 相对分子量为 10 a含量 为 80 3 k ) D .%的原粉。
4 2 4 样 品处 理 ..

称取标样 试样各 2.  g准 确到 。 1  ), 至 15      、 00  ( m .  g 移 m .  mL离心 管中 , 1  加 m l水充 分悬浮 。取

1 K 加入另一 15  0 L 0  .m L离心管, 。5 l 加人 m/ o I氢氧化钠溶液 2 I ( 5  使氢氧化钠溶液的终浓度为 A -
0 1 lL 放置约 5 n 再加人 3 .  / ), mo m , i X样 品稀 释液 7 p , 5  使最终体 积为 20川 , 10 L 0 于 0℃沸水 中煮 沸 6 n离心( 0 0  i)  mi后取 上层 清液, mi, 2  rmn 1 n 0 / 0  以备电泳上样 。

G T  5 73 2 0 B/ 1 6 .- 0 4 9 4 2 5 S - A . .  DSP GE 分 离 铸 萦 蛋 白

425 1 制备 75 ... .%策丙烯酸胺凝胶 采用不连续缓 冲系统 ,      制胶方法 见附录 A( 资料性附录) 。 4252 上样 ...

取上述标样溶解液上层清液, 丙烯酞      于聚 胺凝胶的 上样孔中 分别上样 681, , K ( ,, 1 1 L 毒素蛋白 0 2 4 
含量 约为 3 -7 )作为标准曲线 ; p g ! , t g 再取一定体积 的试样溶液上层清液 ( 毒素蛋白含量约为 5 )加 f , a g 人到上样孔 中, 注人电极 缓冲液后, 接通电源 。 4253 电泳 ... 电泳初期     电压控制在 10  0 V左右 , 待试样进人分离胶后 , 加大电压到 10 继续 电泳 , 7 V, 当指示剂前

沿到达距底端 l c m左右时停止电泳, 胶板, .%( 取出 在75 体积分数) 乙酸中浸泡 3 mn 0  e i
4254 染色 ...

将分离胶部分取下 , 考马斯亮 蓝( B )  5 染色液染 色过夜 。      用 C B R20 -
4255 脱色 ...

倒去染色液 先用漂洗液洗涤凝胶 ,      , 然后加人脱色液 ,7 3℃保 温脱色 , 更换几次脱 色液 , 至背景清晰
为止 。 426 测定 ..

胶板 经脱      色后 , 可清晰地看到分子量为 10  a 3 k 蛋白区带 , D 用凝胶成像 系统对凝胶 进行分析。 样品中毒素蛋 白的百分含量 ( )      X 按式() ( 进行计算 。 1
M         
人 令 -
f . V           

芬 入 月 入 1 ; VV% 0

(1 )

式中 :     

M— 由标准蛋 白回归曲线计算得到的蛋白量;      c 样品的浓度 ;        — V      — 样品的加样体积 ; n        — 样品的稀释倍数。 427 允许差 .. 取其算术平均值 为测定结果 。两次平行测定结果相对偏差小于等于 5      %, 43 毒力效价的测定 . 按 附录 B 规范性附录)     ( 进行 . 44 H值 的测定 . p   按 G / 61      10 测定 。 B T  45 细度的测定 . 按 G / 65-19      110 95中 22 行测定 。 B T  ,进 46 水分的测定 . 按 G / 60 01中“ 沸蒸馏法”      10-20 B T  共 进行测定 。 47 悬浮率测定 47 1 仪器 、 .. 试荆 a 量筒 20  ,      :5 mL 具塞 ; ) b 吸液管      ; )
c 秒表      ; )

d 三角瓶 50  ,0 ml      :0 mL 10  ; ) e 恒温水浴锅 ;      ) f 标准硬水 :      ) 配制方法 按 G / 55 B T  1中标准硬水 配制方法进 行。 4

GB T  5 73 2 0 / 1 6 .- 0 4 9 472 操作步骤 .  . 

称取可湿性粉 剂样 品 20 0  精 确 到 。 2  )于 盛 有玻 璃 珠 的三 角 瓶 中, 人标 准 硬水      0.  mg .  g , m 加 10  用手左右振 荡 6 0 M I, 0次。制 得 的悬 浮液 全部 转移 到 20 L具塞 量筒 中 , 标准 硬 水稀 释到 5 m 用
2 0  5 mL.

将量筒放      人 3℃士1 0 ℃恒温水浴锅 中, 当悬浮液温度达到 3℃ 时, 0 将量筒 盖好 , 拿起量筒先 轻轻摇 起沉淀物 , 然后有规律地 以量筒 中部为 中心上下颠倒 3 s使呈均匀的悬浮液 , 仍放人恒 温水浴 中, 0  , 量筒 打开盖子 , 静置 3 mi, 0 n 用吸液管以抽气法将量筒上部 91 /0的悬 浮液抽 出( 1 s 0  在 5  -3 s 内完成) 。抽 液过程 中, 吸液管应 依附筒壁随液面下降而下降 , 勿搅动下 部沉淀 。按 附录 B( 规范性 附录) 的方法 , 对 可湿性粉剂及量筒 内剩下 的 2 mL悬浮液进行毒力效价 的测定 。 5  473 计算 .. 可湿性粉剂的悬浮率( )      Y 按式() ( 进行计算 : 2 _ 111  C一 Q 、,。/ 1.  ( X  ) i八 。 — 入 vv7o

七                         

? ? 。??????????。 ?.?,。?????????。二( 2 )

式 中:     

C      — 供试可湿性粉剂的毒力效价 ; Q      留在量筒底部的 2 mL悬浮液的毒力效价 。 5 
474 允许差 ..

两次重复测定结果之差应不超过 1/ e      0  0 a  48 湿润 时间的测定 . 按 G / 60 0 1 共沸蒸馏法’      10-20 中“ B T  , 进行测定
5 检验规则

符合 G / 1 4      T 0 有关规定 。极 限值按 G / 15 处理 。 B 6 B T  0 2 6 标志、 标签 、 包装、 贮运 61 产 品包装应符合 G 39 规定 , .  B  6 7 同时注明所 用标准编号及检测所 用试虫 。 62 可湿性粉剂 主要采用 塑料袋包装 , . 密封 。 63 贮存时严防 日晒 , . 勿受压 , 置于阴凉 干燥处 64 运输时 , . 注意轻 放 , 防止损坏 。 65 保证期 : . 在正常贮 运条件下 , 可湿性粉剂质量保证期从生 产 日 期算起 为两年, 产品出厂时毒力效价 和毒素蛋 白含 量不低于 32指标 。两年内产品毒力效价和毒素蛋白的含量不低于 3 2 .  .  指标的 7 0

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附    录



( 料    性 附 录 ) 资 电泳凝胶的制备

A 1 制板 .

本 实验选用双垂 直电泳槽 ,      具体操作根据实验室条件而定 .基本操作是根据电泳槽高矮大小 , 选择 两块大小一 样的玻璃 板, 中一块端部带有 2  其 c m-3  高的凹槽。两块玻璃板洗净干燥后 , c m 在无 凹槽 的玻 璃板两边各放一条“ 间隙条”塑料条 、 ( 胶条都可 以, 其宽度 、 厚度根据需要而定 )然后放上带 凹槽 的 , 玻璃 板, 用夹子将两块玻璃板 固定 , 两块玻璃板之 间就形成 了一定 的间隙。形 成的间隙下端应该封 这样 闭, 以防灌人的胶液漏出 。一般用胶纸条 封闭 , 灌人的胶凝 固后 , 撕去胶纸 ; 待 再 或用 1 %-15 . %浓度 的琼脂封闭 , 方法是 : 在琼脂中加入电极缓冲液或蒸馏 水, 在沸水浴 中加热溶解 , 带有间隙的玻璃 板装 将 置垂 直放在一个高 3  宽 3  比玻璃板宽而长的一个小槽 内( c m、 c m、 商品电泳槽有 配套装置 )趁热将 溶解 , 的琼 脂胶灌人小槽 内, 待冷却后取 出, 玻璃板装置下端 即封严 , 可进行灌注聚丙烯酞胺胶液 A 2 制备分离胶 .  从冰箱 中取出制胶试剂 , 至室温 。按 表 A 1      平衡 . 配方配制分离胶 。本试验中分离胶浓度为 75  .  % o 按表 A 1      配方将胶液配好、 . 混匀后 , 迅速注人两块玻 璃的间隙 中, 至胶 液面离玻璃 板凹槽 3  左 c m 右 。然后在胶面上轻轻铺 1  高的蒸馏水 , c m 加蒸馏水 时通 常沿玻璃板慢慢 加人, 扰乱胶 面。垂 直放 勿 置胶板 于室温, h 1  左右使之凝聚
胶 面上 的蒸 馏 水 。 A.  制 备 浓 缩 胶 3

此 时在凝 胶和蒸馏水 之间可 以看 到很清 晰的一 条界面 。然后 倒掉

用量根据实际情况而定 ,      制备方法按表 A. 配方配制 。 1 按表 A 1      配方将胶液混合 , . 取少量灌人玻璃板间隙 中, 冲洗分离凝胶面 , 而后倒 出 将余下 的胶滩 注人玻璃板间隙 间 , 使胶 液液 面与玻 璃板 凹槽 处平 齐 , 而后 插 人“ 梳子 ” 样 品槽 模 板 )在室 温放 b ( , 2 mi-3 mn 0 n 0  。浓缩胶 即可凝聚 。凝 固后 , 慢取出“ i 慢 梳子”取时 应防止把胶孔弄 破, 出“ 子” , 取 梳 万 在形成 的胶孔 中加人蒸馏水 , 冲洗未凝 聚的丙烯酸胺 等, 倒出孔 中蒸馏水 , 加人 电极缓 冲液 。 再 将灌好胶的玻璃板垂直固定在 电泳槽上 ,      带凹槽 的玻璃板与 电泳 槽紧贴在一起 , 形成一 个贮液槽 向其 中加人 电极缓冲液 , 其与胶孔中的缓冲液相接触 。在 电泳槽下 端的贮液槽 中也加 人电极缓 冲液 使 表 A 1 D -A E凝胶 的配方                                  . S SP G  
贮存液          分离胶
1 n 8 i l 1 m1 8  4. m l 5  3 -I 5  1 . m L 1 5  0 1  L . m 0 0 打d 2 _

浓缩胶

3 %丙烯 酸胺母 液    。 分离胶缓      冲液 浓缩胶 缓冲液     
双蒸 水         

1%过硫酸胺( P )    0 AS
四甲基乙二胺( TEMED)

m I l .

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附    录



(   范 性 附 录 ) 规 毒 力效 价 的 测定

B 1 毒力效价的测定方法— .  B 11 试剂或材料 .  .

用小菜蛾( lt lx sea 作试虫的测定方法 Pue a  tl ) l 贝o l

标准品:S 95H.2 0 I/ g     - 9,3, 00  m , C1 n 0  U 小菜蛾幼虫:l ea o ea      Pu l xltl。 tl y sl
食用菜籽油。      酵母粉 :      工业用。 维 生素 C:      医用 , 分析纯。

琼脂:      凝胶强度大于 3 gc' 0 /m . 0 
磷 酸氢二钾 分析纯。      : 磷 酸二氢钾 分析纯 。      : 聚山梨醋-0粘度 35 04 /_55 00 /.      8: .X1- M S .  - m s I X1 3 菜 叶粉 :      甘蓝型油菜叶 ,0 烘干 , 80 C 磨碎, 8 过 0目筛。 蔗糖 :      分析纯。 纤维素粉 F1 ,      C -1 氢氧化钾 分析      : 纯。 氯化钠 :      分析纯。 1 %尼泊金 对      : 经基 苯甲酸甲醋 ( 5 化学纯) 于 9 %酒精 。 溶 5 1 %甲醛溶液 : (      0 甲醛 分析纯) 于蒸馏 水。 溶 干酪素溶液 干酪素( R生物试剂) g 加 。01  lL氢氧化钾 2  8       : B 2 , .0 m / o m L, mL蒸馏水 , 。 灭菌 磷酸缓冲液 抓化钠 85  酸氢二钾 60  酸二 氢钾 30 聚山梨醋-0      : . g磷 , . , g磷 . , g 8 溶液 。1  , mL 蒸馏水
1  0  0 mL, 0

B ,2 仪器 、 备 . 设 磨 口三角瓶 20       :5 mL具 塞。

分析天平:     精确到 。1 , . g m 电动搅      无级调速, 0  i 00  i 拌器: 1 r n 0 / -6  r n m 0 / , m
医用手术     刀。
振荡器。     

微 波炉或      电炉 。
水 浴锅。     

养虫管: MX .      C 25 . 9  c m 小烧杯: L      m . 5 0 
大烧杯 : 0      0 m 5 L. 试管 :8  X 0      mm  8 m 1 1 m, 玻璃珠 :      直径 5  mm, 移液管 : mL5 , mL I  .     0  , ml 2  , m. 1 ,  l B 13 测定步骤 .  .  B 131 感染液的配 制 . .  . 

GB T 96 .- 2 0 / 15 73 0 4 B. . . . 标 准 品 13 1 1

用分析天平准确称取标准 品 100  -100  ( 到 。 1  )放人 20       0 . g 5. g精确 m m .  , mg 5 ml装有 1 0粒玻璃 珠 的磨 口三角 瓶 中 加人 10  0 mL磷 酸缓 冲液 , 泡 1 mi, 浸 0 n 在振 荡器 上 振荡 3 n 得到 浓度 为 mi,

1  m 的标准品母液( m/ L g 该母液在 4 ℃冰箱中可 存放 1天) 0 。然后将标准品 母液稀释成浓度为 100 . , 0
0500200 15002 001  gml六个稀释感染液 。 .0 ,.5 ,. ,.  5 .3 3  / 2 6 , m
B.  . .  可 湿 性 粉 剂 样 品 13 12 . 

称取相 当于标 准品毒力效价 的样品适量 (      精确到 。2  )加 10  . g , 0 m m l磷 酸缓 冲液, 然后参照标准品 的配制方法配制样 品感染液 。 对有些效价过高或过低 的样 品,      在测定前需 先以 3个距离相差较 大的浓度做 预备试验 , 估计致 死中 浓度 (C。 的范 围, L5 值) 据此设计稀 释浓度。 B 132 感染饲 料的配制 . . .  饲料配方 维生素 C . ,      : O5 干酪素溶液 1 m 菜 叶粉 30 酵母粉 15  g 0  L, . g , . , g纤维素粉 10  . , 粉 g琼脂

20  . 蔗糖 60  g , . 菜籽油。2 , %甲 g , m 1 L 0 醛溶液05 , % . L1 尼泊金 10 , m 5 . L蒸馏水 10 。 m 0m 工
将 蔗糖 、      酵母粉、 干酪素溶液 、 琼脂粉加人 9 m 0  l的蒸馏水 中调匀 。搅拌 煮沸 , 琼脂完全溶化 , 使 加 人尼泊金搅匀 。将其他成分用剩余 的 1 mL蒸馏水调成糊状 。当琼脂冷却至 7 ℃左 右时与之充分 混 0  5 合, 搅匀 , 5℃水浴锅 中保 温备用。取 5 m 置 5 0  L烧杯 7 , 只 写好标 签, 5℃水浴 中预热 , 置 5 分别向每个烧 杯 中加 人 1  m L对应浓度的感 染液 , 以缓冲液作空 白对照 。向每个 烧杯 中加人 9  mL溶化 的感 染饲料 ‘ 用 电动搅拌器搅拌 2 s使每个烧杯中的感染液与饲料充 分混匀 。 0  ,

将烧杯静置,      待冷却凝固后, 用医用手术刀将感染饲料切成 1 X m的饲料块。每个浓度取 c 1  m  c
4 个饲料块分别放人 4支养虫管中, 每管放人一块, 写好标签 。 B 133 接虫感染 . . .  随机取 已放      置饲料的养虫管 。每管 投人 1 0头小菜蛾 三龄初 幼虫 , 每浓度 4管 , 塞上棉塞 , 好标 写 签, 在相同饲养条件下饲养 。 B 14 结果检查及计算 .  . 感染 4 h后检查试虫的死亡情 况。判断死虫 的标准是 以细签轻轻 触动虫体 ,      8  无任 何反 应者判 为
死亡 。

计算标准品和样 品各浓度 的供试 昆虫死亡率 , A bt表或计算 校正死亡率 ( , 。空 白对照 死      查 bot X) 亡率 1%以下需要校正 , 0 大于 1 %则试验结果无效。 0 校正死亡率按式 (.)      B 1计算 :

X一T 一 1 , -( 0 X  0
1 — t                了

(B. ) 1

式 中:     

1-      匕 一药剂处理死亡率 ; C      — 空 白对照死亡率 。 将感染液各浓度换算 成对数 值 ,      校正 死亡 率转换 成死 亡几 率值 , 最小 二乘 法分别 求 出标准 品 用 Ls C。 值和待测样品 L ; , C。 计算待测样品的毒力效价( 2 o 值 X) 毒力效价按式( .)      B 2计算 :
X SX 尸
Y   

( B. ) 2

式 中:

S — 尸 —
Y—

标准品 L , C。 值; 标准品效价 ;
样品 L 。 。 Cs值

GB T 9 6 .- 2 0 / 15 73 0 4 B . 允许差 .15

毒力测定法允许相对偏差 ,      但每个样品 3 次重复测定结果最大相对 偏差不得超过 2 0,毒力测 定 00 制剂各浓度所引起 的死亡率应在 1 0^9 %之 间, 5%死亡 率上下至少各有两个浓度。 00 0 在 0 B 2 毒 力效 价测定方法— .  B2 1 试剂 和材料 .. 以棉铃虫( l t s  iea 作试虫的测定方法 Heah amgr ) i i r

标准品:S1 5He2 0 I/ g      - 9, 3, 00  m , C 9 c 0  U 棉铃虫幼虫: eo ia g a       H lts  i r, ih r e m
黄豆粉 :      黄豆炒熟后磨 碎过 6 0目筛 。 大麦粉 : 0目筛 。      6 过 酵母粉 :      工业用。 3 %乙酸溶液 :      6 乙酸( 化学纯)溶于蒸馏水 。 , 苯 甲酸钠 分析纯。      : 甲醛 :      纯。 分析 维生素 C:      医用 , 分析纯 。

琼脂粉:      凝胶强 度大于30 m 0 gc ' /
磷酸缓冲液 同 .. ,      : B 11 B22 仪器 、 备 .  设

分析天平:     精确到。1 , . g m 电动搅拌器:      无级调速, 0  i 00  i 1 r n 0 / -6  r n m 0 / , m
微 波炉或电炉。     
振 荡器。      水浴 锅。     

组织 培养盘:4孔 。      2

搪瓷盘: mX 0       c 2 c 3 0  m,
磨 口三 角瓶:5 mL具 塞。      20  ,

大烧杯: 0 m     00 , 1  L
小烧杯 : ML     0  , 5 试管 :8  X  mm,     mm 10  1 8 玻璃珠 :      直径 5  m m, 注射器 : mi     0 . 5 ,
标本缸 。     

恒温培养箱      。 B 23 测定步 骤 .  . B2 31 饲料 准备 . .  .  饲料配方 酵母粉 1 g黄豆粉 2 g维 生素 C  5 苯 甲酸钠 。4 g3 %乙酸 3 9  蒸 馏水      : 2  , 4  , 1 g . , . 2  6 , .  L, m
3 00  l m ,

将黄豆粉 酵母      、 粉、 维生 素 C 苯 甲酸钠和 3 %乙酸放人大烧杯 内, 10  、 6 加 0 mL蒸馏水湿润备 用。将 余下 20  0 ml蒸馏水加人琼脂 粉内, 在微波炉上加热 至沸腾 , 使琼脂完全溶化 , 出冷却 至 70 与其他 取 0C, 成分混合 , 电动搅拌 器内高速搅拌 1 n迅速移至 6℃水浴锅 中加盖保温 。 在 mi, 0 B232 感染液 的配制 . .  . 

称 1 .  -100 (      g 5. g精确到。1 ) 0 0  0 m m . g可湿性粉剂样品, 盛有玻 m 至 璃珠的 磨口具塞三角瓶中, 加
磷酸缓 冲液 10  浸泡 1 mi, 0 mL, 0 n在振 荡器上振 荡 工mi n即成母液 。于分析天 平上称取 10 0  - 5.  mg
8   

GB T  5 73 2 0 / 1 6 .- 0 4 9

300  标准 品( 0.  mg 精确到 。 1  )如上法制成 母液 将样 品和标 准品母 液用 磷酸缓 冲液 以一定 的俗 .  , mg 数等比稀 释, 每个样品和标准品至少各稀释 5 个浓度 , 并设一缓 冲液作对照 , 每一浓度感染液吸取 3 , m1 至5 m 0  L小烧杯 内待用。对 照吸取 3  mL磷酸缓冲液 。 B 233 饲料和感染液的混合及分装 . .  .  用注射器      吸取 2 mL饲料 , 7  注入上述 已有样品或标准 品感 染液的烧杯 内, 以电动搅拌器 高速搅 拌 05 n迅速倒人组织培养盘上各小孔 中〔 .  , mi 倒人量不要求一致 , 以铺满孔底为准〕 。凝 固待用 。 B 234 接 虫感染 . .. 于 20-3℃室温下 , 经取食 的初孵 幼虫 (      0 6 C  将未 孵化后 1 2h内) 抖人直径 2 c 的标本缸中 , 待 0  m 静 数分钟 , 选取爬 上缸 口的健康 幼虫 作供试虫 , 毛笔轻轻地将 它们移 人 已有感染饲料 的组织盘的小孔 用 内, 每孔一头虫。每个 浓度 和空白对照皆放 4 头虫 , 塑料薄 片盖住 , 8 用 然后 将组织培养 盘逐个叠起 , 用 橡皮筋捆紧 , 竖立放 于 3℃恒温培养箱 内培养 7 h 0 2  . B2 4 结果检查和统计分析 .  .  用 肉眼或放大镜检查死 、      活虫数 。以细签触动虫体 , 完全无 反应 的为 死虫 , 算死亡率 计 如对 照有 死亡 , 可查 Abot bt校正值表 或按式 ( .  B 1计算 校正 死亡率 。对照 死亡 率在 6 ) %以 下不用校 正 .%一 6 1%之间需校正, 5 大于 1%则试验无效。将浓度换算成对数值 , 率或校正死亡率换 算成几率值 . 5 死亡 月 最小二乘法分别求出标准品和样品的 L , , C。 按式( .  值 B 2  ) 计算毒力效价 。 B25 允许差 .  . 毒 力测定方法的允许 相对偏差要求 与 B 15 同。      .. 相

B3 毒力效价测定方法 .  — 以甜菜夜蛾( dpe ei a作试虫的 即aota  u) rx g 测定方 法
B 3 1 材料和试剂 .  .  标准 品: -02H, 0  I m e      S20 , , 2 00 / g C 0 U

甜菜夜蛾幼虫:pdp r ei a      Sootaxg . e u
黄豆粉 :      黄豆炒熟后磨碎过 6 0目筛 。 酵母粉( 0目)工业用     0 2 : 维生素 C 医用 ,     : 分析纯 。 1%尼泊金 对      : 经基苯甲酸甲醋( 5 化学纯) 于 9 %酒精 。 溶 5

1%甲醛: 醛(     甲 分析纯) 蒸馏水。 0 溶于 琼脂:      凝胶强度大于30 m . 0 gc ' /
蒸馏 水 .      B32 仪器 .  . 

分析天平:     精确度 。1 . ?M g 电      无级调速, 0  i 00  i, 动搅拌器: 1 rmn 0 / -6  r n 0 / m
微波炉 或电炉。     
振荡器 。      水浴锅 。     

组织培养盘 2      :4孔。

搪瓷盘: m 0       c X c , 3 0  2 m
磨 口三角瓶 20  ,      :5 mL 具塞 。

大烧杯:00       0 m 。 1  1
小烧杯 : m     0  5 l 试管 :8      m 1 mX10  8 m m,

玻璃珠:      5  直径 m mo

G T  5 73 2 0 B/ 1 6 .- 0 4 9

注射器 : m     0  o 5 L
标 本缸。      恒 温培养      箱 。

B 33 测定步骤 .  .  B 33 1 饲料配方 . .  .  黄豆粉 3 (0目)酵母粉 1 g20目)琼脂 6g维 生素 C 2g1%尼泊 金 6 7  1%甲醛      g6 2  , 6  0 ( , , ,5 . m 0 L, 4  , 40 - mL 水 0 m . l 将黄 豆粉 酵母粉 、      、 维生素 C、 尼泊金和 1%甲醛放人 大烧 杯 中, 0 加人 10  5 mL水 , 混匀备 用。将余 下的 20  5 mL水加人琼脂 , 波炉上加热至沸腾 , 脂完全溶化 , 出冷 却至 70 在微 使琼 取 0 C。与其他 成分混 合, 在电动搅拌器 内高速搅拌 1 n 迅速移至 6 ℃水浴锅 中加盖保 温。 m , i 0 B 332 感染液的配制 . .  .  称取 C ,- 0 标准 品 100  ^300  (     , 02 S 2 e 5.  mg  0.  g精确 至 0 1  )置 于 20  - m . m , g 5 mL带有玻璃珠 的三角 瓶 中, 加人 10 、 酸缓 冲液 , 0 m 磷 1 浸泡 1 mi, 0 n在漩涡振 荡器上振荡 1 n后即为标 准品感染母 液。称 m i 取 100 mg  5.0  可 湿性粉剂样品 , 0.0  ^100 mg 置于 20  5 m L带有玻璃珠的三角瓶 中, 加人 10  0 mL磷酸 缓 冲液 , 浸泡 1 mn 在漩 涡振荡 器上振荡 1 n配制成样品感染母液。以两倍稀释法将标准品和样品 0  , i m i 母液稀释成一 定浓度梯 度, 每个样 品至少各稀释 5 个浓度梯度 , 每一浓度感染液吸取 3  mL至 5 m 0  L小 烧杯 中待用 。对照 吸取 3 - ml  磷酸缓 冲液 。 B 333 饲料和感染液的混合及分装 . .  .  用注射 器      吸取 2 m 7  L饲 料 , 人上 述 已有样 品或 标准 品感 染液 的 烧杯 内, 电动搅 拌 器搅 拌 注 以 05 n迅速倒入组织培养盘上各小孔 中( .  , mi 倒人量不要求一致 , 以铺满孔底为准 )凝 固待用 。 , B 334 接虫感染 . .  .  于 20-3 ℃室温下 ,      0 6 C 将未经取食的初孵幼虫( 孵化后 1 h内) 2 抖入直径 3 c 的标 本缸中 , 0  m 静待 数分钟选取爬 上缸 口的健 康幼虫作供试 虫, 用毛笔轻轻地将它们移人 已有感染饲料的组织盘的小孔 内, 每孔一头虫 。每个浓度 和空白对 照皆放 4 头虫 , 8 用塑料薄片盖住 , 然后将组织培养盘逐个叠起 , 用橡皮 筋捆紧 , 竖放于 2℃培养箱内培养 7 h 5 2  o B 34 结果检查和统计分析 .. 用 肉眼或放大镜检查死 、      活虫数 , 以细签触 动虫 体, 完全无反应的为死虫 , 死亡率 。如对 照有死 计算 亡, 可查 Abot bt校正值表或按式( .) ( 1计算校正死 亡率 。对照死 亡率在 6 B %以下不用 校正 ,%一10 6 50 之间需校正 , 大于 1%则试 验无效。将浓度换算成对数值 , 5 死亡率或校正 死亡率换算成几 率值, 用最小 二乘法或有统计功能 的计算 器, 分别求出标准品和样品的 L s 按式( .  Co , B 2  ) 计算毒 力效 价。
B 35 允许差 .  . 

毒力测定方法的允许相对偏差要求 与 B 15 同。      .. 相 B 4 对掺入其他 有效成分 的可疑样品的检测 .  对于某些符合正文 3 2分析指标的可疑样品 ,      .  可通过测 定样品 中胞 晶混合物 的毒力贡献率 , 判定 样品是否掺人其他有效成分 。 B4 1 可湿性粉荆 中不 同成 分的分离 .  .  用丙酮将可湿性粉剂稀释成 1 mg ml的溶液 ,℃下 5 0  n离心 1 mn保 留沉淀部分用      0  /  4 0 rmi 0 / 0  , i 等体积的丙酮悬浮 , 再进行 离心 , 共离心洗涤 3 , 次 保留沉淀组分 ; 用等体 积的蒸馏水悬 浮沉淀组分 , 离 心并保留沉淀组分 , 共进行 3次离心洗涤, 留沉淀组分 , 保 该沉淀组分即为可湿性粉剂中的胞晶混合物。 B42 毒力效价 的测定 .  .  按 B 1B 2     . 或 B 3的方法 , ., .  对单位质量可湿性粉剂及可湿性粉剂 的沉淀组分 ( 晶混合物) 胞 分别进 行毒力效价测定。
1    0

G T  5 73 2 0 B/ 1 6 .- 0 4 9

B 43 样 品中是 否掺入 其他 有效成分 的判 断 .  .  依据可湿性粉剂 中胞 晶混合 物 的毒力 贡献率 ( ,来判 断可 湿性粉 剂样 品中是 否掺人 其他 有效      X) 成分 : 毒力贡献率按式( .       B3计算 : )

X 一I 。 。 X。% :
式 中:

1               

( B. ) 3

I — 丁

单位质量 可湿性粉剂 中胞 晶混合物 的毒力效价 ; 单位质量可湿性粉剂 的毒力效价 。

若 湿 粉 中 晶 合 的 力 献 、 0 ,判 此 品 符 标 可 性 剂 胞 混 物 毒 贡 霸 于7 则 定 样 不 合 准。


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